实验三 Feulgen反应显示DNA2009-3.ppt
实验三 Feulgen反应显示DNA,一、实验目的,1掌握临时制片法。 2熟悉Feulgen反应的原理及操作步骤。 3观察细胞中DNA的分布,二、实验原理,DNA经酸（1mol/L HCl）水解后，分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出游离的醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。该产物能特异地吸收550570nm的光波。并且在一定的浓度范围内对550570nm光波的吸收值与DNA含量成正比关系，符合化学计量学关系。 对照组或采取不经盐酸处理，或预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明此反应的专一性。 此法既可定位用于细胞或组织化学染色反应，观察DNA的分布，又可用显微分光光度计和图像分析仪对细胞或组织中DNA的含量进行定量分析。,1950年，Swift H.应用Feulgen显微分光光度法，测定了一些生物各种组织中单个细胞的DNA含量，定义为C值。 Feulgen反应对DNA染色稳定、颜色鲜明、能定量，因此在细胞化学和组织化学中成为一个既古老、传统又经久不衰的DNA标记方法。,Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠/钾作用，形成无色的品红液。无色品红与醛基结合则形成紫红色的化合物，这是因为反应产物的分子内含有发色基团醌基所引起的。,三、实验器具与药品,l 每一个学生 复式显微镜（带油浸物镜）（microscope） l 每一组学生 擦镜纸；记号笔；小片滤纸；载玻片；镊子；移液枪 四膜虫培养液（200l）； 大染色缸：Carnoy固定液；Schiff试剂（铝箔包装）；1mol/L HCl；自来水 l 每四个学生 香柏油、二甲苯；小枪头；亮绿 整个实验班 恒温水浴锅两台，烘箱一台,四、实验方法 1、细胞标本的制作:,（1）每个同学取一片干净载玻片，用移液枪取四膜虫培养物一滴（每片载玻片10 l ，移液枪切勿调节超过其量程范围），滴于干净的载玻片的一侧，并用枪头在玻片上涂开成直径约1cm左右的圆。 （2） 按上述方法再做一片细胞标本作为对照。 （3）将标本放在干燥箱中10-15分钟，令样品干燥，细胞牢固贴于玻片。 每人做两片：样品；对照,染色缸平面示意图,载玻片,2固定、染色、观察：,以下17步操作在染色缸中进行。（注意：载玻片插入染色缸中应插在凹槽中，尽量避免两片载玻片贴在一起，否则会摩擦掉上面的细胞。） (1)将干燥好的2片细胞涂片置于Carnoy固定液中固定20分钟，取出，平置在滤纸上，吸去玻片背面的液体。 （滤纸不要擦载玻片正面。） (2)将其中一片标本（样品）放入1mol/L盐酸中，60水浴15分钟（注意不要打翻染色缸）；另一片标本（对照）放在空气中，令其自然干燥。 (3)将以上两标本同时放入Schiff氏液中作用45分钟（ 30培养箱 ）。（注意不要搞混样品和对照。） (4) 自来水浸泡1分钟，提出载玻片，平置在滤纸上。 （5）倒去染色缸中液体，再加入干净的自来水，重复（4）操作。 (6) 0.1亮绿水溶液复染2秒钟（将载玻片浸入溶液后随即提出）。 (7)在干净的自来水稍加浸泡，去掉浮色，滤纸吸去玻片背面和两侧的水分。 （滤纸不要擦载玻片正面） (8)空气中干燥，显微镜观察。比较两个标本的差异。