第七章微生物遗传变异与育种.ppt

Chap.7 微生物遗传变异和育种,微生物遗传学研究意义 1） 微生物学的主要分支 2）为生命遗传现象的解释提供依据 3）是分子生物学发展的基础学科 4）促进工业微生物菌种的选育,§.1 遗传变异的物质基础,一、证明遗传物质的三个典型实验,-细菌转化实验 -噬菌体感染实验 -植物病毒的重建实验,1、细菌转化实验 - 动物试验 (Grifith,1928),-细菌培养实验 S（死）+R（活） S（ 少量活） +R（活） S（无细胞提取液）+R（活） S（ 少量活） +R（活）,-细菌培养试验（Avery，1944）,(DNA是遗传物质的第一个证明者),2噬菌体感染实验 (Hershey;Chase,1952),3植物病毒的重建实验 (Fraenkel-Conrat,1956),二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,（一）真核与原核微生物遗传物质比较,原核与真核微生物基因组大小,细菌染色体数目与形状,细菌染色体结构,真核微生物染色体结构 (示核小体）,真核生物基因结构 (仅外显子有编码功能),真核微生物基因表达控制,（二）原核生物的质粒,质粒： 游离于染色体外， 独立复制的dsDNA分子。 (环状、共价、闭合?),质粒的特点 1）大小： 大质粒： 60kb、1/cell 小质粒： 10-20/cell,2）自主复制能力：型复制、滚环复制,数量控制：严紧型 ；松弛型,3）转移性：,Tra区基因：,附加体：某些质粒既可整合进宿主染色体，又可与染色体脱离，称之。,4）质粒的消除：,-理化因子 -原生质体诱导法,5）不相容性： 两种亲缘关系相近的质粒不能稳定地存在于同一个细胞中。,（G-菌的部分不相容群）,质粒的遗传表型 1） F质粒（致育因子） Tra基因：编码转移相关蛋白；合成性纤毛,2）R质粒（抗药因子） -RTF基因（抗性转移因子） -抗性决定子 （抗抗生素、抗药、抗重金属）,3）Col质粒（大肠杆菌素因子） -产大肠杆菌素 细菌素：由细菌质粒编码产生的只能 抑制或杀灭近缘细菌或同种 不同菌株的蛋白质。 Col质粒类型： 非接合型(colE 1)：松弛型 接合型( col Ib)：严紧型,4）Ti质粒：合成冠瘿碱、大型质粒 5）Ri质粒：产生根毛、大型质粒,7）降解质粒：降解、接合,8）致病性质粒： 溶血素、肠毒素（S.aureus） 9）共生固氮质粒： 结瘤基因（nod） 固氮基因（nif） 10）隐蔽质粒： - 未有明确表型,工程质粒-pBR322 主要特点： 1）分子量小 2）稳定、松弛型复制 3）可大量扩增 4）容易分离 5）可携带小于10kb外源DNA 6）带有2个选择标记 ; 7）多个单一酶切位点 8）容易转化,利用选择标记鉴别携带外源片段的转化子 (双抗菌素对照筛选）,建议读物,§.2 基因突变和诱变育种 一、基因突变 野生型菌株：从自然界分离获得的菌株， 称之为 。 基本培养基(MM)：满足野生型菌株生长最 低营养要求的合成培养基。,（一）突变类型 营养缺陷型：野生型菌株由于突变而丧失 了某种营养合成能力，而无法在基本培 养基上生长的变异类型。 表示： 基 因：his+，his - ； 表 型：His + ，His 完全培养基：满足各种营缺型菌株生长营养要求的天 然或半组合培养基。,抗性突变型： 野生型菌株由于突变而产了对某些化学药物或致死物理因子抗性变异类型。 表示： 基 因： strr、strs； tetr、tets； 表 型：Str r ， Str s,条件致死突变型： 某些菌株或病毒经基因突变后，在某种条件可生长并实现表型，而在另一条件却无法生长繁殖的突变类型。 (如温度敏感突变株：Ts） 形态突变株 抗原突变株 产量突变株,突变株类型划分： -选择性突变株：营养缺陷型、抗性 突变型、条件致死突变型 -非选择突变株：形态、抗原、产量 突变型,（二）突变率及其捡出 突变率： 某一细胞在每一世代中发生突变的几率。常用单位群体中每一世代产生的突变株的数目来表示。,突变株的捡出及突变率的计算,1) 捡出方法： 营养缺陷型; 抗药性突变 等选择性突变类型 2) 突变率测定 突变菌数/总菌数,（三）基因突变的自发性与不对称性 突变的自发性：基因可自发产生突变。 （辐射、自身有害物质、碱基配对错误） 突变的不对应性：突变性状与引起突变 的环境因素无直接对应关系。,平板影印培养试验 (Lederberg),（四）基因突变及其机制 1、诱发突变 (点突变, 畸变) 1)点突变 (1)碱基置换 -转换 -颠换,可能的突变型： 错义突变 无义突变 同义突变,相关的诱变剂 直接引起置换： 亚硝酸、亚硝基胍、羟胺、烷化剂 间接引起置换： 碱基类似物 （5BU, 5-AU),2）移码突变 DNA序列中插入或缺失少数核苷酸，从而使该处后面遗传密码的阅读框架发生改变的突变。