1、SARSCoVS蛋白与眼部ACE受体作用机制的探讨SARS-CoVS240蛋白与眼部CE2受体作用机制的探讨【摘要】目的：探讨SARS冠状病毒(SARS-CoV)S210蛋白与眼部功能性受体一血管惊慌素转化成2(ACE2)作用的机制。方法:构建SARS-CoVS蛋白融合基因pS240-EGBP,并在哺乳动物细胞中表达：半定量RT-PCR和免疫组化鉴定CE2在结膜、角膜中的表达；朝联免疫吸附试验、流式细胞仪检测法进行SARS-CoVS240蛋白与结膜、角膜细胞的体外结合探讨。结果：构建了融合基因pS240-EGFP;证明ACE2在结膜、角膜有表达;结膜、角膜细胞与SARS-COVS240蛋白能够
2、结合。结论：结膜、角膜中存在SAKS冠状病毒的功能性受体，SARS-CoVS240蛋白与结膜、角膜细胞能够结合。本探讨对了解SARS的病理机制及进一步探讨SARS的防护和治疗具有肯定的参考意义。【关键词】严峻急性呼吸综合征冠状病毒S240蛋白受体血管惊慌素转化旃2结合作用O引言非典型肺炎即严峻急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndrome,SARS),具有高度传染性与致病性，其致病因子为一种新型冠状病毒一SARS冠状病毒(SARS-CoV),基因组结构为:5-帽状结构-复制酶(rep)-棘突糖蛋白(三)-小包膜蛋白(E)-膜糖蛋白(V)-核衣壳蛋白(N)一多聚核昔
3、酸(PoIyA)尾-3。S蛋白介导了病毒与宿主细胞的结合，SARS-CoV的功能性受体是血管惊慌素转化前2(angiotensin-convertingenzyme2-CE2)本探讨用293T细胞表达出了包含SARS-CoVS蛋白结合功能区域的pS240-EGFP融合蛋白片段，体外培育了人结膜、角膜细胞，检测了SARS-COV的功能性受体ACE2在人结膜、角膜中的表达，并进行了非洲绿候肾细胞(VeroE6Cell),人结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞与SARS-CoVS240-EGFP融合蛋白片段的体外结合试验探讨。1材料和方法1.1材料SARS-CoVS(基因组原型GenBank登
4、录号为：AY278554)基因片段S1(1-1650nt)DNA片段。ACE2引物序列(accessionnumberF291820):上游引物5-CTTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3,下游引物5-GGCTTGCTGCCTTCTC-3,扩增片段长度为107个碱基。GAPDH:上游引物5-TGGGCTACACTGAGCAeCAG-3,下游引物5-GTGGTCGTTGGGGCT-3,扩增片段长度为100个碱基。由上海博亚生物工程公司合成。PCR产物克隆载体pMD-18T(TaKaRa公司)：质粒PEGFPTl（Clontech公司）；脂质体转染试剂1.ipofectamineTMRea
5、gent（Invitrogen公司）：MammalianProteinExtractionReagent哺乳动物细胞蛋白抽提液（PIERCE公司）；SBC-P免疫组化染色试剂盒（Santa-Cruz公司）：SARS患者复原期血清（运用前经56C加热30min进行灭活,获自北京小汤山医院与解放军309医院）。主要抗体：角蛋白KeratinPan,波形蛋白Vimcntin,神经纤维丝蛋白NFkappaB（上海友情中联生物工程有限公司）：抗鼠辣根标记的二抗（上海华美生物工程有限公司）；羊抗人ACE2多克隆抗体（RD公司）。组织来源：36mo中期引产胎儿的角膜、结膜、心、肺组织，男女不限；成人眼球裂开
