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第十六章 基因工程和蛋白质工程简介 第一节 DNA重组与基因工程 第二节 蛋白质工程简介 第三节 核酸研究技术简介 返回 第一节 DNA重组和基因工程 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体 DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使 外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning， 克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物 原有的遗传性状。 一、DNA重组的技术路线 二、基因工程的应用与前景 三、DNA体外重组常用的酶 DNA重组的 技术路线 Foreign DNA to be inserted Plansmid vector Joining Recombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromateme Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule Cloning + 1、目的基因的制备 2、载体的构建 3、目的基因与载体 的重组 4、重组 体导入宿主 细胞进行扩增 5、克隆基因的鉴定 Ti质粒结构 植物冠瘿瘤 pBR322质粒的结构 以噬菌体为载体进 行DNA克隆 DNA 用限制性内切酶 除去中间一段 与外源DNA连接 重组载体的体外包装 带有外源DNA的 噬菌体 太小不能被包装 头部前体 多联体 DNA A蛋白 COS COSCOS 成熟的颗粒 在宿主细胞内进行 DNA的装配过程 噬菌体感染大肠杆菌的途径 DNA重组体的筛选 载体特征的直接筛选 菌落的原位杂交 免疫学方法 pBR322质粒结构 如果外源DNA 插入，氨卞青霉 素抗性基因失活 如果外源DNA插 入，四环素抗性基 因失活 原位杂交法筛选 DNA重组体图解 复印至硝酸 纤维素膜上 用NaOH菌体裂 解DNA变性 杂交 放射自显影 32P-cDNA 与放射性cDNA杂 交的菌落的斑点 细菌菌落 单链DNA结 合到膜上 Southern 印迹法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记 DNA探针杂交 放射自显影 带有DNA片 段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液 转移 DNA 吸附有DNA 片段的膜 Southern和Western印迹法 DNA frangment Electrophoresis Transfer of DNA by blotting 32P-labled DNA probe Autoradiography Agarrose gel Autoradiogram Nitrocellulose sheet Autoradiogram Polymer sheet SDS-Polyacrylamide gel Transfer protein Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody Protein band detected by specific antibody Autoradiography DNA重组技术的应用 (1) 开辟生物学研究的新纪元 反向生物学（invese biology）的诞生 （2）促进生物技术产业的兴起 基因药物 基因诊断和治疗 转基因动植物 胰岛素原的人工合成 胰脏 (A)n 胰岛素原mRNAcDNA 重组质粒 转化细菌 mRNA 反转录酶 胰岛素原基因 与质粒 连接 感染 E.coli 胰岛素原 Ti 质 粒 为 载 体 的 植 物 基 因 工 程 I 二元载体系统 II 共整合载体 III T-DNA的转移与整合 Ti辅助质粒 Ti辅助DNA 给体质粒 Ti辅助DNA 给体质粒 pBR型质粒 （给体质粒） 宿主特 异性 外源基因 宿主特 异性 整合 带有外源基因 的Ti质粒 植物DNA Ti质粒转移并 插入植物DNA 第二节 蛋白质工程简介 蛋白质技术和核酸技术的相互增强 在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋 白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并 不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的Ulmer首先提出 蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分 子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工 程的重要组成部分。 蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级 结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结 构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经周 密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。 研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞 因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以 及抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。 生物酶工程示意图 酶的蛋白质结构功能新酶分子蓝图 选择性修饰方案 突变酶 新酶 克隆酶 产品 效用 发 展 酶基因 遗传设计 遗传修饰 DNA重组 技术 DNA重组 技术 蛋白质技术和核酸技术的相互增强 插入表达载体转化寄主细胞 推导出 AA顺序 制备合成肽 制备对所编码蛋白 专一的抗体 基因或 cDNA 蛋白质 蛋白质 测定出 AA顺序 合成cDNA 探针 制备专一的抗体 沉淀核糖体 分离mRNA 用Southern印迹法 筛选DNA文库 基因或 cDNA 第三节 核酸研究技术简介 一、DNA序列测定 二、基因文库与cDNA文库 三、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） DNA测序的基本战略 设法产生带标记的不同长度的成套DNA 片段，各带有标记的片段起点相同、终点不 同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处 都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相 差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影 后，根据长短排列，根据特定末端碱基的 DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。 