细胞分离与培养技术.ppt

1,临床药理研究所,细胞分离与培养技术,2,现代生物技术,基因工程技术,细胞工程技术,酶工程技术,发酵工程技术,细胞培养,3,细胞分离技术,从血液、体液中分离细胞 从原代组织中分离细胞 从原培养容器中分离细胞 - 传代培养,原代培养,4,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,采血方法： 人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血； 小动物（大鼠、小鼠） 剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、断颈取血或股动脉放血。 兔 耳静脉或动脉穿刺取血。,5,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,血液抗凝方法： 肝素法：按每ml血液约用0.1-0.2mg肝素（即5%肝素溶液2-4µl）； 草酸盐法：取草酸钾0.2g，草酸铵0.3g，加双蒸水10ml溶解后，取0.2ml放入5ml的试管中，使其干燥。若采用5ml以下的血液可直接注入此试管中，轻轻摇晃； 枸橼酸钠法：先配制2%枸橼酸钠，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即可抗凝； EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/L EDTA 2µl。,6,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,体液标本采集： 在局部70%酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔（如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。,膝关节腔穿刺,胸腔穿刺,7,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,血样中红细胞和白细胞的分离： 利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。 抗凝血，室温或37下直立静置30-60min，红细胞沉降至下层，中间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血与3%明胶（经灭菌消毒）等量或3l量混合于离心管中，直立静置30-60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。,8,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,血中单个核细胞的分离： 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在1.050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。 淋巴细胞分离液,9,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,血中单核细胞的分离： 利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离,单个核细胞悬液,多将悬液放入12cm直径的培养皿中，于37培养箱中静置30-60min。此时单核细胞贴壁，而淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴壁细胞，并用Hanks液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下未贴壁细胞（淋巴细胞）。,用Hanks液强力冲洗吹打与震荡，将贴壁的单核细胞冲落或用刮刀轻刮，收集贴壁的单核细胞。,计数后分别制备所需浓度的细胞悬液。,10,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,黏附法分离血中单核细胞、T，B淋巴细胞,因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），所以可将其与T淋巴细胞分离。,11,具体步骤： 单个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）×107/ml的细胞悬液。 先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗平衡尼龙纤维柱，冲洗液尽量流净。 将尼龙柱预温37，再用配制的单个核细胞悬液2ml装入尼龙纤维柱，不使流出，37温箱内静置l小时。 取下注射针头，用预温37含20%小牛血清的RPM I-1640培养液冲洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的T淋巴细胞。 从注射器内取出尼龙纤维，在4的RPMI-1640液内漂洗，并轻轻挤压，将黏附的B细胞洗脱收集（B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将其分离）。 收集的T、B淋巴细胞可分别用Hanks液悬浮，洗涤，离心（250g，7min），并重复洗涤3次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制备所需浓度的T和B淋巴细胞悬液。,12,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,免疫磁珠法(MACS)分离T、B淋巴细胞： 磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。,13,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。 通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。,14,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞(CD34)、单核/巨噬细胞(CD14)、胰岛细胞(胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）) 、多种肿瘤细胞等。,15,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,16,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,17,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,18,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,MACS技术优点： 稳定、高质量的分选：纯度（90-99%） 对细胞无损伤 操作简便、快速：消毒方便，手动分选30分钟内完成，autoMACS分选2.5-10分钟之内完成。 从实验室到临床：MACS技术可以实现105-1011个细胞分选。有autoMACS和CliniMACS。 分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。 从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及mRNA。,MACS技术缺点： 分离效率较流式细胞仪分选略低 且耗材相对较贵，适合无大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选。 只适用于简单标记的细胞分离,19,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞： 密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1×107 /ml； 加适量FITC-抗CD3或FITC-抗CD19，4孵育30min, 用RPMI-1640培养基洗2次； 用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。,20,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,注意事项： 分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需要严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。 此法分离得到的T细胞纯度可达到99%,收获率可达到90%。 由于喷嘴孔很小（约70100m），分选前用3040m孔径的滤网过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴。,21,细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞,优缺点： 流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些 CD34+CD13-CD45dim的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞，流式分选成本比磁珠低。 流式分选最致命的缺点就是污染，且设备昂贵，技术复杂，需专业技术人员操作，操作费时，适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。,22,细胞分离技术,二、从原代组织中分离细胞 组织和器官采集： 人标本：可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。 大量的动物组织：先麻醉或处死，浸入70%酒精中，使毛皮全部浸湿，从腹中线剪开皮肤，注意不要剪开胸腔或腹腔。