6、伤摘除的角膜和结膜组织：尸体解剖的成人心、肺、脑组织由长海医院供应。1.2方法1.2.1pEGFP-Nl及pS240-EGFP融合蛋白的表达PCR引物：SR:5,-GTTCGCCCCTGCGCCTCTTTTCGGGTTG-3,（斜体为EcoRI的切位点）：SRR:5-TCTGA11GGGTCCTCTCGGGGGTTCCCCGTAC-3（斜体分别为XbahBamHEXhOl的切位点）。基因工程方法构建真核表达质粒pMD-S240,进一步构建pS240-EGFP融合蛋白表达质粒。利用脂质体介导转染法将PEGFP-N1、pS240-EGFP分别转染293T细胞并进行克隆培育；细胞蛋白抽提液裂解细胞并
7、进行透析，荧光分光光度计检测透析前后荧光光度值：BrafOrd法检测蛋白质浓度；WesternBlot法分析基因表达产物。1.2.2CE2在人结膜、角膜的表达体外培育人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞、结膜成纤维细胞并行E1.ISA法鉴定。抽提组织（或细胞）的总RNA,鉴定RNA纯度、浓度和完整性:半定量RT-PCR；琼脂糖凝胶电泳；经熨日紫外及可见图像识别分析系统（上海复口科技公司）进行电泳条带光密度扫描，以光密度积分值比值ACE2GAPDH代表mRNA的表达水平,试验重复3次，数据运用SAS软件包处理。免疫组化法检测组织、细胞中ACE2的表达（SABC法1.2.3S240-EGFP蛋白与各组织、
8、细胞的结合免疫酶标技术E1.ISA法：透析的各种组织及细胞蛋白抽提液与S240-EGFP蛋白进行结合试验,分别运用脑组织和Hela细胞及EGFP蛋白作为阴性比照，运用ACE2抗体进行阻滞探讨。对所得的A450值进行统计分析，运用SAS软件包，采纳析因方差分析。流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞与S蛋白的结合：检测结合后的荧光细胞2结果2.1pEGFP-Nl及pS240-EGFP融合蛋白的表达质粒琼脂糖凝胶电泳（图1）与DNA测序鉴定证明SARS-CoVS240-EGEP融合基因构建正确。转染的293T细胞在4-IOh内视察到绿色荧光，12h后可视察到明显荧光。其中PEGFP-NI转染细胞的荧光较p
9、S240-EGFP转染细胞的荧光稍强，细胞形态呈圆形（图2）。SARS-CoVpS240-EGFP基因表达产物的SDS-PAGE及WesternBlot分析：相应分子质量处出现蛋白表达条带，与理论推算值相符。2.2CE2在人结膜、角膜的表达培育的人结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞（图3）,ElJSA法鉴定细胞属性正确。抽取总RNA样品的浓度在O.120.5g1.之间、完整性良好、A260/280比值为1.82.0之间的抽提样本,进行RT-PCRe半定量统计结果认为成人肺组织、成人心组织、成人结膜组织与成人角膜组织间及Vero细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞与角膜上皮细胞间ACE2-
10、x与GAPDH-X的比值间的差异有统计学意义;Ievene法进行组间两两比较结果除了结膜上皮细胞与角膜上皮细胞间无显著差异外，其他各组织、细胞间均有显著差异（图4）。免疫组化法检测组织、细胞中ACE2的表达结果见文献1。2.3S240-EGFP蛋白与各组织、细胞的结合免疫酶标技术E1.ISA法：细胞及组织蛋白抽提液浓度为IOmg/1.时，结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、结膜、角膜组织的蛋白抽提液与pS240-EGFP蛋白出现了比较明显的阳性结合反应，与VeroE6细胞及心、肺组织蛋白抽提液相比稍弱：He1.a细胞和脑组织蛋白抽提液与pS240-EGFP蛋白均没有出现阳性结合反应。相
