细胞培养概述2006级研.ppt

细胞培养总论,刘 梅 南通大学神经再生重点实验室与神经科学系 liumeintu.edu.cn,一、细胞培养的基本条件,无菌/灭菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器， 洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯， 电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶， CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器， 高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐 实验室安全： 生物实验室安全，P1, P2, P3 实验室安全,净化工作室,细胞培养室,风淋室 风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋口方向可调，风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。,传递窗 该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与洁净区，洁净区与非洁净区之间小件物品的传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。,高效过滤器 高效过滤器是用超细玻璃纤维纸作滤料，胶板纸作分隔板，可与铝合金框、木框及镀锌钢板框组合而成。 特点：具有低阻高效、轻质、容尘量大等特点，层高的要求，缩小净化设备静压箱体积等优点。 适用于常温常压常湿条件下环境空气的净化，尤其适用于需要高效空气过滤器覆盖率高的净化厂房。,洁净层流罩,层流罩是可提供局部高洁净环境的空气净化设备。它主要由箱体、风机。初效空气过滤器、高效空气过滤器、阻尼层、灯具等组成，外壳为不锈钢或彩钢板。 洁净层流罩是将空气经风机以一定的风压通过高效空气过滤器后，由阻尼层均压，使洁净空气呈垂直层流型气流送入工作区，从而保证了工作区内达到工艺所需的高洁净度。,技术性能参数： (1)净化等级：100级(美国联邦标准209E) (2)平均风速：0.250.45m/s(可调) (3)噪音：62dB(A),超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,生物安全柜的选择,一种既能使操作造成无菌、无尘的局部空气环境，保证检验、检测不受污染，又能保证被研究的对象（如病菌、细菌等）不外溢，保护周围环境及操作人员的安全隔离设备。 该设备可广泛应用于低、中等危险度（病原体1-3，DNA重组P1-P3）的临床细菌学，病毒学、微生物学、组织培养、生物学及生命科学的研究，加工、检验部门。,II级A型生物安全柜,100 fpm 吸风量 70%气体循环使用 . 30%气体排出，既可以接管道外排，也可以不接管道直接排放在实验室,A2型生物安全柜,“全排” 100 fpm吸气量 0% 气体循环利用. 100% 气体外排，适用于P3实验室,B2 型生物安全柜,紫外灯,主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,紫外线消毒。,干热消毒（160 ，2小时）,主要用于玻璃器皿消毒,电热干燥箱,滤 器,大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。,Zeiss滤器(过滤除菌)：,大容量高压灭菌器,全自动手提式灭菌器,湿热灭菌装置,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,细胞培养用水装置,培养板与培养瓶,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ，100%湿度，5CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时， 需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。 定期消毒（90 ，14 h)。 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水 以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,移液器,培养细胞的观察,正置显微镜,酶标仪 微孔板震荡器,高速离心机,超速离心机,液氮罐,实验室安全,层流净化细胞培养室管理规则 一级生物安全防护实验室 二级生物安全防护实验室 三级生物安全防护实验室 四级生物安全防护实验室,层流净化细胞培养室管理规则 重点实验室层流净化细胞培养室设计标准为万级，专供细胞培养、冻存以及细胞治疗用。层流净化细胞培养室的总体要求：经济、有序、高效、安全。初步制定相关制度如下：,必须取得实验室相关实验技能考试合格方可进入层流净化室； 在本室工作的实验人员应严格遵守本室工作守则，外来人员在进入净化室工作之前，必须接受培训； 没有经过培训的人员不得单独进入净化室工作； 进入净化室后要保持安静，不得大声喧哗。,1.准入制度,2.安全制度 层流净化室内必须注意安全用电； 谨慎使用酒精灯，不能在有明火的情况下加、换酒精； 实验人员自觉维护室内设备的安全使用，对室内的仪器如CO2孵箱等要经常注意机器运转情况，发现问题及时检修或报告请人检修； 离开层流净化室必须断开必要的仪器电源； 对不符合层流净化室安全规定的行为主动报告主管老师。,3.卫生消毒制度 一般情况下细胞间每日消毒一次（包括缓冲间），方法为紫外线消毒（每次30分钟至1小时）一次，另外每周用10乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟； 实验完毕应及时清理所用物品，注意台面整洁； 及时清洗所用隔离衣，并高压灭菌后存放于指定位置； 除实验必须的用品外，其它物品不得带入净化室； 层流净化室内所用仪器及附属设备均应在指定范围内使用，不得随意转移地点，以便他人顺利使用； 层流净化室实施值日生负责制，值班人员负责检查室内是否保持清洁整齐，督促违反规定者改正错误。,4.出入制度 层流净化细胞培养室共有两个缓冲间，进入每个缓冲间必须更换指定消毒的拖鞋； 穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行离开层流净化室； 人员流动：原则为进出净化室应按次序开、关门，只有将前面打开的门关闭后才允许打开下一个门，出入线路绝对不能逆行，使缓冲间起到应有的作用。 物品流动：所有进出层流净化细胞培养室的物品均应通过传递窗进行；物品进入层流净化细胞培养室时，应先打开传递窗外侧门，将物品放入传递窗，关闭传递窗外侧门，打开紫外灯照射15分钟；人员进入层流净化细胞培养室后，关闭紫外灯，打开传递窗内侧门，取出物品；物品出室次序与以上进室次序相反，但不需紫外线照射。,二、培养细胞的生长条件,细胞的营养需要 细胞的生存环境 渗透压: 温度: 37，O2 CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.27.4 无污染 无毒,细胞培养常用器材处理方法,体外培养细胞使用的器材品种较多。