单源抗体制备与应用.ppt
單源抗體製備與應用,李龍湖 國立中興大學獸醫學系教授 95年10月12日,抗體（Antibody, Ab） 抗原（Antigen, Ag） 半抗原（Hapten） 抗原決定位（Epitope）,多價抗體（Polyclonal Ab） 抗體溶液中含有兩種以上不同抗體分子 單源（株、價）抗體（Monoclonal Ab） 抗體溶液中僅含一種抗體分子 抗原特異性抗體（monospecific Ab） 屬於多價抗體 抗體共同確認特定抗原,抗體特性比較,單 源 抗 體 發 展 背 景,1. B細胞 B細胞（淋巴球）是產生抗體的細胞 每一個B細胞產生一種抗體分子 脾臟或淋巴結之細胞培養約7天 製造分泌標的抗體分子 2. 骨髓瘤細胞（Myeloma cell, NS1, SP2） B腫瘤細胞（自然發生） 製造分泌未知抗體分子 可株化成株代細胞（cell line） 3. 細胞融合技術（cell fusion） 上述兩種細胞融合成融合瘤細胞（Hybridoma）,MAb製備流程圖,1. 細胞融合（脾臟細胞骨髓瘤細胞） 抗原 BALB/C小白鼠 PEG融合劑 培養液（RPMI 1640, DMEM） HAT試藥 骨髓瘤細胞（NS1, SP2） 2. 陽性細胞株篩選與確認 ELISA IFA Western blot 雙重確認,3. 細胞株化 極限稀釋（Limited dilution） 餵飼細胞 陽性細胞再確認,4. 單源抗體定性 Isotype 鑑定 免疫沈澱（和抗原特異性結合） 抗體濃度 生物活性測定（如中和作用） 和抗原決定位結合（線狀或構型抗原決定位）,5. 單源抗體生產與純化 A 細胞上清液收集及抗體純化 抗體濃度低（小於 1 mg/ml） 不含胎牛血清培養液 B BALB/C 小白鼠生產抗體 Pristane處理，一週後注射融合瘤細胞 採集腹水，純化抗體 抗體濃度高（通常為數個 mg/ml）,6. 細胞保存和解凍 保存液含胎牛血清和抗凍劑10 % DMSO 連續降溫 溫度越低，保存越久 迅速解凍 隔天觀察生長情形及換液,7. 細胞污染或生長不良處理 黴漿菌污染 抗生素，抗黴菌劑使用 小鼠腹腔接種,單 源 抗 體 應 用,研究 治療：濃度高，動物使用多 免疫藥理學，免疫基治療等 檢驗試劑 : 病原 食品 藥（毒）物 蛋白質等,實 例,家禽Reovirus非結構蛋白NS抗原決定位分析 細菌表現蛋白NS 免疫 細胞融合 抗體篩選：ELISA，間接螢光抗體染色 細胞株化及確認 抗體定性,Table1. Properties of monoclonal antibodies directed against the nonstructural protein NS of ARV-S1133,*Concentration of ascitic immunoglobulin precipitated with ammonium sulfate was determined according to Bio-Rad Standard Assay Procedures.,N: Native NS PC: Polyclonal antibody D: Denature NS NC: Normal control serum,V: Virus-infected cell extracts C: Mock-infected cell extracts 1 to 10: Immunoprecipitates with MAbs 1: 47C, 2: 4A21, 3: 4A125, 4: 4A23, 5: 1F9, 6: 4B9, 7: Gall, 8: 4A123, 9: 5F9, 10: H1E1,Table2. Results of competitive binding assay between monoclonal antibodies to ARV-S1133 nonstructural proteinNS,Competition more than 60%, +; competition between 35% and 60%, +; competition less than 35%, -. Epitope recognized by MAbs 5F9 and Ga11 was not classified (U).,1. Poly(A)-sepharose + NS 2. NS + MAbs (1:5) 3. NS + MAbs (1:500) 4. NS + MAbs (1:5000) 5. Normal serum + NS 6. NS + anti-NS Ab 7. Sepharose + NS 8. Sepharose + NS + MAb1F9,MAb capture ELISA for detecting Ab to ARV NS MAb 1E1,Antigen 1. Expressed ARV NS (eNS ) Coating MAb + Crude eNS preparation Coating purified eNS 2. Virus-infected CEF lysate Coating MAb + cell lysate Coating cell lysate 3. Conventional ELISA,MAb capture ELISA (crude eNS preparation),
