疟原虫的镜检技术.ppt

疟原虫的镜检技术,采血时间 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 疟疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期五期。 间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。 发热期，外周血中以环状体（小滋养体）为主，也可见到裂殖体；出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。发作后数小时（h），间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机；发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20h内取血，初发患者退热后常查不到原虫。 末梢血血检到恶性疟原虫配子体，是在末梢血出现环状体之后的10天左右。,血膜的制作（涂片操作）,血膜的制作（取血操作）,在采集标本、制作血片前，首先要核对患者的姓名、年龄和住址。 采血部位和方法：采血部位一般人为耳垂，指头；一人一针，常规消毒、采血。,取血部位和血量,采血部位和取血方法： 耳垂或无名指（婴幼儿母趾或足跟），通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒大米（即火柴头）大小。 采血详细部位、取血方法有小技巧。,血膜的制作 用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。无特殊要求的可厚薄血膜分载玻片涂制。,发热病人血片,标本片,血膜的制作（涂片操作）,涂制厚、薄血膜的位置 通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片每片1人， 涂2个厚血膜1个薄血膜， 以防血膜脱落而影响检查；,标本片,发热病人血片,标签,薄血膜的制作,薄血膜 用推片一端边缘的中点从取血部分取约11.5微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25350夹角，待血液向两侧扩展约 2cm2.5cm宽时，均匀而迅速地从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。推制时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。薄血膜外观：舌状厚薄均匀，无划痕，位于玻片1/21/3处【左半部分（或第46份）】 。,熟练工作者的推片姿势,厚血膜的制作,厚血膜 用推片的左下角，从取血部位刮取约45微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81cm大小圆形厚血膜(厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到510个白细胞为宜)，厚血膜的位置，位于玻片右1/3处中央偏右（或6等份中的与贴标签的1、2份相邻的第3份中部） 。厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求，以油镜视野5-10个WBC为宜。,标准的疟疾厚薄血膜位置,各种不同的疟疾血片涂制法：,标准血片（1人）,门诊发热病人血片（1人）,居民普查血片（2人）,血膜的制作,血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码，以防差错；待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。,染液的种类,染液种类：疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏（Wright stain）和吉氏染液（Giemsa stain）。这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。 我们主要用吉氏染液，它具有方便，染色效果稳定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门诊量大的门诊实验室使用。,姬氏染液的染色方法,先用甲醇或无水酒精固定薄血膜,再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后再进行染色。 注意：吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果. 成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液1-2滴，加中性蒸馏水15-30滴，染色30分钟左右，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。 较理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。,操作1 （快染） 配制5%染液，（每张血片约需染液2ml）：量筒内量2ml缓冲液或新鲜凉开水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。