第三章蛋白质的化学.ppt

,Chapter 3 Structure and Function of Protein,内容简介,蛋白质的分类及生理学功能 氨基酸的结构和性质 肽的结构和生理功能 蛋白质的多级结构和性质 蛋白质的研究技术,第一节 蛋白质的分类及生理学功能,蛋白质(protein) 是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物,1.1 蛋白质的化学组成,蛋白质的元素组成,蛋白质含量（克）=每克生物样品中含氮的克数 6.25,三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，无味，在水中溶解度随温度升高而增大,在20时，约为3.3 g/L 三聚氰胺的含氮量为66左右。因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量虚高 三聚氰胺进入人体后，发生取代反应(水解)，生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的网状结构，造成结石。,1.2 蛋白质的分类,1、根据分子形状,2、根据蛋白质组成： 简单蛋白质：水解为 -氨基酸 结合蛋白质：单纯蛋白质+辅基，如色蛋白、 糖蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白等。,3、根据蛋白质溶解度：,4、根据蛋白质功能 活性蛋白质（识别） 非活性蛋白质（保护）,1.3 蛋白的生理功能,1 酶 2结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白） 3贮藏（卵清蛋白、种子蛋白） 4物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体） 5细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白） 6激素功能（胰岛素） 7抗体(免疫信号） 8接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白） 9调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）,第二节 氨基酸的结构和性质,氨基酸的结构 氨基酸的分类 氨基酸的物理性质 氨基酸的化学性质,不变部分,可变部分,2.1 氨基酸的结构,-氨基酸的结构通式,C,O,O,H,C,H,H,2,N,R,氨基酸的立体异构体,（1）常见的天然氨基酸 （2）不常见的稀有氨基酸是正常氨基酸的衍生物，在遗传上没有直接的三联密码。 （3）非蛋白质氨基酸不在蛋白质分子中 出现的氨基酸。,2.2 氨基酸的分类,甘氨酸,丙氨酸,缬氨酸,丝氨酸,脯氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,甲硫氨酸,（1）常见的天然氨基酸,20种氨基酸的名称及缩写代号,常见的天然氨基酸分类,也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸 修饰而来。 (1) 4-羟脯氨酸 (2) 5-羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。 (3) 6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中） (4) -羧基谷氨酸：存在于凝血酶原及某些具有结合 Ca2+离子功能的蛋白质中。 (5) Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋白中） (6) 锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中）。,(2)非编码的蛋白质氨基酸,不组成蛋白质，但有生理功能 （1）L-型 氨基酸的衍生物 L-瓜氨酸、L-鸟氨酸是尿素循环的中间物 （2）D-型氨基酸 D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S） （3）-、-、-氨基酸 -Ala（泛素的前体）、-氨基丁酸（神经递质）。,(3)非蛋白质氨基酸,2.3 氨基酸的一般物理性质,（1）无色晶体，熔点极高，一般在200以上 （2）不同氨基酸有不同的味感 （3）能溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂(酸性的COOH基和碱性的NH2基，为两性电解质) （4）极性,（5）具有旋光性,如果RH，则具有不对称碳原子， 因而氨基酸大多是光活性物质(Gly除外R为H原子无手性碳原子) 天然氨基酸除脯氨酸和甘氨酸外，其余属于L-氨基酸。