将皮肤向上、下撕开分离并向上、下翻开，暴露胸腹部的筋膜，用生理盐水洗净黏于筋膜上的断毛，以碘酒和70%酒精消毒后，更换一套消毒灭菌的器械，剪开胸腔或腹腔，无菌采取所需器官。 动物的骨髓：可以无菌手术采取一段股骨，用灭菌注射器，将小牛血清或培养液从断端一端加压注射以从另一断端出骨髓。,23,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,制备细胞悬液方法： 将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。包括胰蛋白酶、胶原酶和中性蛋白酶等。,24,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,1.胰蛋白酶 (Trypsin),在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块，重复清洗2到3次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成 1-2mm3小块。,将盛有组织碎片的容器置于冰上。加入0.25溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。,25,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,在4孵育6到18小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进去,移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37孵育包含残留 胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟,在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂,通过无菌不锈钢丝网（100-200目）过滤，计数和接种细胞，进行培养,26,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,2. 胶原酶 (Collagenase),用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次,加入胶原酶（50200单位/ml，溶解在HBSS中）,在37孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率,27,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,通过离心在HBSS中清洗悬液几次,再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养,通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶,28,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,3.中性蛋白酶(Dispase),用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次,加入Dispase（0.62.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）,在37孵育20分钟到几个小时。,29,细胞分离技术,通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase,通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次,再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养,30,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,举例（滑膜细胞的胶原酶胰蛋白酶消化分离法 ）:,无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等,用D-Hanks液（无Ca2+、Mg2+，含青霉素200kU·L-1、链霉素200mg·L-1）反复冲洗后剪成12mm3小块，离心洗涤2 次,置于加入2ml含10%胎牛血清、0.4%型胶原酶的DMEM培养液的培养瓶中，在37、5%CO2培养箱中消化2h，每隔10min吹打1 次。,31,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,再加入含0.25%胰蛋白酶的D-Hanks液4ml，培养消化30min,将培养液移至离心管中，1200rpm离心10min，弃上清,200目尼龙网纱过滤，1200 rpm离心10min，弃上清,将获得的细胞在37、5%CO2培养箱中培养24h，弃去未黏附细胞（如淋巴细胞，红细胞），此时的贴壁细胞即为原代滑膜细胞,32,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,4.组织块培养法 举例（成纤维样滑膜细胞组织块培养法）：,无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等，用不含钙镁的D-Hanks液（含青霉素200kU·L-1、链霉素200mg·L-1）反复冲洗后剪成12mm3小块,用吸管吸取均匀排列于培养瓶（预先用含20胎牛血清DMEM培养液湿润）的底壁，瓶底朝上，37、5%CO2培养箱中培养3h，使其贴壁,33,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,待细胞快长满时用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代培养， 取第35代细胞用于实验,观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块，继续培养,轻轻翻转培养瓶，使培养液刚刚覆盖组织块，每隔23天换一次培养液,34,成纤维样滑膜细胞组织块培养法,培养24h,培养96h,培养120h,35,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,举例（初步淋巴细胞分离法）：,放血处死动物，无菌取胸腺和脾组织，去除脂肪和结缔组织，放入盛有含5%小牛血清的D-Hanks液（不含钙镁，含青霉素200kU·L-1、链霉素200mg·L-1）平皿的网纱中（200目）,用注射器针芯轻轻碾碎胸腺和脾组织，使单个细胞经网进入溶液中,溶液移入离心管中， 1200 rpm离心10min，弃上清， D-Hanks液洗涤细胞，加入DMEM培养液计数和调节细胞浓度，进行培养,36,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,举例（乳鼠原代心肌细胞培养法）： 基本原理： 心肌细胞培养方法有离体心脏灌注法、酶消化法和组织块法，将心肌组织分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结构与功能特性。,37,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,评价： 离体心脏灌注法对乳大鼠来说实施难度大; 酶消化法操作流程长，细胞对消化酶浓度及作用时间要求严格，但是能得到大量单细胞； 组织块法操作简单，实验成本低，可得到具较高纯度的心肌细胞。 因此，心肌细胞原代培养常用的方法多用酶消化法和组织块法两种。,38,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,心肌细胞的酶消化培养法： 1.心肌组织的选择： 生后14天的Wistar乳鼠心脏等。 2.心肌组织块的制备： 乳鼠用75%乙醇/1%新洁尔灭消毒皮肤，无菌开胸，暴露心脏，于心脏收缩期剪下心脏，置于盛D-Hanks 液的培养皿中，剪开心脏，清洗三次，以去除血污。,39,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,3.心肌细胞悬液的制备： 取心尖部组织（心室）剪为1mm3碎块，在大离心管中放入组织碎块，加入0.06% 0.25%的胰蛋白酶溶液815ml，在磁力搅拌器上，37水浴消化10min，自然沉淀后弃上清。剩余组织块中再加入新胰蛋白酶， 消化10min，静置后将上清液移入盛有15%新生牛血清培养液的离心管中终止消化，并以1000rpm离心10min，弃上清，用培养液充分吹打成单细胞悬液。剩余沉淀用同样条件及方法反复消化，直至将组织基本完全消化为止，分次收获心肌细胞。,40,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,4.心肌细胞悬液的接种： 将分次收获的心肌细胞用Hanks 液离心清洗12 次，弃上清液。将沉淀细胞定量加入培养基35 mL，吹打混匀，制成细胞悬液。应用白细胞计数板计数细胞，调整至所需浓度，37 、5 % CO2 培养箱培养。 5.细胞纯化： 培养2 h，将细胞悬液进行换瓶培养，去除瓶底的贴壁细胞；2 h 后，去除瓶底的贴壁细胞，重复一次，方法同前，以去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。,41,细胞分离技术-从原代组织中分离细胞,心肌细胞的贴块培养法： 1.取材：按前述方法取出心脏，置于盛Hanks 液的培养皿中，清洗三次。 2.贴块：将心脏剪为1mm3大小的小块，移入培养瓶底面，用无菌牙科探针将其均匀铺开。 3.干固：盖上瓶盖，37 烤箱培养瓶翻转干固11.5 h。 4.接种培养：添加少量培养基，以恰好盖住组织块为佳，次日加足培养液。,42,43,细胞分离技术,三、从原培养容器中分离细胞（传代培养） 贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。