免疫共沉淀技术.ppt

威斯腾生物技术中心,免疫共沉淀技术,定义及原理 操作流程 优点和不足 注意事项 应用及实例 展望,定义及原理,免疫共沉淀定义 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP)也称免疫共吸附或免疫下拉技术，能够从细胞裂解物中特异性的分离并富集目标蛋白。 CO-IP是通过抗原抗体之间的专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法。也是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。,基本原理 在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的偶联于sepharose beads上的proteinA/G,与细胞中的抗体结合，形成一种复合物：目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗体-proteinA/G,经过变性凝胶电泳，复合物分开。 最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白。,原理流程示意图,操作流程,免疫共沉淀实验流程 (1)蛋白样品准备 （如果为细胞样品需先裂解） (2)抗原抗体结合反应 (3)Protein A/G 与抗原抗体复合物结合 (4)免疫复合物与protein A/G 解离 （2%SDS煮沸处理） (5)分析鉴定 （Western Blot或质谱分析）,实验流程如图所示,优点和不足,优点 1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为影响。 缺点和局限性 1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用 2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用,应用及实例,应用领域： 免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和MS质谱分析鉴定准备样品。 应用范围: 1.寻找新的相互作用蛋白 2.验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用,实例,鼻咽癌细胞中p53相结合蛋白的 分离和鉴定 P53基因是一种人体抑癌基因，人体癌症一半由于该基因突变失活 1.抗P53抗体与HEN1和HEN2细胞总蛋白进行免疫共沉淀。 2.SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物 3.切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱分析，得到相应肽列标签 4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究,染色质免疫沉淀 (CHIP),研究体内DNA蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。,CHIP原理,在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物 将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段 通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段 对目的片断的纯化与检测,操作步骤,一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质DNA复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。 二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。 三、纯化与检测 经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.,注意事项,超声波破碎条件的选择 抗体量的选择 PCR反应条件的选择,Input对照 阳性对照：如组蛋白抗体 阴性对照：阴性引物,条件选择,对照设置,基因表达:反式因子和顺式作用元件之间相互作用。 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。 研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径。,谢 谢 ！,