,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。,氨基酸的紫外吸收光谱,（6）紫外吸收性质,可用于蛋白定量检测,（1）与亚硝酸的反应(氧化还原性） （2）成盐作用（HCl，碱性） （3）与甲醛的反应（亲核性） （4）酰基化与烃基化反应（亲核性） （5）脱氨反应（氨基酸的代谢,酶催化）,2.4 氨基酸的化学通性,（一）由氨基参加的反应,（1）与亚硝酸反应：氨基酸氨基同其它伯氨一样，室温下与亚硝酸作用生成氮气 AA + 亚硝酸 -羟基酸 + 氮气+ 水 用途：范斯莱克氨基氮测定法，用于氨基酸 定量和测蛋白质水解进行程度(氮气一半来自氨基酸，一半来自亚硝酸） 生产上用来测定氨基酸含量和蛋白质水解程度。因为蛋白质总氮量（凯氏定氮）不变，亚硝酸法测定的氨基氮却在不断上升，用氮气量的一半除以总氮量，可以表示蛋白质的水解程度。,用途：由于氨基为弱酸，不容易滴定定量（弱酸或物质浓度低，滴定突跃范围小都很难找到指示剂在其范围内），通过甲醛衍生，是其变为较强酸，滴定终点范围可用酚酞标示）,羟甲基氨基酸,二羟甲基氨基酸,（2）甲醛反应：AA + 甲醛 二羟甲基氨基酸,用途：N末端氨基酸测定,AA与丹磺酰氯的反应,（3）酰基化与烃基化反应,（荧光）,荧光性质，使检测灵敏度可以达到110-9mol。,（黄色）,实际上也是一种N-端分析法。此法能够不断重复 循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,PTH-AA,Edman （苯异硫氰酸酯法）-氨基酸顺序分析法,（1）成酯和成盐反应（+ 醇） （2）成酰胺反应（Asn，Gln） （3）酰氯化反应（酰化氨基酸） （4）叠氮反应 （5）脱羧反应（+ 酶),（二）由羧基参加的反应,a.AA + NaOH 氨基酸钠盐(氨基酸的碱金属盐能溶于水,重金属盐不溶于水) b. HCl AA + EtOH 氨基酸乙酯的盐酸盐,成盐成酯反应,形成酰卤的反应,用途：这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应。,保护基简写（胺基酰化）,酰化胺基,叠氮化反应,用途：常作为多肽合成活性中间体，活化羧基。,经过酰化、酯化变成酰化氨基酸甲酯，再与联氨和亚硝酸作用，生成叠氮化合物。,脱羧反应,用途：酶催化的反应。,(三)由氨基和羧基共同参加的反应,（1）与茚三酮的反应 （2）氨基酸的两性解离 （3）形成肽键,（1）AA与茚三酮反应,蓝紫色,（2）两性解离及等电点,甘氨酸的解离曲线,起点：100% Gly+ 净电荷：+1 第一拐点：50%Gly + ，50%Gly± 平均净电荷：+0.5 pH=pK1+lgGly±/Gly+(羧基解离) (pK1 = 2.34) 第二拐点：100%Gly± 净电荷： 0 等电点pI 第三拐点：50%Gly±， 50%Gly- 平均净电荷：-0.5 pH=pK2+lgGly/Gly±(氨基解离) (pK2=9.6) 终点： 100% Gly- 净电荷：-1,等电点偏酸在于羧基解离度大于氨基解离度,pH=pK+lg(质子受体 / 质子供体),在适当的酸碱度时，氨基酸溶液中-NH3+和COO-解离度完全相同，此时正离子和负离子浓度相同，净电荷为零；在电场中既不向阳极移动也不向阴极移动，成为两性离子（或兼性离子），这时氨基酸所处溶液中的pH值就是该氨基酸的等电点（pI）。 等电点（pI）时溶解度最小。 等离子点VS 等电点（等电点受离子浓度干扰）,等电点的概念,等电点的推导,移项：,根据等电点的定义:,Ala+= Ala-,中性氨基酸：pI = (pK1 + pK2 )/2 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 pK1指-羧基解离常数的负对数值； pK2指-氨基解离常数的负对数值； pKR指侧链R基解离常数的负对数值。,氨基酸等电点计算,对谷氨酸：A+ Ao A- A2-,2.19,4.25,9.67,pI（2.19+4.25）/23.22,对赖氨酸：,A2+ A+ Ao A-,2.18,8.95,10.53,pI（8.95+10.53）/29.74,（3）形成肽键（peptide bond）,氨基酸残基与肽单位,(四)由支链R基产生的反应,第三节 肽的结构和生理功能,谷胱甘肽（GSH）的一级结构,谷胱甘肽的生理功用 解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用； 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应； 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。