离体快繁与脱毒28h.ppt

努力学习，无论做什么都要尽你所能尽力而为。,Study hard and whatever you do , do it as well as you possible can., 卡尔·韦曼 Carl Wieman 2001年诺贝尔物理学奖获得者,植物细胞工程 主讲教师：邵景侠 TEL：13772546610 E-mail：shaojingxia_0163.com,目 录,绪论（2h) 第一章 植物细胞工程实验室及基本操作技术（2h） 第二章 植物细胞工程原理概述(4h) 第三章 植物离体快繁技术和脱毒培养技术(4h) 第四章 植物细胞培养与有用物质生产 (2h) 第五章 植物体细胞无性系变异与突变体筛选(2h) 第六章 植物离体单倍体诱导技术及应用 (2h) 第七章 植物原生质体培养与体细胞杂交(2h) 第八章 植物胚胎培养技术及其应用(2h) 第九章 植物种质资源的离体保存(1h) 第十章 植物的遗传转化 (1h),第三章植物离体快繁和脱毒培养技术,植物离体快速繁殖技术Rapid Multiplication,植物的脱毒培养技术,第一节、植物离体快速繁殖技术,一、离体快速无性繁殖的概念及其意义 二、植物离体快速无性繁殖的特点 三、离体快速无性繁殖中器官的发生形式 四、离体无性繁殖的程序 五、植物组织培养中应注意的几个问题,一、植物离体快速无性繁殖的概念及其意义,1 概念 离体无性繁殖：指利用组织培养的方法进行植物离体培养，在短时间内获得大量遗传性一致的个体的方法，又称“离体繁殖，快速无性繁殖、微型繁殖”。 试管苗：由离体无性繁殖获得的植株称试管苗。 无性系：指有同一个体通过无性繁殖产生的一个群体，它们的遗传背景基本一致。,2 应用,（1）用来加速难繁殖和繁殖速度慢的植物的繁殖。 （2）无病毒苗木的繁殖。 （3）用于某些杂合园艺植物的繁殖。 （4）用于需要加速繁殖的特殊基因型。,二、植物离体快速无性繁殖的特点,1 优点 （1）首先体现在一个“快”字上。 （2）可人为控制条件，不受大自然的干扰 （3）快速培养脱毒苗。,2局限性,（1）一些植物快速无性繁殖技术的某些环节还没有突破。 （2）要对其成本、技术等进行估算。 （3）随继代次数增多，培养材料的分化能力下降。,国内外植物离体快繁概况,(1)欧洲微繁情况 植物组织培养室650多个 主产品为花卉、果树 微繁数量最大国家：荷兰、法国、意大利、比利时、英国。,（2）美洲 微繁实验室200多个，1.57亿株/年 主要产品为香蕉、草莓、马铃薯脱毒种苗种薯。 （3）亚洲 共有商业性实验室270多个 试管苗6500万株9000万株/年 兰花、温带花卉、果树、农作物无性繁殖。,国内外植物离体快繁概况,（4）大洋洲 88个实验室 2000万试管苗/年 果树、农作物、林木、观赏植物 （5）非洲 42个商业性组织培养室 80%微型繁殖，1.4×106株试管苗/年 农作物、马铃薯、木薯、甘蔗、香蕉,国内外植物离体快繁概况,国内基本情况 组培快繁种类：木本150种；花卉139种；药用53种；园艺（果蔬）29种；禾谷类44种；草本水果9种，共计445种。,国内外植物离体快繁概况,发达国家：商业快繁，观赏植物，果树 发展中国家：育种研究，无性繁殖农作物,三、离体无性繁殖中器官的发生形式,1 不定芽型（Adventitious bud type ） 器官型（Organ type） 器官发生型（Oraneogenesis） 类胚体发生型（Embryogenesis） 原球茎型（Protocorm）,1 不定芽型,不定芽：凡是叶腋或茎间以外任何其它地方形成的芽都称不定芽。 