11、同浓度的上述组织、细胞蛋白抽提液中分别加入PEGFP-Nl蛋白，均没有出现阳性结合反应。空白比照组为阴性反应。相同浓度的VeroE6细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、心、肺、结膜、角膜组织蛋白抽提液被ACE2抗体孵育后，与pS240-EGFP蛋白没有出现阳性结合反应(图5。用析因方差分析比较S240和EGFP在不同浓度(lmg1.和10mg1.)下与结膜上皮细胞、Ver。、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、He1.a的结合实力,结果显示:S240-EGFP的结合实力比EGFP强，均数分别为0.2676,0.0092,IOmgZ1.浓度比lmg1.浓度结合实力强，均数分别为0.266
12、3,0.0105o在比较的各种细胞中,Vero的结合实力最强,均数为0.2661,结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、结膜上皮细胞的结合实力相当，均数分别为：0.1393,0.1392,0.1377,Ue1.a的结合实力最差，均数为0.01o经过比较，以IOmgZ1.浓度的S240与Vero的结合实力最强，均数标准差为1.03190.0072。用同样的方法比较S240和EGFP在不同浓度(lmg1.和10mg1.）下与心、肺、结膜、角膜、脑5种组织的结合实力，结果如下：S240的结合实力比EGFP强,均数分别为0.3190,0.0071,10mg1.浓度比lmg1.浓度结合实力强，均数分别为0.31
13、77,0.0084O在比较的各种组织中，心、肺组织的结合实力最强（二者无差异），均数分别为02653,0.2648,结膜组织和角膜组织的结合实力为其次（二者无差异），均数分别为：0.1395,0.1389,脑组织的结合实力最差,均数为0.0067。经过比较，以10mg1.浓度的S240与肺组织、心组织的结合实力最强，均数标准差分别为1.03660.0070,1.03650.0060。流式细胞仪检测结果显示：从细胞荧光指数视察，VcroE6细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞与pEGFP-Nl蛋白均没有明显的结合：VeroE6细胞与pS240-EGFP蛋白出现了较明显的结合，结膜上皮
14、细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞与pS240-EGFP蛋白也表现出肯定的结合，但较VcroE6细胞明显要弱：上述细胞预先被ACE2抗体孵育后，与pS240-EGIT蛋白的结合明显被阻滞:而CE2同种异型抗体没有能够阻滞上述细胞与pS240-EGFP蛋白的结合（图6）。3探讨呼吸道病毒能够侵扰眼部，引起眼部的感染，如病毒性结膜炎和角膜炎等，WHO把泪液作为可能藏有SARS-CoV的体液之一。许多医务工作者如眼科医生与患者的眼部近距离接触，可能形成SARS-CoV在医务工作者和患者之间的传播:还有可能通过应用眼部检杏设备，造成病毒在患者之间的传播。因为SARS-CoV的高传染性和高致病性，目前大
15、多数有关SARS-CoV的探讨无法运用真正的活病毒来进行，替而代之的是构建SARS-CoV的结构或功能蛋白，从蛋白质水平进行相关的探讨。SARS-CoVS蛋白属于I型膜蛋白，为1255个城基酸残基组成的病毒表面突起糖蛋白前体，以三聚体形式存在，是构成病毒表面冠状结构的主要成分，也是病毒和宿主细胞受体结合及病毒诱发机体产生抗体或细胞性免疫反应的重要因子，S蛋白识别和结合宿主细胞上的受体主要借助于其N端的Sl片段2,3。Wong等4探讨显示在S318-510之间集中了SARS-COVS蛋白受体结合区域，比全长Sl蛋白具有更好的可溶性和折桎性，能更有效地结合ACE2及阻滞S蛋白介导的病毒与细胞之间的
