第二十二章免疫学检测技术的基本原理.ppt

第二十二章 免疫学检测技术的基本原理,第一节 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素,（一）抗原抗体反应的特点 1. 高度特异性 2. 表面化学基团之间的可逆结合 3. 适宜的抗原抗体浓度和比例 4. 抗原抗体反应的两个阶段,1. 高度特异性 抗原表位与抗体分子的超变区互补结合 抗体检测抗原： 抗伤寒杆菌的抗体：检测伤寒杆菌 抗原检测抗体： 乙肝病毒：检测乙肝病毒抗体,2. 表面化学集团之间的可逆结合 抗原抗体之间：非共价键结合 结合不稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响。,3. 适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原或抗体过剩，形成的IC复合物体积小，数量少，肉眼不可见； 抗原抗体浓度和比例适当：IC复合物体积大，数量多，肉眼可见。,4. 抗原抗体反应的两个阶段 第一阶段：数秒至数分，形成小的IC； 第二阶段：数分、数小时至数日，形成 较大IC复合物。,（二）抗原抗体反应的影响因素 1. 电解质 2. 温度 3. 酸碱度,1. 电解质：离子强度 在适当浓度的电解质中：抗原抗体易结合为肉眼可见的凝聚物或沉淀物。 实验中常用0.85%的NaCl等离子溶液作稀释液。,2. 温度 体温或稍高于体温 37ºC是抗原抗体反应的最适温度。一般常使用反应在37ºC水浴或孵育箱中进行。 3. 酸碱度 最适酸碱度：pH 6-8,第二节 检测抗原和抗体的 体外实验（体液免疫检测）,血清学试验：抗原和其相应的抗体在体外相遇可发生特异性结合，用已知的抗体（或抗原）检测未知的抗原（或抗体），用于疾病的诊断。因为实验所采用的抗体常存在于血清或体液中（关节液、脑脊液、胸水及腹水），将体外的抗原-抗体反应称为血清学反应。 1. 凝集反应 2. 沉淀反应 3. 免疫标记技术 4. 蛋白质芯片技术,1. 凝集反应 细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒状物质与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。 （1）直接凝集反应 （2）间接凝集反应,（1）直接凝集反应：颗粒性抗原直接与相应的 抗体反应出现的凝集现象，如红细胞的凝 集（ABO血型）、细菌凝集。 玻片法：定性，ABO血型、菌种鉴定 试管法：半定量，检测Ab的效价 （2）间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体先吸 附在某些颗粒载体上，然后与相应抗体或 抗原进行反应产生的凝集现象。 类风湿因子检测：人变性IgG（抗原）吸附于 乳胶颗粒，检测待检血清中的RF。,2. 沉淀反应：毒素、组织浸液及血清中的蛋白 等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼 可见的沉淀物。 液相：环状、絮状沉淀反应，比浊法（检测 血浆蛋白、IgG、M、A和补体） 半固相：单向、双向琼脂扩散、免疫电泳,3. 免疫标记技术：是将抗原抗体反应与标记技 术相结合，检测抗原或抗体的一类试验方法。 将已知的抗体或抗原标记上示踪物质，通过 检测标记物间接测定抗体或抗原的量。 常用标记物：酶、荧光素、放射性核素、胶 体金、化学发光物等。 定性、精确定量、定位,（1）免疫酶测定法：是一种用酶标记一抗或 二抗检测特异性抗原或抗体的方法。 常用标记酶：辣根过氧化物酶（HRP）， 碱性磷酸酶(ALP),酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)： (1)双抗体夹心法(sandwich ELISA) (2)间接ELISA 免疫组织化学技术(immunohistochemistry technique):对组织抗原进行定位、定性、定量的检测技术。酶、化学发光、荧光技术。,ELISA法将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合，具有特异性而且极为敏感， 可以在细胞或亚细胞水平上检测抗原或抗体所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。,ELISA法是目前广泛应用于临床检测和生物制药等领域的免疫学技术，具有微量、特异、高效、经济、方便和安全等特点。,结合物和相应的抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，可催化底物水解、氧化或还原，从而产生有色物质。,因为颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比， 所以可以借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。,ELISA 检测抗体,洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。