外植体：要有明显顶端分生组织和次生分生组织的植物均适用。 特点：以芽繁芽，繁殖速度快；后代遗传性比较稳定。（图）,器官型,外植体：充分发育，生长旺盛的器官，如茎段、叶、花器、鳞片等。 特点：直接从器官上诱导不定芽，遗传性比较稳定，但繁殖速度慢。,器官发生型,外植体：生长幼嫩的材料，使其来源尽量一致，旺盛、新鲜的组织或器官。 特点：繁殖速度快，但遗传性不稳定。,类胚体发生型,即胚状体途径，由植物细胞、组织或器官直接诱导发生胚状体结构，最终发育成苗的方式。 特点：遗传性稳定，但繁殖数量不如不定芽型和器官发生型多。,从胡萝卜细胞培养产生胚状体和 小植株开花结实的过程,用打孔器从胡萝卜块根上取得盘状外植体 外植体置于25下转动培养 由外植体分离出的细胞增殖并发育为胚状体 胚状体移于琼脂培养基上并长成植株和开花结实,原球茎型,兰花特有的原球茎发生型，通过诱导原球茎直接长成植株。 图：兰花原球茎发生型 图：兰花的微繁技术,兰花的萌发,兰花的启动,兰花的增殖,兰花的分化,培养的兰花,四 、离体无性繁殖的程序,无菌母株的制备 茎芽的增殖 诱导生根 炼苗 再生植株的鉴定, 无菌母株的制备,（）无菌母株的概念 无菌母株：在无菌条件下，用于试管内继代增殖的植物材料，称为“无菌母株”或“繁殖母株”。,（）无菌培养物的建立,外植体的制备（选择、清洗、消毒、灭菌） 培养基的选择,基本培养基,无机营养,水,有机营养,大量元素,微量元素,碳源,氨基酸,维生素,附加成分,植物激素,生长素：IAA、IBA、NAA 2，4-D,细胞分裂素：ZT、KT、BA,琼脂、聚蔗糖等,天然有机复合物,水解酪蛋白,椰子乳汁,马铃薯汁,其它成分：AV、PVP、NaCl、,完全培养基,按培养基的用途分为：,基本培养基,诱导培养基,继代培养基,分化培养基,生根培养基,壮苗培养基,按照培养基的物理状态分为：,固体培养基,半固体培养基,液体培养基,附加培养基,单因子实验：,第一组： 1-1 MS+BA0.0+NAA0.1 1-2 MS+BA0.1+NAA0.1 1-3 MS+BA0.2+NAA0.1 第二组： 2-1 MS+BA0.1+NAA0.1 2-2 MS+BA0.1+NAA0.2 2-3 MS+BA0.1+NAA0.3 .,茎芽的增殖,（）通过不定芽的形成增殖 （）通过腋芽的形成增殖（图） 蝴蝶兰花梗腋芽组织取芽法动画 （）通过单节茎段扦插增殖（图）,繁殖速率的计算 ：,Y=mXn Y：年繁殖数 M：无菌母株数 X：每个培养周期增殖的倍数 N：全年可增殖的周期次数,生根培养,（）试管内生根 （）试管外生根 基质生根法 嫁接生根法,（）试管内生根,培养基内诱导生根的方法。 调节激素种类和浓度 调节基本培养基的组成（1/2、1/4MS） 调节渗透压（降低糖浓度）,调节激素种类和浓度,多数植物根分化需适当提高生长素水平，减低细胞分裂素水平。 有些植物在仅含生长素的培养基中即可诱导根分化。（如菊花在附加0.1-.3mg/LNAA培养基中，一周即可生根，生根率达100%。） 一些禾本科植物，在无激素条件下即可生根。,（）试管外生根,基质生根法： 把离体条件形成的无根小植株适当处理后，使其在基质中（蛭石、珍珠岩、土、沙子、泥炭等）生长（灭菌）。 嫁接生根法： 将无根小植株嫁接到砧木上，利用砧木的根系吸收养分和水分。 试管内嫁接 试管外嫁接, 移栽（炼苗） （）试管苗的特点 根的特点 叶的特点 组织的特点,根的特点,根系生长不好，没有根毛或根毛很少，吸水力差，难以满足小苗蒸腾作用的消耗，小苗体内的水分难以达到平衡。,叶的特点,在高湿、弱光和异养条件下分化生长的叶，叶表皮保护组织不发达，甚至没有。