,肽概述,(1)形成：脱水缩合 (2)命名：NC,A 肽也是以两性离子形式存在，一般为链式结构。羧基端为C-端，氨基端为N-端。书写时，N-端在左，C-端在右。,N-端,C-端,肽键,B 肽的结构不仅取决于氨基酸的种类和数目，而且还取决于它们之间的连接次序。如,甘氨酰丙氨酸,丙氨酰甘氨酸,这是少数几种氨基酸可以形成各式丰富多彩的蛋白质的基础。 C 肽的命名以C-端的氨基酸为母体，称为某氨酸。其它氨基酸残基则从N-端开始，依次用某氨酰表示，放在母体前。如,谷氨酸残基,半胱氨酸残基,甘氨酸残基,g-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 谷胱甘肽,简称：g-Glu-Cys-Gly； g-谷-胱-甘,(3)分类：寡肽 VS 多肽 （构成单元大于10称为多肽） (4)酸碱性：两端氨基酸残基的酸碱性,酸的偏向不酸；碱的偏向不碱（两端氨基酸残基官能团为正负离子，有吸引力作用，导致酸碱性增加，而肽链变长后这种引力降低）,谷胱甘肽（GSH）的一级结构,生物活性肽,活性肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,肽,肽的生理功能-活性肽与氨基酸生理差别,肽以完整的形式被机体吸收(肽通过十二指肠吸收后，直接进入血液循环，将自身能量营养输送到人体各个部位)，小肽也是逆浓度梯度转运，主要依赖H+浓度或Ca2+离子浓度转运。小肽转运系统具有转运速度快、耗能低、不易饱和等特点。 （氨基酸属主动转运，要氨基酸载体）,较氨基酸吸收快速,同时吸收过程低耗或不需消耗能量, 吸收具有不饱和的特点 氨基酸只有20种，功能可数，而肽以氨基酸为底物，可合成上百上千种,可执行复杂生理功能.,肽是信息的信使，以引起各种各样不同的实效的正性或异性生理活动和生化反应调节（蛋白相比执行其它功能更多,但很多情况下活性肽活性较高） 分子量小，易于改造，易于化学合成，而高蛋白（大分子蛋白质）不具备这一特点,肽的生理功能-活性肽与蛋白质生理差别,若氨基酸为二度深度开发，肽就是高蛋白的三度深度开发产品,第四节 蛋白质的结构和性质,蛋白质的多级结构 蛋白质的结构与功能关系 蛋白质的一些性质,4.1 蛋白质的多级结构,(一）蛋白质一级结构(Primary structure) 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序， 它是蛋白质生物功能的基础。,胰岛素（Insulin）的一级结构,（二） 蛋白质二级结构,蛋白质的二级结构：指一级结构进一步盘绕折叠，其主链形成的局部构象。 二级结构的类型：主要有-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲。 维持二级结构的力：主要是氢键。,二级结构形成的基础-肽平面,肽平面形成是由于N元素以sp2杂化方式,使其结构中的孤对电子和氧共轭的结果 C元素电子云也以sp2方式杂化导致六个原子在同一平面上,肽平面内各个键的键长和键角,肽键,肽键（酰胺键）CN长度为0.133nm比CN（0.125nm）长，但比一般的CN单键（0.145nm）短，所以肽键具有部分双键特性（约具有40双键特性）。,肽平面绕N-C键旋转角度用表示,绕C-C键旋转的角度用表示,从C沿健轴方向观察，顺时针方向为正，反时针为负。,N,C,羧基碳,Aa基本结构,理论上和可以取180°至180 °之间的任一个角度。但由于旋转时酰胺氢和羰基氧之间的位阻，所以并不是任意二面角（ ， ）都是立体化学所允许的。,上图表示肽链中的肽单位处于一种伸展状态；下图表示的是肽单位处于一种不稳定构象，这是由于相邻氨基酸残基的羰基氧之间的立体干扰引起的，虚线表示的是羰基氧原子的van der Waals半径。,旋转本身受到肽链的主链和相邻残基的侧链原子之间的立体干扰的限制。,原子间作用是限制并形成高级构象的动力,肽平面和二面角示意图,R基分布在螺旋的外侧，并且影响着螺旋的形成。,主链围绕中心轴呈有规律螺旋式上升，形成右手螺旋；,旋转一周为3.6个氨基酸残基；螺距为0.54nm；,其结构靠第一个肽平面上的-NH基与第四个肽平面上的-CO基形成的氢键维持，氢键的取向几乎与轴平行；,（1） -螺旋的特征,二级结构的类型,（4条-螺旋） 原纤维,微原纤维（11条-螺旋）,巨原纤维,纺锤体型皮质细胞,角质膜,皮质,髓质,头发,头发结构,烫发实际上是一个生物化学过程,还原,做卷,氧化,纺锤体型皮质细胞含有众多的二硫键,左手/右手- 螺旋,影响-螺旋稳定的因素,极大的侧链基团（存在空间位阻）； 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应)； 有脯氨酸、羟脯氨酸的存在 （不能形成氢键）。