,44,细胞分离技术-传代培养,对于贴壁不太紧的细胞如人胚胎肾（HEK）293细胞等，可以直接吹散后分瓶; 对于贴壁较紧的细胞如中华仓鼠卵巢（CHO）细胞、滑膜细胞（Synoviocytes）等，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶（以下操作均按无菌操作的要求进行）：,45,细胞分离技术-传代培养,将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去,加入0.25胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润,一般消化时间约为1-3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化 ，也可以在显微镜下观察细胞是否变圆,视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例,46,细胞分离技术-传代培养,胰酶消化的程度是一个关键： 消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。,47,细胞分离技术-传代培养,影响消化速度的因素： 主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。消化程度以轻吹或加培养液后轻摇可下为好。下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考（以CHO细胞为例）。,48,复苏后细胞,培养24h,培养48h,刚加胰酶,开始皱缩,明显皱缩,基本变圆,完全变圆,49,细胞培养技术,细胞培养的基本概念 体内、外细胞的差异和分化 细胞培养的一般过程 细胞培养的无菌环境 常用培养器皿及清洗消毒 培养物的污染及防止 细胞培养常用营养液和试剂的配制 细胞库,50,细胞培养技术,一、细胞培养的基本概念 体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。,51,细胞培养技术-基本概念,组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。,52,细胞培养技术-体内、外细胞的差异和分化,二、体内、外细胞的差异和分化 差异： 细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化： 分化现象减弱； 形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡； 发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。 因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。,53,细胞培养技术,分化： 体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。,54,细胞培养技术,三、细胞培养的一般过程 准备工作： 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。内容包括器皿的清洗、干燥与消毒、培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌、无菌室或超净台的清洁与消毒、培养箱及其他仪器的检查与调试。,55,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,取材： 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。,56,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。 取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。,57,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,培养： 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。,58,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。 原代培养一般有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。,59,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。,60,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,细胞系（Cell Line）：原代培养物经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。 细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。,61,62,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,每代贴附生长细胞的生长过程： 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）,63,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,冻存及复苏: 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存，这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(-70-196)的特点。,64,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,细胞深低温保存的基本原理： 在-70以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过020阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。,65,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,细胞深低温保存的基本方法： 将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。,66,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,悬浮细胞的保存: 计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞； 以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基（DMSO终浓度为5-10%）中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×107在无血清冷冻培养基中，再次悬浮细胞； 分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤；,67,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,传统方法： 程序降温：可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70到-90的冰箱中，细胞以-1/分钟进行冷冻，然后转移到液氮中贮存。,冻存管置于4 10分钟,-20 30分钟,-80 16-18小时,液氮罐长期储存,68,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,贴壁细胞的保存: 使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小； 在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数； 以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞； 以5×106到1×106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞； 分装进冻存管，按前述步骤冻存。,69,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,冻存细胞的复苏: 冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。,70,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,直接铺板法: 取出贮存细胞，37水浴中快速融化； 直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用1020ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml； 培养细胞1224小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。,71,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,离心法: 取出贮存细胞，37水浴中快速融化； 把1-2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀； 以大约1000rpm离心2-3分钟，弃去上清 ； 在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数； 细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。