无角质层、蜡质层，使叶片表面缺乏保护，易失水萎焉。,组织的特点,试管苗组织幼嫩，结构松散，细胞含水量大，机械组织不发达，容易发生机械损伤，对病虫害特别敏感。,1.形态解剖方面 （1）根 （2）叶,试管苗的特点（弱点）,叶的角质和蜡质层不发达，容易蒸腾失水。 无表皮毛，保水和反光能力差。 叶细胞结构疏松。 叶气孔突出，张大。 叶存在排水孔。,（无根毛 根与苗输导不相连。）,根的生理功能：低 叶片表面极易散失水分 气孔不能关闭 叶光和能力较低，CO2固定能力差。,2. 生理功能方面,（）炼苗 瓶炼 盘炼（试管苗的出瓶移栽） 容器移栽 大田移栽,在全自动培养间进行光照培养,试管苗移栽于温室,生根方法,试管内生根（培养基） 试管外生根,影响试管内生根的因素,植物材料 培养基 植物激素 营养元素 其它物质（核黄素、活性碳） 培养条件 光照 pH 温度,无菌 异养 高温 弱光 恒温,试管苗的生长环境,克服试管苗弱点，提高其移栽成活率的措施,（1）移栽要抓三个关键 水分的平衡（不要失水过多） 温度和光照（不能太高） 光和能力逐步形成或加强 （2）提高移栽成活率的技术措施 移栽前的工作 移栽时应注意的问题,（1）培养瓶生壮苗,移栽前的工作-1,加入生长控制剂，如多效唑， B9， CCC，其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。,（2）炼苗 将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为1030D。,移栽前的工作-2,移栽时应注意的问题,（1）防止菌类滋生 苗底部培养基要洗干净 杀菌剂处理苗的根部 定时用杀菌剂处理种植基质,常用杀菌剂：KMnO4,百菌清、多菌灵、托不津，使用浓度0.1,移栽时应注意的问题,（2）保持小苗水分供给平衡,(3)移栽时选择合理的种植基质,基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭。,移栽时应注意的问题,泥炭 珍珠岩 椰糠,移栽时应注意的问题,一般强度较高的慢射光较好,(4)注意一定光照，温度条件,试管苗的鉴定,（）形态学鉴定 （）细胞学鉴定,五、植物组织培养中应注意的问题,褐变（褐化） 污染 玻璃化, 褐变 （）褐变 褐变：指在组织培养过程中，由培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。,褐变现象 褐变原因,有的植物材料在接种后材料的表面出现褐色物质甚至培养基也呈褐色的现象，褐色会严重影响外植体的生长分化，成为植物组织培养的一大障碍。,（组织中的多酚氧化酶被激活，使酚类物质被氧化生产生棕褐色醌类物质而引起褐变。）,褐变影响因素,基因型 材料的生理状态 培养时间,（）克服褐变的方法 选择适宜的外植体（幼嫩材料、春季取材） 改善营养条件（连续培养） 在培养基中加入一些附加物,褐变的防止,三个选择,分生能力强的外植体 合适的无机盐成分浓度、合适的蔗糖浓度和 激素水平 适宜的温度,两个加入,（活性碳、抗氧化剂）,一个连续,（连续将材料进行转移）, 污染,细菌污染的特点,在培养材料附近出现黏液状菌斑，一般接种1-2天一5可发现。特别应注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌，外被荚膜，耐高温，一般灭菌剂难以杀死，可随培养材料、用具传播，可出现在培养基表面，也可呈滴形云雾状存在于培养基内，发现及时淘汰，并对用过的器具严格高温灭菌。,真菌污染的特点,培养基上长霉，一般接种3-5天就可先，霉的颜色有黑、白、黄等，真菌污染的特点是污染部分有不同颜色的霉菌，接种3天，有时多达10天才能表现。