16、结合。1.i等5,Xiao等6,Wong等4,已经利用人肾细胞株293或293T细胞表达了重组的全长S蛋白或S蛋白片段，并将其应用于SARS-CoVS蛋臼的结合探讨。这里，我们胜利构建了包含SARS-CoVS蛋白结合功能单位的S240-EGFP融合蛋白，并将其在293T细胞中进行了表达。通过克隆培育转染阳性的细胞，提高了融合蛋白的得率，同时也提高了细胞蛋白抽提液中目的蛋白的浓度，为开展SARSYoV眼部入侵途径的探讨建立了初步的技术平台。SARS是一种高度传染性的疾病，主要是通过空气中的匕沫传播和粪便传播，侵扰下呼吸道，进一步导致肺损害和呼吸窘迫7,除此之外的传播途径目前还不清晰，尚没有临床资
17、料发觉SARS患者有角膜、结膜感染的眼部并发症出现。人类组织中ACE2表达的定位论证可以间接地推断SARS-CoV的感染途径和可能的体内传播和复制路途，实时定量PCR8T2及免疫组化探讨表明13ACE2在人肺和小肠上皮细胞中大量表达，提示SARS-CoV入侵可能途径为呼吸道和胃肠道。本探讨用半定量RT-PCR和免疫组化的方法鉴定了ACE2在人结膜和角膜组织中的表达及不同组织间表达的差异，证明人角膜和结膜组织及人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞和结膜成纤维细胞中存在CE2的表达，但表达量较人心、肺组织和VeroE6细胞要少。探讨表明2,3,5,1478,ACE2的表达量的多少与细胞与SARS-CoVS
18、蛋白的结合实力有肯定关系，而细胞结合探讨中人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞和结膜成纤维细胞与SARSYoVS蛋白结合的实力与VeroE6相比明显要弱，这一结果与半定量RT-PCR的探讨结果相符。分析缘由可能还有：结膜和角膜细胞中ACE2的表达主要位于胞浆，细胞膜上表达较少，无法充分发挥受体的功能；我们构建的pS240-EGFP蛋白片段是通过转染的细胞裂解、抽提蛋白质而得到的，蛋白片段较大，而且没有进行蛋白质纯化，肯定程度上影响了其与CE2受体的结合；已经有一些探讨证明13,19-21,虽然有些细胞和组织含有ACE2的表达，但是并没有发觉这些细胞和组织中有SARS病毒的复制和基因表达，其中的原理尚不
19、非常明确，可能与病毒入侵这些组织和细胞须要某些协助因子或复合受体有关：虽然新加坡22的探讨人员已经发觉SARS患者的泪液中存在SARS-CoM,但目前尚没有临床资料证明SARS患者出现病毒性结膜炎和角膜炎的并发症，这些与我们的探讨结果有某些相像。当然，假如能够利用非洲绿猴等SARS-CoV易感动物进行SARS-CoVS蛋白的在体结合探讨甚至进行SARS-CoV活病毒的在体探讨则能更加确凿地得到SARS-CoV眼部亲嗜性的证据。【参考文献】1孙琰,潘欣，柳林,倪灿荣.SARS-CoVS蛋白功能性受体CE2在人、兔角膜、结膜中的表达.眼科新进展,2004;24:232-2362WangP,Chen
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34、63Pp三严三实开展以来，我仔细学习了习近平总书记系列讲话，研读了中心、区、市、县关于党的群众路途教化实践活动有关文件和资料。我对个人四风方面存在的问题及缘由进行了仔细的反思、查摆和剖析，找出了H身存在的诸多差距和不足，理出了问题存在的缘由，明确了今后努力的方向和整改措施。现将比照检查状况报告如下，不妥之处，敬请各位领导和同志们指责指正。一、存在的突出问题一是学习深度广度不够。学习上存在形式主义，学习的全面性和系统性不强，在抽时间和挤时间学习上还不够Fl觉，致使IiI己的学习无论从广度和深度上都有些欠缺。学习制度坚持的不好，客观上强调工作忙、压力大和事务多，有时不耐性、不耐烦、不耐久，实则是缺