,2）染色体畸变 DNA分子的大段损伤，包括缺失、重复、 插入、易位（转座）和倒拉等。,转座：DNA分子通过非同源重组方式， 从染色体的某一部位转移到另一部位的 现象。,转座因子 凡具有转座作用的DNA序列均称之。 特点： -转座作用 -末端重复序列 -转座酶基因,转座因子类型,插入序列 细菌转座子 (Tn,转座子)包括复合转座子和复杂转座子） 转座噬菌体,a）插入序列 (IS) b） 转座子(Tn),转座机理,转座子的遗传效应和生物学意义,（复制型转座）,遗传效应 1）插入突变 2）DNA重排 意义： 进化，获得突变株，抗药性 鉴定必须基因,（五）紫外线对DNA的损伤及其修复,1损伤的机理： 形成胸腺嘧啶二聚体 2、修复作用 1）光复活作用 光解酶-二聚体复合物为光激活,2.暗修复作用：,3、重组修复 4、SOS修复,二、 突变与育种 （一）自发突变与育种(定向培育） （二）诱变育种,1、基本原则（应考虑的问题） 1） 诱变剂的选择 (有效性,安全性，简便性),诱变剂诱变效果测定（利用回复突变测定） 艾姆氏试验(检测三致物质）,2）出发菌株 3）诱变菌株的状态 -处理单胞（孢）悬液 -选择单倍体或单核细胞 4）剂量：低剂量； (表示方法;剂量存活曲线) 5）提高检出效率 -利用形态特征 -鉴别培养基,利用鉴别培养基检出突变株 -蛋白酶高活性菌株的检出 （酪蛋白为N源，加HgCl2观察透明圈） -淀粉酶高活性菌株的检出 （淀粉为C源，加I2液观察透明圈） -有机酸高产菌株的检出 （培养基加CaCO3观察透明圈）,6）设计高效的 筛选方案 初筛（定性） 复筛（质量、定量） 7）创新性的筛选方法,抗菌活性的高通量筛选,2、营缺型的筛选 （1）三种基本培养基 基本培养基- :满足野生型菌株生长 最低营养要求的组合培养基。 完全培养基+ ：满足所有营缺型菌株 生长营养要求的天然或半组合培养基。 补充培养基A，B ：满足相应营缺型 菌株生长营养要求的组合或半组合培养基。,（2）三类遗传型个体 野生型：从自然界分离获得的菌株不论 营养状况如何，均称为。（A+B + ） 营缺型：野生型菌株经诱变由于代谢障 碍,而必须添加某种物质才能生长的突变株。 （A+B - ） （A-B + ） 原养型：营缺型回复突变后的菌株。 （A+B + ）,基本基- 完全基+ 补充基 A 野生型 + + + 营缺型 + + 原养型 + + +,（3）筛选步骤 1）诱变 2）淘汰野生型：抗生素法、菌丝过滤法 3）检出： 夹层培养法；限量补充法 逐个检出法；影印平板法,夹层培养法,1）制备基本 培养基； 2）加充分洗 涤菌悬液； 3）加待测营 养物； 4）观察生长。,（4）鉴定缺陷类型(生长谱法), 定位（点）诱变,盒式诱变 寡核苷酸引物诱变,Strain improvement for fermentation and biocatalysis processes by genetic engineering technology,建议读物,§.3 基因重组 基因重组（狭义遗传重组）： 两个独立基因组内的遗传物 质，通过一定的途径转移到一 起，形成新的稳定的基因组过程。,遗传工程 -基因重组技术 经典、同源、生物自然属性、 体内 -DNA重组技术 (基因工程)： 分子水平、同- 异源、体外,一、原核生物的基因重组 （一）转化 受体菌直接吸收供体菌游离的 DNA片段而获得部分遗传性状的现 象。,1、转化的基本条件 （1）感受态： 受体菌最容易接受外源DNA 片段并能实现转化的一种生理状态。 影响因素： -遗传因素（感受态因子;种属的特异性） -外部因素（CAMP、聚乙二醇、二价阳 离子; 低温低渗CaCl处理、培养条件）,大小： 每一转化DNA片段分子量约 1×107， 约 占染色体组0.3%，平均 15个基因。 结构：一般转化因子都是线状双链DNA，少数为 线状单链DNA。 转化频率：0.11%（很低），最高10%，质粒 为良好的转化因子。 浓度：10-5 ug/ml,（2）转化因子,转化因子,非交换,2、转化过程 1）酶解和吸收单链 2）同源区配对、 整合 3）复制 4）形成转化子,3.转染(Tranfection) 提纯的病毒DNA或RNA进入宿主细胞并增殖出正常的病毒后代现象。 If DNA from a virus is used as the cloning vector, the process is called transfection. (Introduction to microbiology, John L. Ingraham ),（二）转导(Lederberg,1952) 完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介,使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。