,（）克服方法,外植体灭菌不彻底 培养基及各种器具清洁灭菌不彻底 人为因素 超净工作区被污染 环境不清洁,细菌污染,表现： 发酵状 水渍状 滴形云雾状,污染原因： 培养基灭菌不过关 接种器具污染 操作污染 交叉污染,真菌污染,表现： 灰、白、黄、绿菌丝体、孢子组成绒毛状物有色圈,污染原因： 培养室湿度过大 瓶口积落有灰尘和孢子。,材料内部带菌,在培养基中表现的症状 外植体接触培养基部位长菌 外植体损伤部位长菌 外植体生长不良或表现出缺绿 诊断 培养基添加有机物检测,人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。,物品因素,器皿和用具,培养皿：洗热压 玻璃器皿：洗干热（干热箱）或晾干 接种用具：用CCL4布擦湿布擦 泡75%95%酒精烧,培养基：湿热,培养材料,外部细菌：用水冲洗化学药剂处理 内部细菌,茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平,操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸（甲醛或者甲醛： 高锰酸钾=10:1),污染来源,作好接种前准备,接种室的灭菌 超净工作台的灭菌 接种器皿、用具的灭菌 工作人员接种前应做的准备工作 材料的灭菌,1.接种室的灭菌,接种室的地面，墙壁要擦洗干净 接种前一夜用甲醛熏蒸10ml/m2 接种室还可以采用紫外灯灭菌,作好接种前准备,2.超净工作台的灭菌,开风机前将紫外灯打开30分钟以上 之后开风机15分钟 用95%酒精洗工作台面,作好接种前准备,3.接种器皿、用具的灭菌,用具先用95%酒精浸泡，后于酒精灯外焰灼烧,作好接种前准备,4.工作人员接种前应做的准备工作,个人卫生，穿工作服 用70%酒精擦手,作好接种前准备,一个典型的材料灭菌流程 常用灭菌剂 灭菌关键性问题,5.材料处理灭菌,作好接种前准备,适当的搭配 适当的浓度 适当的时间,一个典型的灭菌流程,注意接种操作防止空气污染,防止空气污染 防止操作带来的污染 防止器皿用具污染,防止空气污染,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,正 确 错 误,防止操作带来的污染-A,整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,正 确 错 误,接种过程中尽可能达到悬空要求,防止操作带来的污染-B,正 确 错 误,接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口,防止操作带来的污染-C,正 确 错 误,瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口,防止操作带来的污染-D,正 确 错 误,防止器皿用具污染,接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生,玻璃化,（）玻璃化 玻璃化：是试管苗的一种生理失调症状，当植物材料进行离体繁殖时，有些培养物的茎、叶往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。,（）克服方法 增加固体琼脂浓度，使细胞吸水受到阻碍。 提高培养基中的、比。 控制温度，增加自然光照。 