35、乏学习的钻劲和恒心。学用结合的关系处理的不够好，写文章、搞材料有时上网拼凑，求全求美求好看，结合本单位和实际工作的实质内容少，好用性不强。比如，每天对各级各类报纸很少刚好去阅读。因而，使自己的学问水平跟不上新形势的须要，工作标准不高，唱功好，做功差，忽视了理论对实际工作的指导作用。二是服务不深化不主动。工作上有时习惯于按部就班，习惯于常规思维，习惯于凭老观念想新问题，在统筹全局、分工协作、围绕中心、协调方方面面上还不够好。存在着为领导服务、为基层服务不够到位的问题，参谋和助手作用发挥得不够充分。比如，到乡镇、部门、企业了解状况，有时浮皮潦草，不够全面系统。与基层群众谈心沟通少，没有真正深化到群
36、众当中了解一线状况，驾驭的第一手资料不全不深，书到用时方恨少，不能为领导决策供应更好的服务。三是工作执行力不强。日常工作中与办公室同志谈心谈话少，对干部思想状态了解不深，疏于管理。办公室虽然制定出台了公文办理、工作守则等规章制度，但执行的意识不强，有时流于形式。比如，办公场所禁止吸烟，这一点我没有严格执行，有时还在办公室吸烟。四是工作创新力不高。有时工作上习惯于照猫画虎，工作只求过得去、不求过得硬，存在着求稳怕乱的思想和患得患失心理，导致工作上不能完全放开手脚、甩开膀子去干，缺少一种敢于负责的担当和气魄。比如，做协调工作，有时真成了传话筒和二传手，只传达领导交办的事项，缺乏与有关领导和同志共同
37、商讨如何把事情做得更好，创建性地开展工作。五是深化基层调查探讨不够。工作中，有时忙于详细事务，到基层一线调研不多，针对性不强,有时为了完成任务而调研，多了一些官气、少了一些士气。往往是听汇报的多，干脆倾听群众看法的少；了解面上状况多，发觉深层次问题少。比如，对县委提出的用三分之一时间下基层搞调研活动，在实际工作中却没有做到。即使下基层，有时也是走马观花，蜻蜓点水，让看什么看什么，让听什么听什么。在基层帮扶工作上，有时只注意出谋划策，抓落实、抓详细的少,对群众身边的一些小事情、小问题关切少、关注不够。六是主观能动性发挥不够。Fl认为在办公室工作多年，已经能够胜任工作，有自满心情，缺乏俯下身子、虚
38、心请教、不耻下问的看法。对待新问题、新状况，习惯于依据简洁阅历提出解决方法，创新不足，主观上存在满意现状，不思进取思想，主观能动性发挥不够。七是对工作细微环节重视不够。作为办公室负贡人，存在抓大放小，不能做到知上、知下、知左、知右、知里、知外，有时在一些小的问题上、细微环节上没有做好，导致工作落实不到位，出现偏差。八是工作效率不是很高。面对比较繁重的工作任务，工作有时拈轻怕重、拖拉应付、不够仔细。存在不推不动、不够主动，推一推动一动、有些被动。比如，文稿材料的撰写，有时东拼西凑、生搬硬套、缺乏深化思索。有时也存在着推诿扯皮现象，不能刚好完成，质量也难以保证。对于领导交办的事项，有时跟踪、督导的
39、不够，不能刚好协调办理，缺乏应有的紧迫感，缺乏开拓创新精神，致使工作效率不高。二、产生问题的缘由分析仔细反思和深刻剖析自身存在的问题与不足，主要是自己没有加强世界观、人生观、价值观的改造，不注意提高自身修养，同时受社会不良风气的影响，在详细应对上没有很好地把握Fl己，碍于情面同流合污。产生问题的缘由主要有以下几方面。（一）H身放松了政治理论学习。对政治理论学习的重要性相识不足，重视程度不够。尤其是在处理工作与学习关系方面，把工作当成硬任务，把学习当作软指标，对政治理论学习投入的心思和精力不足，缺乏自觉学习的主动性和主动性。（二）宗旨意识有所淡化。由于乡镇工作比较辛苦，从基层回到机关工作后，产生