,（各种聚合氨基酸成螺旋小结）,Gly 能形成（无R基团妨碍氢键形成） Asp、Lys 不能形成（侧链带电荷排斥） 在一定pH范围内 Pro 不能形成（不能形成氢键） Leu不容易形成 (R基团较大，妨碍氢键形成）,（2）-折迭的特征,由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构；,主链骨架上下折叠呈锯齿状（AA长0.36nm)；,借相邻主链之间的氢键维系。,R基交替分布在片层的上下方。,二级结构的类型,-折迭包括平行式和反平行式两种类型,二级结构的类型,（4）无规卷曲 是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象 对于构造蛋白执行功能的所需的柔性结构来说具有重要意义,二级结构的类型,View of conformational change:,RNase的分子结构,-螺旋,-折迭,-转角,无规卷曲,超二级结构,结构域,（三）蛋白质的三级结构,溶菌酶分子的三级结构,(1) 主要是非共价键（次级键），如疏水键、 氢键、盐键、范氏引力等； (2) 但也有共价键，如二硫键等。,疏水作用是维持蛋白质结构最主要的稳定力。疏水基团因疏水作用而聚向分子内部，亲水基团多分布在分子表面。因此，具有三级结构的蛋白质都是亲水的。,维系三级结构的力,键 能 肽键 二硫键 离子键 氢键 疏水键 范德华力,数量巨大,（四）蛋白质的四级结构,由两条或两条以上具有三级结构的多肽链 相互缔结在一起的聚合体。其中每条具有三级 结构的多肽链为一个亚基。 维系蛋白质四级结构的力是次级键。 偶数亚基，排列对称。,血红蛋白(hemoglobin)的四级结构,四级结构优越性,1、共价键：二硫键、肽键、酯键； 2、非共价键：氢键、离子键、疏水键和范德华力,一级结构：共价键 二级结构：氢键 三、四级结构：次级键,（五）维系蛋白质分子结构的键及作用力,随着结构层次上升,键的作用能力越弱,符合物质构成一般规律,稳定蛋白质构象的力,4.2 蛋白结构和功能关系,蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能 蛋白质的高级结构决定了其功能,(1)蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能,(1)蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能,镰状细胞贫血（sick-cell anemia）从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。,-链 1 2 3 4 5 6 7 Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys Hb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys,Val 取代Glu,O2,O2,(2) 蛋白质的高级结构直接决定其功能,高级结构变化，其许多结构性质就会改变（如变性失活） 高级结构及构象微调，其活性也会发生很大变化,血红蛋白,血红蛋白构象的微调-构象改变-生理功能改变,血红素在蛋白中的位置,血红素,氧结合引起蛋白局部构象变化,局部构象变化引发关联蛋白构象变化,氧气结合最终引起整体构象变化,氧结合形成的构象改变，改变了四级结构相成的盐键，使其它亚基构象变化，使其它亚基转变为更亲氧构象，形成协同作用方便了氧的运输,可以通过其它分子限制蛋白构象的微调变化,4.3 蛋白质的重要性质,(一) 胶体性质,蛋白质的分子量很大，但它在水中能够形成胶体溶液(蛋白表面有带电基团,但不同于化学溶胶吸附金属离子而带电)。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等 水膜和同种电荷排斥作用是胶体稳定的原因,利用胶体性质可用于蛋白的分离：蛋白沉淀,由前述可知, 维持蛋白质溶液稳定的主要因素是蛋白质分子表面的水化膜和双电层。若用化学或物理的方法破坏蛋白质的这两种因素，则蛋白质分子将凝聚而沉淀。方法有： 等电点沉淀法：蛋白颗粒间无电荷的排斥作用，易于形成聚集成大颗粒，不稳定，易于沉淀析出。 盐析：中性盐（硫酸铵）既中和蛋白所带电荷又破坏水化膜。分段盐析 有机溶剂沉淀以及重金属盐或者生物碱或酸试剂沉淀蛋白质：其作用，蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象也可产生沉淀。 变性的蛋白质不一定沉淀， 沉淀的蛋白质不一定变性。,其它沉淀方式 因酸、重金属盐类或者生物碱试剂的作用，蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象也可产生沉淀。 