,1、普遍转导 完全缺陷噬菌体对供体任何DNA小片 段进行“误包”,而将其遗传性状传递给受体菌的现象，包括完全普遍转导和流产 普遍转导两种类型。,完全转导 (形成转导子),感染复数：感染的噬菌体数/被感染细胞数,流产转导：(仅形成一个转导子, 产生小菌落),经转导进入受体菌的供体菌DNA片段，在受体菌内不交换、整合、复制，也不迅速消失，仅进行转录、翻译、性状表达转导现象。,、局限转导 部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定的基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象。,A、低频转导（） ）噬菌体感染 ）诱导裂解 ）不正常切离（低频转导裂解物）（ dgal、 dbio） ）形成局限转导子,B、高频转导（） 条件:双重溶源菌 低频转导(LFT)裂解物：溶源噬菌体感染后， 带少数局限转导噬菌体的细胞裂解物。 双重溶源菌：同时感染有正常噬菌体 和缺陷噬菌体的受体菌。 (来源：LFT裂解物以高的感染复数(m.o.i) 感染宿主),双重溶源菌,2）高频转导：在局限转导中，用双重溶源 菌诱导裂解后产生的高频转导裂解物转导受 体菌可获得的高达 50% 的转导子，称之。 3）过程： 1）双重溶源菌 2）诱导，获得高频转导裂解物 3）高频转导裂解物低m.o.i感染受体菌,（3）溶源转变,温和噬菌体 感染宿主后，宿主通过 溶源化而获得免疫性以外新性状的现 象。 白喉毒素： 白喉杆菌的ß-噬菌体带有“TOX”基因,（三）接合 接合：通过细胞间的直接接触,由质粒介导的遗传物质转移的现象. 接合子：通过接合 而获得新的遗传 性状的受体细胞。, 存在方式:四种接合型菌株 1、F -,2、 F+ 菌株,Orit：起始子,3、Hfr菌株：高频重组菌株， F+整合在染色体上 成为附加体的状态，若与F -接合，有很高 的重组频率。 1）细胞接触 2）Hfr断裂、转移、 复制 3）接合中断 4）形成接合子,利用接合中断法绘制染色体图谱 (分析方法:营缺型接合为重组型),中断杂交试验,基因测序 （鸟枪法） 1.构建文库 2.随机测序 3.片断排列 4.编辑,4、 F 菌株 （质粒带有部分染色体片断的菌株） 初生F 菌株 次生F 菌株,建议读物,基因水平转移是细菌进化的主要动力 微生物功能基因组学,作业:,在大肠杆菌中发生了基因重组现象.请用一组试验证明发生该重组的过程是转化,转导或者接合?,（四）原生质体融合,通过人为方法,使遗传性状不同的两个 细胞的原生质体融合,继而遗传重组,借 以获得兼有双亲性状,遗传性稳定的融 合子的过程。,主要步骤： 1）选择亲本 2）制备原生质体 3）促融 4）原生质体再生 5）融合子检出 6）筛选,Metabolic engineering by genome shulffling G.Stephanopoulos Nature biotechnology 2002, 20, 666-,建议读物：,总结：,§.5 菌种衰退、复壮和保藏 菌种衰退现象：形态、生长速度、代谢产物、致病性、抗逆性等 复壮：通过分离纯化和测定，从衰 退群体中筛选未退化的个体。,菌种衰退的防止： 1）减少传代次数 2）良好培养条件 3）利用不易衰退 的细胞传代 4）菌种的有效保藏,菌种保藏相关问题： 1保藏条件：低温、干燥、无氧、低 营养、保护剂 2、菌种的有效管理 保藏机构：ATCC、CCTCC 、DSMZ 3、有效的保藏方法,常用保藏方法比较：,微生物同源重组的一般概念和模型,补充材料,同源重组： 两条同源的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接，而产生片断交换的过程。,双交换：两个连锁基因间发生两次交换。 -A-B-C- -a-b-c- 可以看作先发生a b一次交换 A-bc aB-C- 然后b c间再发生一次交换 A- bC- -aBc,基因重组的Holliday 模型,1.同源配对 2.内切酶切开单链 3.单链交换 4. 连接 5. 分支迁移 6.交联桥结构,7.旋转180° 8.形成Holliday连接体 9.上下或左右连接 10.连接,双链断裂修复模型,a.双链DNA b.双链断裂 c.形成缺口 d.形成D环 e.合成缺口 f.分支迁移 g.Holliday体拆分 10.两侧基因交换(右),J.W. sostak,大肠杆菌同源重组(RecBCD核酸酶),