,72,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。,73,细胞培养技术-细胞培养的一般过程,常用仪器设备: 无菌室 培养器具 无菌过滤器 超净工作台 CO2培养箱 洗刷装置 三重纯水蒸馏器 恒温水浴锅 细胞计数板 抽气泵 倒置显微镜 电子细胞技术仪 压力蒸气消毒器 离心机 电热恒温培养箱,74,细胞培养技术,四 细胞培养的无菌环境 1、无菌室 无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（12小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。,75,细胞培养技术-细胞培养的无菌环境,此外，还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，使外界空气直接对流进无菌室的操作间等。,76,细胞培养技术-细胞培养的无菌环境,2、超净工作台 工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。,77,细胞培养技术-细胞培养的无菌环境,超净台的使用与保养： 超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜， 过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射1030分钟，然后让超净台预工作1015分钟，以除去臭氧和保证使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌（不能用酒精擦拭有机玻璃板）。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。,78,细胞培养技术,五 常用培养器皿及清洗消毒 细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。,79,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,1.清洗 离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求. 玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤。,80,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,浸泡: 新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。,81,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,刷洗: 将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。,82,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,浸酸: 浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。放取器皿要小心。,83,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,冲洗: 刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗23次，晾干或烘干后包装备用。,84,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,橡胶制品清洗: 新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50烤干备用。,85,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,塑料制品的清洗: 塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（1520遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。,86,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,包装: 对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。,87,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,2.消毒和灭菌 微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因,mycoplasma,eumycete,coccobacteria,88,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,物理消毒法: （1）紫外线消毒 紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。,89,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2米的30W灯可照射9平方米房间，每天照射23小时，期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。 紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。,90,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,（2）高温湿热灭菌 压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。,91,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。,92,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,（3）高温干热消毒 干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160以上，并保持90120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。,93,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。 烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。,94,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,（4）过滤除菌 是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。,95,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,化学消毒法： 新洁而灭，其0.1水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。,96,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,抗生素消毒法： 抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。,97,细胞培养技术-常用培养器皿及清洗消毒,可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。,98,细胞培养技术,六 培养物的污染及防止 按现代的观念，凡是混入培养环境中对细胞生存产生有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染。根据这一概念，组织培养污染物应包括生物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分）、细胞（非同种的其他细胞）。,99,细胞培养技术-培养物的污染及防止,污染途径： 污染物，特别是微生物常通过下列途径进入培养体系，造成污染 空气 器材 操作 血清 组织样本,100,细胞培养技术-培养物的污染及防止,污染对培养细胞的影响及污染的检测： 由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复、但是当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分裂象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，细胞浆出现颗粒；污染较严重时，细胞增殖停止，分裂象消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。,101,细胞培养技术-培养物的污染及防止,1.细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测 常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。,102,细胞培养技术-培养物的污染及防止,如果培养物受细菌污染，24小时内可以获得阳性结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20分钟一代，会使培养系统中很快产生大量细菌，后者不仅可以消耗培养系统中的养分，还能释放大量代谢产物。几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。细菌污染大多数可以改变培养液pH，使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