（一般配制5%-10%，染色时间短，一定掌握好时间。） 操作2 (慢染)配制3%染液：在染色量筒内量2ml蒸馏水或新鲜凉开水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色3040min。清水细缓冲洗，晾干镜检。（一般配制2.5%-3%染液，染色效果稳定。）,吉氏染液浓度,门诊染色,全国疟疾镜检知识与技能竞赛 血片制作和染色质量评价标准 好血片制作质量: 厚血膜：血量 4.05.0ul,位置 玻片右13稍偏右,直径 0.81.0cm，外观 圆形厚薄均匀。 薄血膜：血量 11.5 ul，位置 玻片1213处，外观 舌状厚薄均匀；染色质量 外观兰紫色；清洁度 外观光洁无油灰。,疟原虫的镜下 形态及鉴别,人体疟原虫的基本结构,疟原虫基本构造为细胞质（胞浆）、核和疟色素这三要素。 1.细胞浆 被染成蔚蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大，细胞浆逐渐增多。 2. 核 即细胞核或染色质粒。在正常情况下核呈鲜红色。 3. 疟色素 不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异。间日疟原虫的色素颗粒呈短棒状，黄褐色；恶性疟原虫的色素颗粒呈细砂状，黑褐色。,薄血膜中间日疟、恶性疟 各期疟原虫的形态结构特点,薄血膜中常见的血液成分,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,血小板,单核细胞,淋巴细胞,红细胞,薄血膜疟原虫形态,间日疟 环状体 感染的红细胞：胀大不明显，基本正常。 虫体大小：较大，约为红细胞直径1/3。 胞浆：环状，浅蓝色。 核：红色，一个，偶有二个。 疟色素：无。,约占寄生红细胞的1/3，很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有2个核。,薄血膜疟原虫形态,恶性疟环状体 感染的红细胞：大小正常,颜色较深。 虫体大小：较小，约为红细胞直径1/5-1/6。 胞浆：蓝色，环状纤细,有时位于红细胞的边缘。常见多个原虫同寄生于一红细胞的现象。 核：红色一个,常有二个。 疟色素：无。,恶性疟原虫-环状体,环纤细,约为RBC直径的1/6，RBC不胀大 核1个，但2个常见，红细胞常含2个以上原虫,薄血膜间日疟大滋养体形态,感染的红细胞：胀大褪色，出现形状大小相等、分布均匀、数目较多、鲜红色的薛氏小点。 虫体大小：较大。 胞浆：不规则，浅蓝色，出现阿米巴伪足，有空泡。 核： 红色，一个。 疟色素：有，细小杆状，黄褐色，分布不均匀。,间 日 疟 大 滋 养 体,虫体不规则，较大；阿米巴样空泡明显；疟色素细小，黄褐色。,间日疟大滋养体,恶性疟大滋养体,受感染红细胞：大小正常，颜色较深，可出现较粗、大小不一、分布不匀、数目较少红色茂氏小点。 虫体大小：较小。 胞浆：蓝色，圆形，坚实，体积小。 核：一个，红色。 疟色素：较细的黑褐色颗粒，常集成块。,恶性疟大滋养体,红细胞：胀大，褪色，可有薛氏小点。 胞浆：较不规则，空泡小或消失，浅蓝色。 核： 红色，分裂为二个以上。 色素：黄褐色，分布不均匀。,间日疟未成熟裂殖体,薄血膜疟原虫形态,间 日 疟 未 成 熟 裂 殖 体,恶性疟未成熟裂殖体,红细胞：大小正常，颜色较深，可有茂氏小点。 大小： 较小。 胞浆：规则，圆形或卵圆形，蓝色。 核：分裂为二个以上，红色。 色素：黄褐色颗粒，常集成黑褐色团块。,间日疟成熟裂殖体,红细胞：胀大，褪色，可见薛氏小点。 大小：个体较大。 胞浆和核：裂殖子1224个，通常为1618个，排列不规则，核红色，胞浆浅蓝色。 疟色素：黄褐色，常集于疟原虫的一边。,间日疟裂殖体,恶性疟成熟裂殖体,红细胞：大小正常，颜色 较深，可见茂氏小点。 大小：虫体较小。 胞浆和核：裂殖子832 个，通常为818个， 排列不规则，核红色，胞浆蓝色。 色素：黑褐色，集中于中央或一侧。,恶性疟成熟裂殖体,裂殖子832个，通常818个，排列不规则 疟色素集中成团块状 虫体占红细胞体积的2/3至3/4,薄血膜间日疟雌（大）配子体形态,形状大小：圆形或椭圆形，较大。 胞浆：深蓝色。 核：一个，较小，深红色，常偏于一边，核周可见明显不染色带。 疟色素：黄褐色，均匀散在，数目较多。,间日疟原虫雌配子体,间日疟雄（小）配子体形态,形状大小：圆形，虫体较大。 胞浆：浅蓝色。 核：一个，较大，疏松，位于中央，浅红色，周围有明显不着色带。 疟色素：黄褐色，散在分布。,间日疟原虫雄配子体,恶性疟雌（大）配子体形态,形状：新月形，两端稍尖。 胞浆：深蓝色。 核：一个，较小，致密，深红色，位于中央，核周可见透明不染色带。 疟色素：黑褐色，密布于核的周围。,薄血膜恶性疟雄（小）配子体形态,形状：腊肠形，两端钝圆。 胞浆：浅蓝色或淡紫红色。 核：一个，较大，疏松，位于中央，浅红色，核周可见不染色带。 疟色素：黑褐色，松散分布于核周围。,将（未）成熟雌配子体与成熟大滋养体 (核分裂前，刚要进入裂殖体前期)的形态鉴别,虫体大小:几乎充满被寄生的红细胞 核:一个，较大且致密，周围有一圈空白的不染色带 胞浆:边缘清楚，不含空泡 疟色素:颗粒较多较粗，均匀散在,虫体大小:不超过被寄生红细胞的3/4 核:一个，延长呈带状，周围无明显的不染色带 胞浆:边缘不整齐，多有空泡 疟色素:颗粒较少较细，分布不均匀,厚血膜中间日疟、恶性疟 各期疟原虫的形态结构特点,厚血膜中疟原虫的形态,厚血膜由于用血量较多，涂制的血膜小，红细胞重叠且干燥慢，致使虫体皱缩，空泡消失，胞浆变形，各期疟原虫的体积都略微缩小，其中只有大、小滋养体的形态有较大改变，而裂殖体和配子体的形态则无明显变化。