DNA加合物诱导DNA损伤产生激酶DNA-PK、ATM和ATR对细胞周期调控信号通路分析.ppt

DNA加合物诱导DNA损伤产生激酶DNA-PK、ATM和ATR对细胞周期调控信号通路分析,立项依据,环境、致癌物、化疗药物、生物病毒等可诱导哺乳动物细胞内DNA损伤。DNA损伤时机体可通过自身的修复系统进行损伤修复。细胞内通过延长基因关卡和阻止细胞周期进程来为修复系统作用时间。其中涉及多条信号通路和多种细胞周期蛋白、辅助因子及相关调控蛋白。可以通过提取哺乳细胞核提取物和用苯并蓖二醇环氧化物（BPDE）等加和物处理的质粒DNA在体外实验来验证激酶DNA-PK和ATM对细胞周期的调控。,研究背景,精确的DNA加成物对引起细胞内DNA损伤关卡反应的机制还不清楚。对酵母、爪蟾卵提取物、哺乳动物细胞等模式系统的研究表明：在DNA复制和转录过程中DNA和RNA聚合酶在大量NDA碱基加合物存在时停止运动，诱导DNA损伤关卡反应。相似的，大量DNA加成物存在时在下游DNA合成过程中使新引物越过损伤缺口继续复制，也可能作为DNA损伤反应的激活信号。此外，在核苷酸切除修复过程中大量DNA加成物移除产生短的ssDNA缺口也可能激活DNA损伤反应。,自我假设,基于上述的信息，可以设想一个模型：在亲代ssDNA复制、转录、修复阻滞过程中具有共同中间体的位点作为DNA损伤关卡激活的靶点。通过这一模型，ssDNA结合蛋白RPA快速与ssNDA结合，然后通过ATR相关蛋白ATRIP直接与ATR连接（ATRIP含有RPA亚基70KDa的RAP1），ATR可以募集DNA损伤位点起始DNA损伤信号通路。,研究目的,然而，还存在其它的可选择机制来起始由DNA损伤引起的DNA损伤修复反应。例如，在只有ATR或者与激酶激活伴侣蛋白TopBP1结合来识别起始信号通路。相似的，ATR同核苷酸切除和错配修复因子的相互作用也许控制不同形式DNA碱基损伤的DNA损伤修复。为此，我们设计无细胞实验，她包含哺乳动物细胞核提取物、损伤DNA和关卡靶蛋白基质。这个体外系统可以强烈的诱导关卡反应包括对关卡反应重要的关卡蛋白P53、Chk1、RPA的磷酸化。通过次实验，我们发现大量DNA加成物直接激活蛋白激酶DNA-PK、ATR和ATM，他们可以磷酸化多个关卡靶蛋白。,研究方案设计,1 取CHO细胞系AA8和V3进行细胞培养，培养过后提取细胞核内溶物。 2 蛋白质、激酶提纯。在提纯过程中用氮基三乙酸镍琼脂糖（Ni-NTA agarose)纯化，谷胱甘肽转移酶示踪。BL21细胞系表达P53使用谷胱甘肽凝胶树脂提纯。购买净化的NDAPK，HEK细胞系表达ATM激酶，用特异抗体亲和层析提纯。 3 化学试剂配制和相关抗体的制备。,4 细胞核提取物DNA-PK、ATM、ATR消耗量的测定。用特异性抗体与提取物反应，然后在谷胱甘肽树脂层析柱过滤，与HPLC联用检测信号在计算机上显示。以此来模拟细胞核提取物的消耗。 5 制备DNA加合物BPDE与PUC19DNA耦合。 6 激酶实验用细胞核提取物与细胞关卡蛋白提取物体外实验，过后Western Blotting验证关卡蛋白是否磷酸化。,预期实验结果,研究条件,1 CHO细胞系、 BL21细胞系、 HEK细胞系 2 谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽凝胶层析、HPLC层析、 Western Blotting 3 PUC19提纯物、加合物BPDE,注释及说明,1 DNA加合物(DNA adduct )：DNA分子与化学诱变剂间反应形成的一种共价结合的产物。这种结合激活了DNA的修复过程。如果这种修复不是发生在DNA复制前，会导致核苷酸的替代、缺失和染色体的重排。 2 DNA-PK、ATM、ATR属于磷酸肌醇-3-激酶相关蛋白激酶，可以起始DNA损伤反应(DDR).,3 由于小组成员水平有限，在翻译文章过程难免有不当之处。欢迎老师、同学交流指正。原文链接：http:/www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M111.235036,引用,细胞生物学第三版，翟中和，王喜忠，丁明孝主编 Address correspondence to: Aziz Sancar,Department of Biochemistry and Biophysics, Campus Box7260, University of North Carolina School of Medicine, Chapel Hill, North Carolina 27599. Phone: (919)962-0115. Fax: (919) 966-2852. E-mail: aziz_sancarmed.unc.edu,谢谢观赏,