40、了松口气的念头，有时不自觉产生了优越感和傲慢自满的心情。听惯了来自各方面的赞誉之声，深化基层少，对群众的呼声、疾苦、困难了解不够，没有树立较强的大局意识和贡随意识，使得自己有时会片面地认为只要做好本职工作，完成领导交办的任务就行了，而未能完全发挥自身的主观能动性，缺乏做好工作应有的责任心和紧迫感。（三）忧患意识不强。只是片面看到了Fl身工作生活环境的改变，吃苦耐劳的精神有些缺乏,开拓进取、奋勉有为、敢于冲锋、勇于担当的锐气有所弱化。有做太平官的意识，身处领导岗位，求新、求发展意识薄弱，表率作用发挥得不够好，忽视了工作的主动性、主动性和创建性。（四）勤政廉洁意识有所弱化。随着自身经济条件的改善，
41、降低了约束标准，勤俭节约的传统美德有些淡化，对奢侈之风的极端危害性相识不足，没有引起高度重视。诚然，造成自身存在问题的缘由远不止这些，还有许多，如自身的固化思维方式，缺乏居安思危的深层次思索等。三、今后的努力方向和改进措施音摆问题，剖析根源，关键在于洗澡治病、解决问题。本人决心从党性原则动身，端正看法、仔细对待，在今后的工作中实行强有力措施，立行立改，取得实效。(一)求真务实办公室主任作为承上启下、协调全局、沟通内外的重要角色，要立足发展、改革的新形势、新状况，以务实的作风和良好的品质做出表率。一是增加大局意识。要站在全局高度想问题，立足本职岗位做工作。要注意换位思索，真正做到想领导之所想、谋
42、领导之所谋，及早提出比较成熟的看法和建议，供领导决策参考。要擅长从纷繁困难的事务性工作中解脱出来，理清思路，明确目标，发挥自己应有的作用。二是增加超前意识。要仔细探讨领悟组织意图和领导思路，围绕领导关切的重大问题进行广泛深化的调查探讨，为领导决策供应真实状况和牢靠依据。要广泛搜集资料，探讨各乡镇、机关单位的新状况、新阅历、新做法，借他山之石来攻玉，为领导提出决策预案。因此，在想问题、办事情时，要赶前不赶后，尽可能早半拍、快半拍，提高敏感性，增加主动性。唯其如此，才能变被动为主动，参谋才能参在点子上，助手才能助到关键处。三是增加创新意识。要强化服务理念，做深、做透、做好服务工作：要以协调、协作作
43、为服务的主要手段和方法，做到服务不越位；要围绕解决难点和热点问题开展服务，切实通过服务和协调把大家普遍关切、关注的热点焦点问题解决好，以实际行动取信于民。（二）勤政为民办公室既是实行县委、政府决议的执行部门，也是督促落实县委、政府决议的监督部门。破除官僚主义，勤政为民应当做好四件事。一是擅长走进群众。从群众中来，到群众中去，是党的各项工作能够取得胜利的一大法宝。开展群众路途教化活动，破解官僚主义，依靠的依旧是人民群众。工作中，要力戒高高在上、脱高群众、脱离实际的官老爷做派，多与群众接触，从群众中吸取才智和力气，养成问计于民的好习惯。二是勇于解难事。务实从严，是每个党员干部对待工作的正确看法。要
44、把这种看法落实到每一项工作中去，要戒除贪图淫逸、讲求舒适、怕吃苦、饱食终口、无所作为的不良作风，担当起肩上的责任，做到为官一任，作为一方。三是简化办事程序。要急群众所急、想群众所想，尽最大可能提高办事效率，加快办事速度，一切从实际动身，勤俭从政，效率为先。四是接受监督。联系群众更要信任群众，加强民主更要多听民声。工作中时时到处境当考虑到群众利益，自觉主动接受群众监督，让工作开展得更有人气和活力。（三）艰苦奋斗要统筹制定领导干部办公用房、住房、配车、秘书配备、公务接待等工作生活待遇标准，落实不赠送、不接受礼品的规定，切实解决违反规定和超标准享受待遇的各种问题。要结合治治病的要求，依据中心八项规定，边学边查边整改，比照镜子，深挖思想根源，净化心灵，掘弃享乐主义，坚持艰苦奋斗，以良好的精神状态和奋勉有为的面貌赢取人民群众信任。（四）廉洁自律作为党员干部，无论什么时候，群众本色不能变，群众情怀不能淡。要自觉加强党性修养，牢记一心一意为人民服务的宗旨，净化思想、洗涤灵魂、增加党性、明确航向。在始终保持为人民服务中追求高雅的生活情趣、锻造健全和谐的心理状态、