离体细胞对各种毒物都很敏感，所用器材的清洗、消毒处理是培养能否成功的关键之一。,清洁液的配制,一、玻璃器材（各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管 等） 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、清洁液处理（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干包装杀菌。一般用121磅高压蒸气灭菌20分钟。 二、塑料器材（多孔培养板、培养皿、培养瓶及吸嘴 等） 塑料器皿若反复使用：使用后，先用自来水浸泡冲洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，双蒸水冲洗，晾干。采用紫外线直接照射或辐照灭菌办法。清洗时要防止产生划痕。 三、橡皮器材 选择质软、耐高温、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品) 。新购置的自来水冲洗去，5%氢氧化钠煮沸15分钟，自来水冲洗，4%盐酸煮沸15分钟，自来水冲洗，单蒸水冲洗，双蒸水(或去离子水)冲洗，晾干后包装或置于铝盒内，用121高压蒸气灭菌20分钟。,四、金属器材（解剖器械，剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头等） 新的金属器材，先用纸擦去表面的油脂，再用洗衣粉煮沸，水洗，擦干后再用95%酒精纱布擦干，包装或置铝盒内于121高压蒸气灭菌20分钟。已用过的金属器材，及时用酒精棉球擦干净，灭菌。 五、其他物品 纱布、注射器的针头等； 各种人工合成培养液、缓冲液和酶 等、过滤除菌。 消毒灭菌前所用的包装材料可用牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒和特制玻璃（或金属）消毒筒等，可根据器材大小、形态选用，采取局部包装或部分包装，并用线绳扎紧。,水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)又称生理盐水或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。 配液时注意：（1）用水；配制先后顺序；称量，要看清药品的规格、纯度、结晶水的数量等。（2）物质的纯度，常用的纯度有优级纯(特级纯)，分析纯（AR）和化学纯（CD）三种。（3）物质的可溶性，避免沉淀析出。（4）物质的稳定性，如葡萄糖只能在10磅下维持1520分钟。（5）贮存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前临时混合和稀释，过滤除菌备用。 常用的缓冲液：生理盐水、PB、PBS(注意有无钙镁离子)、 Hanks液（含有钙镁离子、葡萄糖、酚红）,细胞培养用液的配制,pH调节液 (1) 碳酸氢钠液 可根据需要与使用方便配制10%以下的各种浓度。先用双蒸水溶解后，需经过滤除菌，分装小瓶中。亦可使用高压蒸气灭菌，密封，4冰箱保存。市售有5%10%浓度的安瓿封装品，使用也很方便。在调节pH过程中或超过要求值时，可用高压灭菌的10%醋酸溶液或以CO2调节。 (2) Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂。通常使用浓度为1015mmol/L。配制时，称取所需的Hepes量，用培养液溶解，用1mmol/LNaOH调节pH至7.0，过滤除菌分装小瓶中，4冰箱保存。,消化液 胰蛋白酶溶液 一种黄白色粉末，易受潮，应密封放置阴暗干燥处。它的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来。常用浓度为0.25%或0.5%胰蛋白酶。 EDTA(乙烯二胺与乙酸或Versene)溶液 EDTA是一种化学螯合剂，毒性小，对贴壁细胞有离散作用。一般使用浓度为0.02%。 称0.1g 溶解于500ml无钙镁离子磷酸缓冲液中，15磅30分钟高压灭菌，4或室温保存。 胰蛋白酶EDTA溶液 0.5%胰蛋白酶液96mL，1%EDTA液4ml，无钙镁离子缓冲液100ml。,抗生素溶液 为防止细胞培养过程中发生污染，一般在培养液中加入青霉素钠盐和硫酸链霉素，其浓度分别为每毫升含100U和100g 。 配制时取青霉素1×106和链霉素1×106g，溶于100ml Hanks或PBS中，使其含量为青霉素1×104U/ml，链霉素1×104g/ml，使用时每100ml培养液中加入0.51ml。,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好。 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）； 多种金属离子； 激素；各种生长因子； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等； 胰酶抑制因子； 转移蛋白； 不明成分。,血 清,一般说来，含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10血清。 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。,血清的作用,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。但是向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。,无血清培养基,血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌。,血清的使用,在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位-方便、广谱、稳定。,抗菌素的使用,基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青霉素 100单位/毫升 链霉素 100微克/毫升,完全培养基的组成,合成培养基（粉） 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青霉素 100单位毫升 链霉素 100微克毫升 加三蒸水 至1000ml 过滤除菌，调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10）。,培养基的配制,三、细胞培养的基本操作技术,体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。,消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant) 灭菌(sterilization) 防腐(antisepsis)和防腐剂 抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic) 无菌(asepsis) 无菌技术/无菌操作(antiseptic technique),Terms to remember,在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。