,实验流程,涂片 （2片/人）,样品,对照,干燥,盐酸水浴 6015m,Schiff试剂 3045m,对照片空气 干燥,自来水浸洗 1m/两次,亮绿复染 2s,Carnoy固定 20m,自来水浸洗 去浮色,干燥,镜检,介绍：RNA染色Brachet反应,甲基绿-派洛宁为碱性染料，它能分别于细胞内的DNA和RNA结合而呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中的DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易于聚合程度高的DNA结合呈现绿色，而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色，但解聚的DNA也能与派洛宁结合呈现红色。总的说来，RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成蓝绿色。,蟾蜍血细胞Brachet染色 蓝绿色部分为DNA，红色部分为胞质和核仁的RNA,介绍：四膜虫（Tetrahymena）,四膜虫与草履虫一样，都是单细胞原生动物，属纤毛虫纲。一般呈梨形。四膜虫有两个细胞核，大核位于细胞中部，直径约10微米，小核位于大核附近，直径为1.52微米。小核具5对染色体，其基因不转录，对细胞表型无影响。在有性生殖过程中，小核经配子核交换发育产生新大核，同时旧大核退化。大核中的基因活跃地转录，决定了细胞的表型。 核酶的发现：1981年Cech等发现，四膜虫rDNA转录rRNA前体分子不需要酶，可以自己精确地将26SrRNA中的一段内含子切除下来，并将两侧的RNA拼接起来形成完整的26SrRNA。 端粒结构及其复制机制的阐明：1978年，Blackburn以四膜虫rDNA为材料，首次揭示了染色体端粒序列的真实存在，并进而在其他生物中获得了证实，接着又在四膜虫体内分离出了端粒酶，并于1989年证明这种酶本身就带有一段RNA序列，后者正是染色体DNA端粒序列复制的模板，从而基本搞清了染色体中线型DNA分子复制时维持其完整性的机制。 四膜虫大核中存在上万个来自于小核单一拷贝rRNA基因的rDNA分子，具有高度的同源性。这一特性，使四膜虫成为研究rRNA基因转化的难得的材料。,五、实验结果,实验组经Feulgen反应显示核结构细致、清晰，细胞核染成粉红色至紫红色，核仁不着色。经亮绿处理的细胞的细胞质部分显绿色。 对照组由于DNA没有释放出醛基，细胞核显示出被亮绿染上的绿色，无红色出现。 如果亮绿处理时间过长，则会造成细胞核区颜色过深。,六、注意事项,涂片时最好在载玻片上端一角做好标记，以免实验时弄反正反面。涂片区不要超过载玻片长度的1/2，涂成直径约为1cm左右的圆。 涂片完需待其完全干燥后（可置于温箱中使其快干），方可置Carnoy固定液中固定，否则涂上的细胞会大量脱落。 酸水解时必须掌握合适的浓度、水解温度和时间，如果酸水解不足，会造成醛基暴露不完全；反之会造成DNA间键的断裂溶解，对DNA的定量测量产生不良影响。 在Schiff试剂中染色（切记在避光处反应）时，如室温过低会影响染色效果，使染色极浅。可适当加温（置于30度左右温箱中）或延长反应时间。 亮绿浓度不能过高，染色时间不能过长，否则整个细胞包括细胞核区均会染色过深而看不出紫红色。,七、作业,1.画图表示Feulgen反应的染色结果。（样本片中染色较典型的23个细胞） 2.对经过不同的处理后的染色结果观察后，比较其不同，进行分析。 3.如果用Feulgen反应对小鼠精子细胞和肝细胞进行DNA含量的检测，能确定其中的倍数关系吗？（精子细胞为一倍体；幼鼠肝细胞二倍体；成年鼠肝细胞包括二倍体、四倍体和八倍体等多倍体） 4.你对此实验有何改进建议？,八、思考题,1、比较Feulgen反应与Brachet反应（可从对象、染色效果、是否可定量等方面比较）。 2、四膜虫有两个细胞核，大核位于细胞中部，直径约10微米，小核位于大核附近，直径为1.52微米，它们在遗传上发挥不同的作用。你能在实验中观察到这两个细胞核吗？ 如何确定它们的作用呢？,样本片,对照片,请大家在实验后把桌面整理好，染色缸中液体不要倒掉！滤纸和小离心管都不要丢弃，用过的载玻片清洗后交到回收框中，登记显微镜使用记录本，并到助教处登记实验记录后再离开!,
