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    L-天冬酰胺酶的生产工艺PPT.ppt

    • 资源ID:3325323       资源大小:410.54KB        全文页数:12页
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    L-天冬酰胺酶的生产工艺PPT.ppt

    生工本2009级4班,刘培培 20092513418,L-天冬酰胺酶的生产工艺,LOGO,(一)天冬酰胺酶的化学组成和性质,天冬酰胺酶是酰胺基水解酶,是大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物,用于治疗白血病。1922年Clementi发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶;1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质,其活性成分是蛋白质;1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶,后来,Mashburn等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶,具有同样抗癌活性。 天冬酰胺酶呈白色粉末状,微有湿性,溶于水,不溶于丙酮 三氯甲烷 乙醚和甲醇,水溶液20储存7d,5储存14d均不减少酶的活力。干品50 15min酶活力降低30,60 1h内失活,最适PH8.5,最适温度37。,(二)国内天冬酰胺酶的发展历程,目前,国内临床上应用的L2ASP 主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于1974 年开始生产E1coli天冬酰胺酶,但由于菌种产酶能力低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他原因最后停产。为了填补国内空白,1995 年,中国药科大学吴梧桐教授等率先进行了E1coli 天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究,并首次在国内成功构建了高效表达L2ASP 的基因工程菌pKA/ CPU210009 ,工程菌发酵单位比野生株高出100 倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺,确定了重组L2ASP 的纯化路线,并对重组产品进行了鉴定。结果表明,基因工程菌生产的产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质的物理化学性质等方面均一致,两者具有同质性 。这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E1coliL2ASP 开辟了新的道路。,(三)抗肿瘤机制,L2ASP 抗肿瘤的作用机制在于它能够降低人 体内L2天冬酰胺和L2谷氨酰胺的浓度,这两种氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成L2天冬酰胺,需酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细要摄取外源L2天冬酰胺才能存活。当外源L2天冬酰胺被分解掉时,癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显著降低,因此L2ASP 能有效抑制肿瘤细胞的增殖。有研究表明, L2ASP 能够选择性抑制体内Ra2pamycin2靶标信号传导通路,从而抑制肿瘤的增值 。另有文献报道,L2ASP 在体内发挥作用时可能是通过一种功能性的p53 蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡 。,(四)工艺流程,大肠杆菌产生的L2ASP 包括L2ASP 和L2ASP ,其中L2ASP 存在于细胞质中,与底物L2天冬酰胺的亲和力很小(Km = 1 ×10 - 3 mol/ L) ,没有抗肿瘤活性;而L2ASP 则分泌在细胞周质中,与L2天冬酰胺有很高的亲和力( Km = 1 ×10 - 5 mol/ L) ,有抗癌活性3 。现今,产生L2ASP 的菌种主要包括Escherichia coli 、Erwinia carotovara、Serralia marcescem、PseudomonasSp1、Wolinella succinogenes 等。 主要采用的提纯方法包括硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、离子交换层析法、超滤、水系二相胶束系统、分批式吸附和直行式解吸附法、渗透休克法以及亲和层析法等816 。采用不同方法最终得到目标产物的酶活力范围为220520157 U/ mg ,总回收率为31 %86 %。,天冬酰胺酶工艺流程图,大肠杆菌 肉汤菌种 种子 菌种 发酵液 菌体 提 取液 上清液 沉淀 洗脱液 洗脱液 冻干 L-天冬酰胺酶,菌种培养,肉汤培养基37 48h,玉米浆培养基37 4-8h,种子培养,发酵,玉米浆培养基37 6-8h,离心,提取,蔗糖抽提液PH7.5 30,分级沉淀,(NH4)2SO455饱和度PH7.0,分级沉淀,(NH4)2SO490饱和度,离子沉淀,DEAE-纤维素(DE52),离子交换,CM-纤维素(CM52),工艺过程及要点,1 菌种培养 采用大肠杆菌Escherichia coli A.S.1.357,培养基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,琼脂2-2.5g 37,在试管中培养24h,茄形瓶培养8h,锥形瓶培养16h。 2 种子培养 培养基用玉米浆30kg,加水至300kg,接种量1%-1。5%,37,通气搅拌培养4-8h.,一、总述,3 发酵罐培养 取玉米浆100Kg,接种量8%,37,通气搅拌培养6-8h,离心分离发酵液,得菌体加2倍量丙酮搅拌,压滤,滤饼过筛,自然风干成菌体干粉。 4 蔗糖溶液抽提 将菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖溶液(蔗糖40%溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30振荡2h,8000r/min离心,收取上层酶液。,5 硫酸铵分级沉淀 取上述酶液,加入(NH4)2SO4至55%饱和度,调PH至7.0,室温搅拌1h,离心除去沉淀,取上清液加入(NH4)2SO4到90%饱和度,离心收集沉淀。 6 纯化 将沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸缓冲液溶解并透析,透析后的酶液,通过预先用10mmol/L,PH7.6磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素层析柱(1cm×30cm),用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱,流速为40mL/h,收集天冬酰胺酶活性组分,再调整PH4.8,通过预先用50mmol/L,PH4.9的磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱(1cm×8cm),用50mmol/L,PH5.2的磷酸缓冲液洗脱,收集酶活性组分,冷冻干燥,即得L-天冬酰胺酶冻干粉,总收率为31%,比活为220U/mg蛋白。,二、工艺流程图,(1)丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管(25°C,孢子培养,7天)斜面母瓶(25°C,孢子培养,7天)大米孢子(26°C,种子培养56h)一级种子培养液(27°C,种子培养,24h)二级种子培养液(2726°C,发酵,7天)发酵液。 (2)球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管(25°C,孢子培养,68天)亲米(25°C,孢子培养,810天)生产米(28°C,孢子培养,5660h)种子培养液(2625-24°C,发酵,7天)发酵液。,三、青霉素发酵过程,青霉素发酵时,青霉素生产菌在合适的培养基、PH、温度和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。 发酵开始前,有关设备和培养基(主要是碳源、氮源、前体和无机盐等)必须先经过灭菌,后接入种子。 在整个过程中,需要不断通气和搅拌,维持一定的罐温和罐压,在发酵过程中往往要加入泡沫剂,假如酸碱控制发酵液的PH,还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充碳源及氮源,或补进其他料液和前体等以促进青霉素的生产。,青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、青霉素合成和菌体自溶三个阶段。,菌体生长阶段:发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的适应,即开始发育、生长和繁殖,直至达到菌体的临界浓度。 青霉素合成阶段:这个阶段主要合成青霉素,青霉素的生产速率达到最大,并一直维持到青霉素合成能力衰退。在这个阶段,菌体重量有所增加,但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。 菌体自溶阶段:这个阶段菌体衰老,细胞开始自溶,合成青霉素能力衰退,青霉素生产速率下降,氨基氮增加,PH上升。,

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