,【培养前准备】,无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(拖布专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,【操作野消毒】,原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。,【洗手和着装】,在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 培养瓶 滴管、试管、吸管 接种环、接种针,【火焰消毒】,进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。,【操作】,【培养细胞的观察】,肉眼观察培养物颜色及混浊度 倒置显微镜观察细胞生长状态,【细胞培养的污染和检测】,细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。 严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。,肉眼直接观察法、培养检查法、显微镜观察法,1. 细菌和真菌的污染和检测,2.支原体的污染和检测,造成支原体高污染率的原因有多种 支原体大小0.10.8 m，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 m ）； 支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 ； 过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式； 细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染； 研究或操作人员忽略污染问题； 已受污染的细胞、培养基、血清 等。,相差显微镜观察法 Hayflick培养基直接培养法 DNA荧光染色法 PCR方法 特异引物扩增支原体 DNA,支原体的检测,支原体污染后的抗生素处理: 第一种方法：使用泰乐菌素（tylosin，Sigma)，泰乐菌素是一种兽用抗生素,常用在鸡、猪的食料辅料，可以防止支原体感染引起的支气管哮喘，至今尚未见有耐药菌株，是治疗支原体感染的特效药。 第二种方法：M-Plasmocin, InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。 第三种方法：用BM-Cyclin-1/2，效果很好，方法如下：细胞传代同时加BM-Cyclin-1 10g/ml，37培养3天，加入BM-Cyclin-2 5 g/ml，37培养3天；（不需传代，因为支原体污染的细胞生长非常慢！）如果细胞生长恢复正常，即可结束。否则加BM-Cyclin-1 20 g/ml，37培养3天，加入BM-Cyclin-2 10 g/ml，37培养3天。怀疑是支原体污染的就可以试试，对细胞不会有太大影响。,3. 病毒的污染和检测,细胞的直接观察 动物接种检查 电子显微镜观察 免疫学检查 PCR技术,常用抗生素用量和效应,抗生素,抗菌谱,细菌 真菌 支原体 常用浓度,青霉素 G+ 100IU/ml 链霉素 G- 100g/ml 庆大霉素 G+,G- 200g/ml 四环素 G+,G- 10g/ml 卡那霉素 G+,G- 50g/ml 两性霉素 2 g/ml 制霉菌素 25 g/ml,四、培养细胞的生物学特征,（一）体外培养细胞的分型,1. 贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：,成纤维细胞 上皮型细胞 游走细胞型 多型细胞型,2. 悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。,胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。,成纤维细胞型：,1.贴附型,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如： 真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞， 血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则 三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起， 中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独 的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,上皮型细胞：,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆 形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状 生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。,2. 悬浮型,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 易于收获，可获得稳定状态 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),Hepatocytes,（二）培养细胞的生长和增殖过程,1. 培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells） 指细胞在整个离体培养过程中持续增殖和生长的时间，分为：原代培养期、传代期和衰退期。 2. 组织培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。 如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增( Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。,也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。,原代培养（Primary Culture）期,初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系（Cell line）.在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）.为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。,传代期,此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。