,(2) 免疫荧光技术(immunofluorescence technique) 常用荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC) 藻红蛋白(PE) 1) 直接荧光法 2) 间接荧光法,(3) 放射免疫测定法(radioimmunoassay, RIA) (4) 化学发光免疫技术 (5) 免疫胶体金技术 (6) 免疫印迹技术(Western blotting),SDS-PAGE,通常采用不连续电泳系统，通过电荷效应，浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。,SDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，可使蛋白质的氢键和疏水健打开，与之形成蛋白质SDS复合物。由于SDS带有负电荷，消除了不同蛋白质间原有的电荷差异，使蛋白质分子在凝胶中的迁移率主要取决于它的分子量。,4. 蛋白质芯片技术 快速、准确、高通量的检测技术,第三节 免疫细胞功能的检测（细胞免疫检测）,一、 免疫细胞的分离 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 二、 免疫细胞功能的测定 1. T细胞功能测定 2. B细胞功能测定,(1) 抗凝 静脉血,(2) 加等量NS,(4) 密度梯度离心,(3) 混匀后，缓慢加于分离液上,1. T细胞功能测定 （1）T细胞增殖试验 1）形态计数法：T细胞受到有丝分裂原刺激，出现体积增大、细胞形态不规则、胞质增多、细胞核松散并出现多个核仁等形态变化。 2）3H-TdR掺入法 3）MTT法,淋巴细胞转化试验（形态学示意图）,原理：人T细胞表面有PHA或ConA受体，T细胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T细胞的功能。,淋巴细胞增殖3H-TdR掺入法,原理：将单个核细胞中加入PHA共同培养，在终止培养前815小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR), 经-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA的3H-TdR掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。,淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图,MTT(四甲基偶氮唑盐）法,原理：在细胞培养终止前数小时加入MTT，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解MTT产生蓝色甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。,E-玫瑰花结试验示意图,（2）迟发型超敏反应(DTH)的检测 常用于检测：病原微生物感染、免疫缺陷病和肿瘤患者的免疫功能测定。 常用皮试制剂：结核菌素、念珠菌素等。,2. B细胞功能测定 （1）各类Ig的测定：单扩、试管法、比 浊法、ELISA等； （2）抗体形成细胞测定：溶血空斑试验、 ELISPOT法,酶联免疫斑点法 （Enzyme-Linked Immunospot, ELISPOT),是在ELISA的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。,抗原包被的反应板,检测抗原特异性B细胞,T细胞产生CK的检测,3. 细胞毒试验,检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术。 (1) 51Cr释放法 (2) 乳酸脱氢酶释放法 (3) 细胞染色法 (4) 凋亡细胞检测法： 1）形态学检测法 2）琼脂凝胶电泳 3）FACS (流式细胞术:FCM) 4）TUNEL法,4. 吞噬功能测定 （1）中性粒细胞吞噬试验 （2）巨噬细胞吞噬试验 5. 细胞因子的检测 （1）生物活性检测法 （2）免疫学检测法,免疫学预防与治疗,第二十三章,根据免疫学原理，利用物理、化学和生物学的手段人为地增强或抑制机体的免疫功能，达到预防和治疗疾病目的的措施。,免疫学防治,免疫学防治,How to get immunity to the diseases ?,特异性免疫获得的方式,自然免疫,人工免疫,自动免疫 被动免疫,显性感染 隐性感染,胎儿或新生儿从母体获得抗体,主动免疫 被动免疫,注射疫苗,注射抗体或细胞因子,获得免疫的途径,主动免疫（Artificial active immunity） 给机体输入抗原性物质，激活机体的免疫应答，使机体自身产生抵抗疾病的能力。 被动免疫（Artificial passive immunity） 将对疾病有免疫力的供者的免疫应答产物转移给受者，或自体免疫细胞体外处理后回输自身，以预防或治疗疾病。,自然主动免疫,人工主动免疫,自然被动免疫,人工被动免疫,第一节 免疫预防,疫 苗 概念：疫苗是利用微生物及其代谢产物， 经过人工减毒或灭活或基因工程等 方法制成，用于预防疾病的人工主 动免疫制剂。,疫 苗,疫苗的基本要求 安全 有效 实用 包括：细菌疫苗、病毒疫苗、原虫疫苗、 避孕疫苗、肿瘤疫苗等。