活体生物发光和荧光成像技术应用讲座.ppt
1,活体生物发光和荧光成像技术 应 用 介 绍,wanchunlisciencelight.com.cn QQ 1055873363 021-68569108 13651886549 2014年10月28日,2,仪器结构与组成,3,NightOWLLB983,新一代分子成像设备NightOWL LB983 具有强大的活体组织发光影像分析能力。无论是对BLI荧光素酶系统产生的弱光信号还是BFI荧光染料或荧光蛋白所发出的荧光影像信号，NightOWL LB983都能为使用者提供可靠的清晰的检测结果并配有强大的科学分析软件对数据进行处理。,4,视野连续可调，自动聚焦,3.5 cm,75 cm,焦距(cm) 分辨率(µm) 3.5 50 75 320,5,3种荧光激发光源配件 环状照射装置 鱼尾型照射装置 鹅颈管照射装置 散射光滤光片 90 W 钨灯光源 200 - 1100 nm可选滤光片,荧光成像配件,6,气体流量计,麻醉气体蒸发器,诱导麻醉箱,输送管道,麻醉机组成,7,祛除宇宙射线和背景 视野校准 定量分析功能 原始数据与处理后数据分开存档（根据GLP规则） 三种图像输出模式,indiGoTM 功能强大的软件,伪彩图,灰度图,真彩图,8,成像原理与特点,9,目前的活体生物体内成像技术和方向,可见光及荧光成像 -生物发光 （Bioluminescence） 与荧光（Fluorescence） 正电子衍射成像（Positron-Emission Tomography，PET） -放射性标记葡萄糖导入体内，被分裂旺盛组织吸收，常用于检测肿瘤的良恶性 单光子衍射(Single-Photon-Emission Computed Tomography,SPECT) 超声（Ultrasound） - 物理学方法 计算机断层摄影（Computed Tomography ，CT） -断层扫瞄技术，X-ray的衍生，物理学方法 核磁共振（Magnetic Resonance Imaging ，MRI） -包括功能性核磁共振（Functional MRI，fMRI）, 心血管核磁共振（Cardio-vascular MRI ，cMRI），等等,10,几种常用活体体内成像技术的比较,结构成像,功能成像,操作复杂,操作简单,MRI 核磁共振,Optical Imaging 可见光成像,PET/SPET 正电子衍射,Ultrasound 超声,CT,11,理想的光源：萤火虫荧光素酶（luciferase）,基因、细胞、活体都可被荧光素酶基因标记。,活体生物发光成像系统原理,遗传学标记 实时、原位 多波长检测,标记癌细胞,标记细菌,标记转基因鼠,12,荧光素酶的表达,将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使荧光素酶得到持续表达。,启动子,染色体,体内表达,外源注入底物,活跃细胞,体内发光,13,标记细胞发光强度与定量分析,14,小鼠皮下总计1000个 细胞或每mm² 20个细胞可以很容易地被检测到，探测极限是一丛150 250个细胞.,生物发光活体成像方面的灵敏度,15,在微孔细胞板中少到10 个细胞可以检测到.,生物发光微孔板检测的灵敏度,16,如何提高灵敏度,Nature Medicine 2011年1月,17,平均肿瘤体积,平均相对光单位 对数值,生物发光光子数与肿瘤体积呈正相关,1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞 ，皮下注射,18,生物发光的应用,19,活体成像技术的主要应用,标记细胞 癌症及药物研究,标记病毒, DNA, RNA 病毒学及基因治疗,转基因动物模型,蛋白质相互作用、代谢、发育、内分泌学， 等等,标记基因,siRNA研究的应用,干细胞, 免疫,其它,细胞凋亡,组织特异性基因表达,标记细菌,20,体内药物分析的生物发光检测,1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射,14天,21天,28天,35天,雄性SCID小鼠,处理方式 细胞数,无治疗对照 2.2x109,5- FU治疗 2.8x108,丝裂酶素 3.6x106 治疗,小鼠 #6 n=7,小鼠 #40 n=8 (从第11天开始给药),小鼠 #31 n=8 (从第11天开始给药),21,对照组于第五周结束观察,生物发光强度,Exp #081 雄性nu/nu CR n=13,5,7,n=13,n=6/7,n=3/5,生物发光检测体内药物治疗的复发作用,5x105 ，PC3M-Luc-C6肿瘤细胞，原位前列腺癌,1周,3周,5周,7周,8周,生理盐水对照组 （小鼠#40） 静注，3次/周， 第二、三周,5-Fu治疗组 （小鼠#38）100 mg/kg 静注，1次/周， 第二、三、四周,丝裂酶素治疗组 （小鼠#4）2mg/kg 静注，3次/周， 第二、三周,22,肺癌模型,A549 原位肺癌 NIH 2010,23,乳腺癌原位接种,PNAS 2010,10,24,原位胰腺癌模型,2010,25,白血病模型,2×105 Arf-/-p185+luc+LICs. 2011年9月 BLOOD,26,BCL6 enables Ph1 acute lymphoblastic leukaemia cells to survive BCRABL1 kinase inhibition 2011年5月 NATURE,4 5 6 7 8 接种后周数,27,U87 脑胶质瘤成像 cancer research 2011,8,PTA of U87 human gliomas in mouse brains. A, representative bioluminescence images of nude mice bearing U87-TGL tumors with different treatments (see Materials and Methods).,28,骨肉瘤转移机理研究,第九人民医院,29,肿瘤转移,30,乳腺癌转移实验,中科院健康所 2011,31,利用转基因技术自发肿瘤的研究,MYC inactivation uncovers