附加一些物质,玻璃化问题,产生的主要原因 克服玻璃化现象的措施：,继代培养的关键技术-1,（水分太多，植物内具有过多的游离水引起）,两个“增加” 两个“增强” 两个“加入” 一个“减少”,两个“增加”：增加琼脂浓度；增加蔗糖含量； 两个“增强”：增强溶器通风；增强光照； 两个“加入”：加入渗透剂；加入ABA； 一个“减少”：减少培养基氮含量,第二节、植物的脱毒技术,病毒的特性及其侵染 脱毒的方法 茎尖培养脱除病毒的程序,一、病毒的特性及其侵染,特性 侵染途径 分布特点,病毒是专性细胞内寄生物，大小在20200 nm之间。含有RNA或DNA，外包一个蛋白衣壳，衣壳外有包膜。完整组装的病毒称为病毒粒子。病毒对抗生素不敏感。,Virus,对植物病毒的研究是从19世纪后期才正式开始的。1886年，德国麦尔（Adolf Mayer)首先描述了烟草花叶病毒（TMV)，1935年，TMV被结晶，也是第一个在电子显微镜下被观察的病毒。现在，经过ICTV（国际病毒分类委员会）分类的植物病毒大约有1000多种。,世界上的病毒对于所有的植物的影响是十分巨大的，据估计每年由于病毒的感染而损失的金额达700亿美元,农作物的损失达到200亿美元。几乎所有农作物都会受到一种或一种以上的病毒侵染，会减少作物的产量和（或）品质。当用特定的无毒植株取代了被病毒侵染的母株后，产量平均增加30%。现在，还没有什么药物处理可以治愈受病毒侵染的植物。,植物病毒对无性繁殖的植物危害更大，病毒可以通过营养繁殖传递到下一代。,病毒侵染后植物的症状,外部症状 植株矮小，叶片 变小、叶间距及叶片数目减少，果实和种子变小。出现花叶（如班驳、明脉、及绿岛）和叶片皱缩。一些病毒会引起叶片黄化、环斑或蚀纹症状。组织、器官或整个植物坏死，或发育不良，出现畸型。,细胞学变化 小液泡出现，细胞器退化，叶绿体、线粒体聚集，细胞壁加厚、从胞间连丝进入细胞、含有12个微管，细胞壁之间出现沉淀物，细胞内出现风轮状内含体。,病毒的特性,（）病毒的结构非简单，仅由蛋白质和核酸组成，无细胞结构，且核酸仅为或RNA。 （）病毒不能进行独立的代谢活动，也缺乏自身的核糖体，必须依靠寄主来合成蛋白质。 （）病毒有核酸，因此能利用寄主的细胞进行复制。 （）具有侵染力，能够将核酸从一种寄主细胞转移到其它寄主细胞。,植物病毒的侵染途径,（）农业操作时的机械损伤。 （）介体（昆虫等）造成的微伤。 （）通过嫁接、菟丝子的“桥接”传播。,病毒的运动,病毒侵染植物 病毒进入细胞 病毒脱壳 病毒基因组的复制、蛋白质的合成 子代病毒颗粒的组装 细胞间移动 进入维管组织长距离运输，向其它部位转移 从维管组织进入细胞，感染整个植株。,在细胞间的移动 只能通过胞间连丝来传播扩散，是借助病毒编码的“运动蛋白”来实现的，部分病毒的运动还需要“外壳蛋白”的参予。,运动蛋白,病毒运动蛋白（Movement protein)与植物间的胞间连丝结合，与细胞壁与胞间连丝调节蛋白相互作用，增加了胞间连丝的有效通道直径，以便允许病毒粒子或基因组核酸通过胞间连丝进入临近细胞，实现病毒在细胞间的运动。,MP首先在细胞质中暂时表达，然后与微管和微丝结合，沿微管运动，在细胞壁上积累，并最终定位于胞间连丝。,病毒在植物体内分布不均匀的原因,（）分生组织中无微管系统，病毒不易移动。 （）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很强，有竞争状态，抑制了病毒的复制。 （）在分生组织中存在高水平的内源激素，可以抑制病毒的增殖。,二、脱毒的方法,物理法脱毒 化学方法脱毒 生物学方法,物理方法,（）射线（射线、紫外线等） （）热处理, 化学方法,嘧啶、嘌呤类似物、抗生素等,生物学方法,茎尖脱毒 愈伤组织脱毒 嫁接脱毒 珠心组织脱毒,（）茎尖脱毒,茎尖脱毒的原理 茎尖脱毒的技术关键,茎尖脱毒的原理,病毒的传播：微管系统 和细胞的胞间连丝传播，以微管组织为主。