变性的蛋白质不一定沉淀， 沉淀的蛋白质不一定变性。,蛋白质在等电点偏酸溶液中带正电荷，在等电点偏碱溶液中带负电荷，在等电点时为兼性离子。 蛋白质是人体重要的缓冲剂。,（二）两性解离性质(电性),蛋白质不管肽链有多长仍有自由的-NH2或-CO2H存在，在肽链的侧链也有尚未结合的极性基团，如赖氨酸的氨基、谷氨酸的羧基、半胱氨酸的巯基等。 这些碱性、酸性基团在溶液中会解离（两性离子），解离的程度与离子的性质、溶液的pH值、蛋白质中游离基团的性质合数目等有关。其两性解离可表示为,两性 pH = pI,负离子 pH pI,正离子 pH pI,可见，在酸性溶液中蛋白质解离成阳离子，在碱性溶液中解离成阴离子.,在某个pH值时蛋白质成两性离子，所带正负电荷相等, 此pH值即为该蛋白质的等电点(pI), 不同的蛋白质有不同的pI值。 ) 测定蛋白质等电点必须在有一定离子浓 度的适当缓冲液中进行(离子强度影响H+解离) ) 在水溶液中，蛋白质的等电点一般偏酸， 因为羧基的解离度比氨基的大。 ) 等电点时蛋白质的导电性、溶解度、 粘度、渗透压等都是最小,蛋白质的等电点,电泳现象,在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。 当溶液pH=等电点时， 蛋白质粒子净电荷为零，在电场中不移动； 当溶液pH等电点时， 蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动； 当溶液pH等电点时， 蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。,不同电荷量的蛋白,在纸电泳时,迁移距离不同,（三）蛋白质的变性与复性,蛋白质的变性（denaturation） 在某些物理或化学因素的作用下，天然蛋白 质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断 裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学 性质的改变，称为蛋白质的变性。 （主要是次级键变化） 肽键不变、次级键变化，一级结构不变，分为可逆变性（3级以上结构被破坏）与不可逆变性（2级）,蛋白质的变性 (the denaturation of proteins),天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失。,引起蛋白质变性的因素,物理因素：高温破坏次级键、 高压、紫外线、电离辐射、超声波等. 化学因素：强酸、强碱破坏盐键 有机溶剂（二甲基甲酰胺）破坏氢键 去污剂、尿素破坏疏水作用和氢键,物理性质： 旋光性改变 溶解度下降 沉降率升高 光吸收度增加,化学性质： 官能团反应性增加 易被蛋白酶水解 生物学性质： 原有生物学活性丧失 抗原性改变,都与蛋白构象改变基团外露有关,变性蛋白质的特征,蛋白质的变性如不超过一定的限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质，这种现象称为蛋白质的复性。 与导致变性的因素、蛋白质种类、蛋白质分子结构的改变程度相关。,蛋白质的复性（renaturation）,核糖核酸酶的变性与复性,（四）蛋白质的颜色反应,双缩脲：是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。 双缩脲反应： 双缩脲 / 两个以上肽键的多肽 + 碱性硫酸铜 紫红色或蓝紫色络合物,为数不多的利用蛋白整体性质的显色反应,蛋白质的颜色反应,OH,N,第五节 蛋白质研究相关技术,分离 测序 鉴定,5.1 蛋白质的分离纯化,生物组织 前处理 粗分级 无细胞提取液 细分级 浓缩的蛋白质溶液 精制品(结晶/冻干粉),盐析 等电点沉淀 超滤 有机溶剂分级,（一）分离纯化的一般程序,破碎 溶解 离心,层析 电泳,（二）分离方法分类介绍,()分子大小（蛋白质的透析）,利用物质分子量、密度、形状的不同， 经超速离心后分布于不同的液层而分离。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量， 蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。,() 分子大小（超速离心）,() 分子大小(凝胶过滤分离蛋白质),概念： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。,()溶解度-盐析,盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。 