pluripotent differentiation and tumour dormancy in hepatocellular cancer NATURE 2004,32,cancer cell 2004 , 10,抗癌药物的临床前研究,33,抗体药物研究,CD137 stimulation enhances the antilymphoma activity of anti-CD20 antibodies,2011年10月 BLOOD,34,研究干细胞造血作用,Cao et al, PNAS 2004,Percent GFP+ Cells (corrected),80 70 60 50 40 30 20 10 0,FVB N1 N2 N3 N4 N5 P1 P2 P3 P4 P5 P6,Total leukocytes Granulocytes B cells T cells,Donor line crossed to FVB Cg-Tg a GFP Tg line,35,心脏内成像,BMCs with green fluorescent protein-FLuc were administered through the tail vein 24 hours after myocardial infarction. BLI demonstrated a greater number of BMCs homed to the periinfarct region in the double-knockdown group, with peak homing at day 7.,36,免疫治疗研究,EDINGER et al，2003，blood,Trafficking of CIK cells,37,当共转染 pGL3-luc 或HCV-luc 表达载体特异的 siRNA时， 可抑制报告基因Luciferase的表达,(McCaffrey et al. Nature, 408, 38-39, 2002. Copyright permission from Nature publishing group),抑制荧光素酶 (pGL3-control),抑制丙型肝炎病毒 (pShh1-Ff1),38,外源质粒在体内表达,中国军事医学科学院 2010,质粒p GL3-LUC质粒，通过水动力方法注入小鼠体内后，在肝脏中与luciferase反应后大量表达,39,实验性心内膜炎症的抗生素筛选大鼠模型,对照组,vancomycin,vancomycin,cefazolin,gentamicin,40,细菌的感染模式研究,Membranous Cells in Nasal-Associated Lymphoid Tissue the Respiratory Mucosal Pathogen Group A Streptococcus1,41,基因治疗载体的构建,AdTSTA-FL的表达活性比AdCMV-FL高100倍以上,AdTSTA-FL（107）,AdCMV-FL（107）,Days 5 7 10 13,×103,×105,42,A genetically humanized mousemodel for hepatitis C virus infection,NATURE 2011年6月,43,体内蛋白质-蛋白质之间的相互作用,LUC N端 与 C端 分开时并不发光 蛋白质A 与蛋白质B 分别与LUC N端 和 C端 连接 两组蛋白由不同的质粒诱导表达,蛋白A,蛋白B,Luc N端,Luc C端,蛋白A,蛋白B,Luciferase,发光,相互作用,+,44,活体动物体内观察细胞凋亡,LUC,I,I,LUC,I,I,Laxman, et al PNAS V.99,Caspase site,Caspase site,发光,Apoptosis,Caspase 表达,45,活体动物细胞及组织特异性基因表达,构建双重标记的细胞株(RENILLA & FIREFLY LUCIFERASE), 识别不同底物的发光酶 研究基因的启动子控制 FIREFLY LUCIFERASE 表达, 与兴趣基因平行表达. RENILLA LUCIFERASE 作为内参, 标记细胞数量,RENILLA Luc,FIREFLY Luc,Pc,Ren Luc,Fir Luc,P53,发光,发光,46,荧光和量子点标记的应用,47,4H9在荷瘤小鼠中的分布 (U87V3),50µg cy5.5 labeled 4H9, i.v.,2hr,6hr,24hr,仰卧,右侧卧,48,GFP标记的肺癌皮下模型,NightOWL LB 983 上海肿瘤研究所 2007年,第1周,第2周,第3周,第4周,49,药物的肿瘤靶向性研究,复旦药学院 2007年11月,荧光染料标记药物载体，识别未标记的肿瘤,50,荧光染料（Cy5.5)标记的探针对肿瘤细胞的识别,NightOWL LB 983 上海肿瘤研究所 2007年,51,量子点标记成像,注射部位：右侧前爪皮下注射；量子点聚集区域：腋下淋巴结，利用gooseneck spot illumination作为激发光源，光能40%,52,转基因动物的应用,53,基因激活 表达 生物发光,研究者可通过观察动物模型的生物发光，判断靶基因是否表达，既基因的“开”“关”现象。,转基因动物模型原理,生物大分子合成,54,血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular endothelial cell growth factor receptor 2, VEGFR2）是 VEGF的同源受体，VEGF在血管生成过程中分泌。Vegfr2-luc转基因小鼠应用从小鼠VEGFR2基因启动子及内皮细胞特异的增强子共4.5kb，以驱动荧光素酶表达。,转基因动物研究原理,55,通过观察发育过程中,VEGFR2-Luc转基因小鼠的VEGFR2表达逐渐降低,研究生物体发育过程,信号强度,56,药物诱导的IL-1基因表达,南方模式动物中心与德国Berthold公司 2007年于上海,对照组,药物组,57,荧光素酶基因标记的肿瘤细胞,58,荧光素酶基因标记的肿瘤细胞,59,谢谢大家 Thank You,