,茎尖脱毒的技术关键,同一种病毒在植物体内分布部位不同。 不同种类病毒在同一植物中分布位置不同。 茎尖越小，对培养基要求越高，成功率低。 茎尖越小，剥离技术要求高。,（）愈伤组织脱毒,（）微体嫁接脱毒,原理：把极小的茎尖0.2mm作为接穗嫁接到砧木上，然后连同砧木一起在培养基上培养，由砧木吸收培养基中的营养，接穗在砧木的哺育下很容易成活。,试管嫁接,技术关键,微体嫁接要求剥离技术高。 筛选培养基时要考虑到砧木与接穗对培养基营养组成的不同要求。 取材季节，春季容易成功，嫁接率高。,（4）珠心组织脱毒,珠心胚与微管组织无关,三、茎尖培养脱除病毒的程序,取材和灭菌 茎尖剥离 初代培养 分化培养 无病毒植株的鉴定 无病毒种苗的保存与利用,取材和灭菌,（）材料的大小 （）取材时间 （）优良种质 （）生长健壮 （）年龄,茎尖剥离,（）防止茎尖被损伤。 （）注意保湿 （）避免污染,茎尖分生组织（Apical meristem;Apical dome）：主要指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，其直径0.1mm，长度0.25的茎尖。 普通茎尖（ Shoot tip ） ：由顶端分生组织及其下方的1-3个幼叶原基构成。,茎尖分生组织剥离,3.初代培养,注意GA的应用,4.分化培养,可以先诱导愈伤组织，然后在诱导分化形成苗。 茎尖培养可以与热处理和化学脱毒相结合。,5无病毒植株的鉴定,（）血清鉴定法 （）生物学鉴定法 （）电子显微镜检查法,（）血清鉴定法,原理：抗原与抗体结合，具有很强的特异性，一种病毒产生的抗体只能结合该病毒。 抗体：当动物被感染或人工注射异体蛋白时，会在动物体内产生一种特异性球蛋白免疫球蛋白，称抗体。 抗原；引起形成抗体的物质病毒或异体蛋白称为抗原。,（）生物学鉴定法,敏感植物：有些植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株上表现特有的病斑，把这种植物称为病毒“敏感植物”或“指示植物”。 摩擦接种法 嫁接法,（）电子显微镜检查法,6无病毒种苗的保存与利用,保存： 隔离种植保存 离体保存 利用：建立良种繁育场,病毒交叉保护：一种病毒存在，可以使寄主植物有能力抵抗另一种病毒。 植物对病毒的衍生抗性：当一株植物被非致病性病毒感染后，会表现出对其它致病性病毒的抗性。,病毒交叉保护现象,是指一种病毒的存在可使寄主植物有能力抵抗另一种病毒。,脱毒后的植物的感病性反而增强，会感染上致病性更强的病毒或真菌。其原因可能是寄主植株的营养和生理状态发生了改变。,日本曾经用通过茎尖培养得到的脱毒原种取代了受马铃薯X病毒（PVX）侵染的马铃薯品种后，造成了花叶病的严重泛滥。,植物对病毒的衍生抗性,当一株植物先被非致病性的病毒感染后，会呈现出对其它致病性病毒的抗性（不是由于免疫）。,如人们将TMV包膜蛋白基因转化植物，然后让TMV进行侵染，结果显示，转基因植物对多种类型的TMV都有抗性。,作 业,一 名词解释 离体快速无性繁殖 单株（芽）无性系 顶端分生组织 试管嫁接 褐变 玻璃化 指示植物,二 简答题 1 植物离体快速无性繁殖有那些特点？ 2 简述植物离体快速无性繁殖的一般程序及技术关键？ 3 简述植物病毒的特性及其在植物体内的分布特点？ 4 脱除植物病毒有那几种方法？并说明茎尖培养脱毒的原理及程序。,Xylemphloem vascular tissueground tissue dermal tissueepidermis,