,INTITUTEOFTROPICALDISEAASESHAINAN,厚血膜环状体体形态,环状体： 胞浆呈环状或向核的一侧或两侧收缩，使环的中间断裂，或围绕核。间日疟原虫的环较大，常呈分号“；”和感叹号“！”状；恶性疟原虫的环纤细，常呈冒号“：”、飞鸟“.”、V状和断环状。,间日疟小滋养体,恶性疟小滋养体,厚血膜间日疟大滋养体形态,间日疟大滋养体呈阿米巴样运动，胞浆常断裂几块或缩成圆形，核和疟色素均被包在胞浆之中，着色深，只隐约可见红色的核和黄绿色的疟色素。胞浆可皱缩断裂成几个块状，大小不一，似互不连接。核位于胞浆之中或外边。疟色素分布不均匀。有些仅见胞浆和疟色素而核看不清楚。,大滋养体,厚血膜恶性疟 大滋养体形态,恶性疟原虫大滋养体与薄血膜形态相似，常呈圆形，体小结实，疟色素细小，金黄色，结成块状后，呈黑褐色。,大滋养体,厚血膜裂殖体形态,裂殖体 间日疟原虫、恶性疟原虫的裂殖体前期及成熟裂殖体，除虫体略微缩小着色较深外，均与薄血膜相似。,间日疟裂殖体,恶性疟裂殖体,厚血膜间日疟配子体形态,间日疟原虫的配子体呈圆形或卵圆形，除虫体略缩小且着色深外，均与薄血膜相似。雄配子体核大，疏松，圆形或呈星状，胞浆较少，着色淡，疟色素颗粒大，数量较多，散在分布。 雌配子体与圆形成熟的大滋养体相似，但配子体疟色素颗粒粗大，多而散在分布。,大配子体,小配子体,厚血膜恶性疟配子体 形态,配子体呈新月形或腊肠形，如血膜干燥较慢，则可缩成圆形，核居中，疟色素围在核周，外围一圈胞浆。此外，还可见配子体的胞浆部分或全部消失，只留下核和疟色素，或核和胞浆均消失，只留下一些疟色素。,大配子体,小配子体,恶性疟原虫厚血膜,厚薄血膜的优缺点及适用范围,薄血膜：用血量少1-1.5ul，疟原虫的形态完整，便于疟原虫虫种的鉴定。为保证检测的敏感性，常耗时较多，不适用于大规模调查；常出现漏诊。 厚血膜：用血量较多4-5ul，疟原虫胞浆和核有一定程度的固缩，较难识别；但须查范围小，节省时间，阳性检出率较高。,红细胞通常胀大 薛氏点明显 成熟环状体粗大 滋养体有阿米巴样伪足 可见不同发育期的原虫,间日疟（P. vivax ）鉴定要点,环状体钎细, 红细胞不涨大 一个红细胞内可有几个环状体 环状体内可有2个核 环状体可贴在红细胞边缘 血片中没有其他发育期滋养体 配子体呈新月形或腊肠形 可出现茂氏点,恶性疟（P.falciparum）鉴定要点,镜检示教与 读片练习,A typical Plasmodium falciparum presentation.,Numerous fine ring forms (大量环状体) Double chromatin dots (双核) Red cells are not enlarged（红细胞大小正常）,A typical Plasmodium vivax presentation,ring forms（环状体） trophozoite（大滋养体） Enlarged red cells （红细胞胀大）,2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago.,Trophozoite（大滋养体）,3. History of round the world safari including S. America, Asia and Africa. General malaise.,Plasmodiumvivax (间日疟) microgametocyte (雄配子体),4. Unspecified overseas travel. Presented with temperature 38.4C,Plasmodiumvivax (间日疟) Schizont (裂殖体),7. Aches and pains, with fever. ? Glandular Fever, ?malaria.,Ringform (环状体) Schizont (裂殖体),14. 50 year old male patient presented with fever after holidaying in Viet Nam.,P.Falciparum (恶性疟) Ringform (环状体),P.Falciparum (恶性疟) macrogametocyte (雌配子体),Plasmodiumvivax (间日疟) Trophozoite （大滋养体）,Schizont (裂殖体) Trophozoite （大滋养体）,Plasmodiumvivax (间日疟) microgametocyte (雄配子体),P.Falciparum (恶性疟) microgametocyte (雄配子体),小结：血片镜检中 鉴定是否为疟原虫的五条原则,1、疟原虫要有核有浆（红核蓝浆）。 2、疟原虫各期（除环状体外）均含有疟色素。 3、疟原虫自然形态要像；疟原虫呈半透明状态，模糊一团不透明者不是。 4、体积最大的疟原虫也不能超过中性粒细胞大。 5、数量极少，似是而非者判为可疑，应重新选择时机多次制片、多次检查，结合临床并交上级大夫鉴定或行药物试治。,谢谢大家,