,疫苗的主要保护机制中和抗体,疫苗的分类,减毒活疫苗 灭活疫苗 类毒素疫苗 亚单位疫苗 DNA疫苗 可食用疫苗,减毒活疫苗,是用减毒或无毒力的活病原微生物制成。 卡介苗、口服小儿麻痹疫苗（糖丸） 优点：模拟自然感染，一般只需接种一次。 免疫原性强、免疫效果好 缺点：可能出现毒力回复突变,减毒活疫苗,牛型结核杆菌 Mycobacterium bovis,置于含胆汁的培养基，逐渐增加胆汁的浓度,卡介苗 Bacillus Calmette-Guerin （BCG）,在胆汁中适应性生长，充分减毒成为预防肺结核的疫苗。,13年 230次传代,法国科学家 Calmette Guerin,灭活疫苗,选用免疫原性强的病原体，经人工大量培养后，用理化方法灭活制成。又称“死疫苗”。 如：流感疫苗、甲肝疫苗 优点：安全 缺点：免疫原性较差，主要诱导特异性抗体的 产生；需加强免疫。,流感疫苗制备流程,死疫苗和活疫苗的比较,类毒素疫苗,类毒素是用细菌的外毒素经0.30.4%甲醛处理制成。如破伤风、百日咳、白喉类毒素疫苗,亚单位疫苗,提取或合成天然微生物某些成分的亚单位（如外壳的特殊蛋白结构）制成的疫苗。如：乙肝疫苗、HPV（宫颈癌）疫苗；细菌荚膜多糖疫苗等。,优点：副作用小、更为安全、稳定 缺点：免疫原性低，需与佐剂合用。,乙肝病毒（HBsAg）,HPV病毒（L1蛋白）,DNA疫苗的优缺点,优点：可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答 制备工艺简单，生产成本低，适于大批量生产。 比传统疫苗安全。 性质稳定，易于保存、运输。 可生产多价疫苗，同时预防多种病原体感染。 缺点：是否整合至宿主基因组,诱导癌变？ 长期持续表达是否诱导免疫耐受？ 是否产生抗DNA抗体？,我国推行的儿童基础免疫程序,新疫苗的审核： 3期临床试验,I期：以新疫苗的的安全性为主 ； 期：以新疫苗的有效性为主； 期：证明新疫苗预防传染病的免疫保护性为主。,疫苗的临床试验,第二节 免疫治疗,抗体为基础的免疫治疗 抗原为基础的免疫治疗 细胞因子为基础的免疫治疗 细胞为基础的免疫治疗,抗体为基础的免疫治疗,抗毒素(antitoxin） 用细菌外毒素多次免疫马后获得免疫马血清，血清中含有大量能中和该外毒素的IgG类抗体，经浓缩纯化获得抗毒素。如：白喉抗毒素、破伤风抗毒素 用途：治疗、紧急预防 人特异性免疫球蛋白 来源：恢复期病人、含高效价特异性抗体的供血者 接受类毒素和疫苗免疫者的血浆,丙种球蛋白（g-globulin） 胎盘丙种球蛋白、人血浆丙种球蛋白 来源：健康人静脉血 健康产妇胎盘血（脐血） 用途：用于多种病毒性疾病的防治，治疗先天性丙种 球蛋白缺乏症，可提高对某些严重细菌性和病 毒性疾病的疗效,单克隆抗体（monoclonal antibody),美国FDA批准生产用于临床治疗的单克隆抗体,临床用单克隆抗体,Anti-molecule on the saface of cells antibody Anti-cytokines monoclonal antibody Monoclonal antibodies coupled with toxic agent. (抗体导向药物/免疫毒素),一、抗细胞表面分子抗体,Anti-CD20 antibodies：Rituximab, Zevalin, Bexxar Anti-CD3 antibodies: Othoclone (OKT3) Anti-Her-2 antibodies: Her-2/neu,抗体导向药物,将化疗药物、毒素、放射性同位素等细胞毒性物质偶联到肿瘤单抗上，从而制备抗肿瘤单抗偶联物，也称免疫偶联物,放射免疫偶联物 90Y（钇），131I 化学偶联物 免疫毒素 植物毒素 细菌毒素,基因工程抗体,通过DNA重组和蛋白质工程技术，在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装而成的新型抗体分子,人鼠嵌和Ab,人源化Ab,保留了天然抗体的特异性和主要生物学功能。 减少鼠源成分，其免疫原性减弱，减少副作用。 赋予抗体分子新的生物学功能。 小分子抗体穿透实体瘤的能力大大增强。,基因工程抗体优点,抗原为基础的免疫治疗,合成肽表位疫苗 重组抗原疫苗 DNA疫苗 重组病毒疫苗,增强免疫应答：肿瘤、病毒感染性疾病,诱导免疫耐受：AID、超敏反应、移植排斥,治疗性疫苗,针对机体异常的免疫状态，人工给予抗原以增强免疫应答或诱导免疫耐受来治疗疾病,细胞为基础的免疫治疗,将自体或异体的造血细胞、免疫细胞或肿瘤细胞经体外培养、诱导扩增后回输机体，以激活或增强机体的免疫应答。 造血干细胞移植：骨髓移植、外周血干细胞、脐血干细胞 免疫效应细胞输注：NK细胞、LAK细胞、CIK细胞、 TIL细胞 DC细胞：PBMC经IL-4、GM-CSF诱导扩增为DC细胞。 肿瘤疫苗：自体或异体肿瘤细胞经物理、化学或生物学处 理，使肿瘤细胞失去分裂增殖能力，保留其免疫 原性，制成减毒或灭活的瘤苗,教学要求,人工主动免疫的概念，优缺点，主要制剂（灭活疫苗、减毒活疫苗、类毒素、亚单位疫苗，基因工程疫苗）。 人工被动免疫的概念，优缺点，主要制剂（抗毒素，正常人丙球和胎球，人特异性Ig）。 治疗用单克隆抗体的分类。,