分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白， 而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。,()溶解度-盐析,凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理是：A、脱蛋白胶体上水膜作用；B、使水的介电常数降低，蛋白分子异种电荷相互吸引力增加,蛋白质溶解度降低。,()溶解度-有机溶剂沉淀,()亲和特性（亲和层析）,(1)、末端分析 N末端测定 Sanger法 Edman法 DNS法 氨肽酶法,C末端测定 肼解法 羧肽酶法,5.2 蛋白质一级结构的测定,2、二硫键的拆开和肽链的分离 3、肽链的部分水解和肽段的分离 （1）溴化氰裂解 （2）部分酸水解 （3）酶水解（牢记四种酶解方式）,常考察内容 酸碱 CNBr 酶,（1）酸水解,常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时。 此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏； 含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。,肽链的水解方式,（）碱水解,一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。 部分的水解产物发生消旋化。 该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。,（）部分酸水解,稀酸 Asp的羧基端 浓酸 羟基氨基酸的氨基端,（）CNbr裂解,Met的羧基端 专一性好，切点少,（）酶水解,目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。 最常见的蛋白水解酶有以下几种：,Trypsin ：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快） 碱性氨基酸羧基端,水解位点,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。 芳香氨基酸羧基端,糜蛋白酶,水解位点,Pepsin：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu水解速度较快。 主要是酸性氨基酸和芳香氨基酸羧酸端,胃蛋白酶,水解位点,thermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。,嗜热菌蛋白酶,水解位点,4、测定每一段氨基酸顺序(edman降解) 5、由重叠片段推断肽链顺序 6 、确定二硫键位置,确定二硫键位置,(一) 氨基酸的分析 纸层析法:利用极性与非极性氨基酸在水和 有机溶剂中的溶解度不同的特点，在滤 纸上进行分离的方法(分配层析); 柱层析法：根据氨基酸的离子交换反应的原 理，如HPLC; 薄层层析法：利用吸附原理进行层析的方法， 在玻板上的薄层吸附剂上进行。,5.3 蛋白的鉴定及定量,One-Dimensional 单向层析,Known Sample,Y,X,Rf=X/Y,?,Filter-paper Chromatography,Two-Dimensional 双向层析,溶剂前沿,Thin-layer Chromatography,Thin-layer,HPLC,mAU,（二） 蛋白质含量的测定,(1) 紫外光吸收法:此法是用紫外吸收分光光度计在紫外光区测定蛋白质的光吸收，从而测定蛋白质含量的方法。,(2) 双缩脲法,在强碱性溶液中，蛋白质与CuSO4反应，生成紫红色化合物，这个反应称为双缩脲反应（biuret reaction)。 在碱性条件下，蛋白质与CuSO4所生成的颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关。将样品同标准蛋白质同时试验，并于540-560nm波长下侧其光吸收值，通过标准曲线曲线即可求得蛋白质的含量。 此方法简便、迅速，不受蛋白质特异性的影响，但方法的灵敏度较差，所需样品量大（0.2-1.7mg/ml）。,(3)福林一酚试剂法,福林一酚试剂（Folin-phenol reagent ) （酪氨酸），在碱性条件下很容易将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，所生成蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，因此，在650nm或660nm波长下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。,下课了！,