,衰退期,组织培养细胞一代生存期,细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段： 潜伏期（Latent Phase）; 指数增生期（Logarithmic growth Phase）; 停滞期（Stagnate Phase）.,细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。,1潜伏期（Latent Phase）,初代培养细胞贴附慢，可长达1024小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，1030分钟即可贴附。 细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面（如 CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。,操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤 接种细胞: 适应，恢复，积累(代谢中间产物) 组织块: 细胞迁移出 一般经数小时-几天,潜伏期存在的原因,游离: 悬浮,胞质回缩, 全部细胞变为圆球形; 吸附: 贴附底物,一般24小时内贴壁; 潜伏期: 可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相.,细胞贴壁过程,细胞密度：接种的细胞密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长。 细胞类型：传代培养的细胞潜伏期比原代培养的细胞短。传代培养期的细胞,一般为624h;原代2496h或更长。单个细胞快,细胞大团慢,组织块慢。连续细胞系与发生恶性转化的细胞(6-24h)比有限细胞系与正常二倍体细胞的短。 来源：胚胎组织:短,2天可见细胞生长；成体组织:长。 细胞机能状态：不良者慢。 培养条件：培养液, pH, 底物等，不利：污染,有毒； 慢。,滞留时间的长短与：细胞种类、接种的细胞密度、培养条件等因素有关。,初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。,这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。 特点：细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段；培养物中细胞数量呈指数增长，细胞群体均一，是理想的实验用细胞。,2指数增生期（Logarithmic growth Phase）,在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。 细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。,有丝分裂指数(MI) : 指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。 一般细胞的MI约为0.1 0.5%；原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3% 5%。 细胞群体倍增时间: 培养物种中细胞数量翻倍的平均时间 MTT法: 反映细胞内线粒体中一种酶活性程度 标记核苷酸(3H-TdR)掺入量：反映DNA合成,判断细胞生长的指标： 指数生长期内细胞分裂活动的程度(增殖活性)可作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标。,细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。,3停滞期（Stagnate Phase）,体外培养细胞的种类,（一）初代培养 又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。 （二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。,（三）细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）。 （四）二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75或80以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有810代，人胚神经胶质细胞1530代。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或25代即大量冻存作为原种（Stock Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。,（五）遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。,（六）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞系或细胞株的命名,HeLa： 为供体患者的姓名（来源于宫颈癌） CHO： 中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary） 宫-743： 宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3：美国国立卫生研究院（NIH）建立； 每3天传代，每次接种3×105细胞毫升。,细胞系或株的鉴定、管理和使用,培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、 供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等； 冻 存 液：培养基和防冻液名称； 细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性； 培 养 液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量； 细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性 核 型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无 无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等 物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH， 以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测 免疫检测：一两种血清学检测 细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名,ATCC入库细胞要求检测项目,同时附有照片（高低密度；高低放大倍数）,The End,