酶法 化学法 测序技术进展 酶 法 序 列 分 析 的 原 理 酶 反 应 电 泳 方 向 模板 CCGGTAGCAACT 3´5´ GG 5´3´引物 dATP dCTP dGTP dTTP +ddATP dATP dCTP dGTP dTTP +ddTTP dATP dCTP dGTP dTTP +ddGTP dATP dCTP dGTP dTTP +ddCTP GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCGTTG GGCCATCG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT A C G T A G T T G C T A C C 3´ 5´ T C A A C G A T G G 5´ 3´ 读出模板 互补序列 读出模板 序列 GGCCATCGTTGA GGCCATCGT GGCCATCGTTG GGCCATCGTT GGCCATCG GGCCATC GGCCA GGCCAT GGCC GGC DNA的 Sanger 测序法 (酶法) 读出模板 互补序列 dNTP 凝胶电泳 较大片段 较小片段 ddGTPddATPddCTP ddTTP 反应混合物 Klenow酶 未知序列的单链DNA 读出待测 序列 CTGACTTCGACAAAGAA 5´ 3´ 放射性标记的引物TGTT A C T G ddG ddG ddG ddG G A C T G A A G C T G T T 3´ 5´ C T G A C T T C G A C A A 5´ 3´ DNA的测序仪示意图 computer analysis 凝胶中DNA移动方向 样品槽 激光器 输入光学系统 成象透镜 聚焦透镜 高灵敏度相机 旋光镜/棱镜组件 DNA的化学测序示意图 反应试剂 G反应：硫酸二甲酯 G+A反应：甲酸 T+C反应：肼 C反应：NaCl+肼 测序技术进展 同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳 多色荧光标记 毛细管电泳 单色荧光标记 平板电泳 同位素标记 平板电泳 A C G T A C GT 测序图谱 T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T 引物标记法测序引物标记法测序( (Dye Primer)Dye Primer) 一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。 + AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddATP (terminator) + AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddCTP + AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddGTP + AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddTTP 反应结束后， 将4管反应液混 合，经乙醇沉淀 后上样 终止法测序终止法测序( (Dye Terminator)Dye Terminator) 一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子) unlabeled primer template DNA + AmpliTaq FS dATP, dCTP, dGTP, dTTP ddCTP ddATP ddGTP ddTTP 测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进 行纯化，除去过量的行纯化，除去过量的ddNTPddNTP后上样。后上样。 三基因文库与cDNA文库 1基因文库（genomic library） cDNA文库（complemental DNA library） 2 . 文库的构建 基因文库 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的 分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部 基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以 备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其 为genomic library。 基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因 以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-f) N 基因文库所包含克隆的数目； p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于 99%； f 克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。 cDNA文库 真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外 显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使 编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加 工成熟的mRNA反转录成cDNA （complemental DNA）接上原核生物表 达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有 一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA 都通常通过对其cDNA来进行研究的。将细胞全部mRNA反转录成cDNA 并被克隆的总和称为cDNA文库。 RNA病毒的基因组是RNA，也必须将 RNA先转录成cDNA，再建立文库。 为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，cDNA文库 应含的克隆数的计算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-1/n) N cDNA文库所包含克隆的数目； p 低丰度cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于99%； 1/n 每一种低丰度的mRNA占总 mRNA的分数。 基因文库和cDNA文库的建立 组织 可克隆之DNA 载体 DNA cDNA mRNA 部分或完全 酶解DNA DNA长度分级 甲基化，双链 接头DNA DNA与载体连接 引入大肠杆菌 鉴定文库的滴度和特性 扩增后供 长期储存 筛选出所需 要的克隆 噬 菌 体 为 载 体 的 基 因 文 库 的 构 建 四、聚合酶链式反应（PCR） 1985年Mullis发明PCR（ polymerase chain reaction）快速扩增 DNA的方法。该法模仿体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两 条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以 4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复 此过程，DNA以指数方式扩增。扩增的公式为: Y=(1+X)n 式中 y一产量; X-扩增效率; n一循环次数。 （2） PCR的应用 （1）PCR的原理 PCR技术原理示意图 靶序列 变性和引 物复姓 循环1 循环2 循环3 变性和引 物复姓 链延伸 Tag酶 链延伸 PCR技术的发展与应用 用于合成特异探针； 用于DNA的测序； 将逆转录与PCR相偶联 （RT-PCR）； 用于基因定位诱变； 末知序列的PCR扩增； 基因组序列的比较研究； 用于临床诊断。 DNA芯片(DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手 段，将数以万计的DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二维 DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，反应结果通过检测杂交信 号的方法（同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法）显示，再用 精密的扫描仪或CCD摄象技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读 的IC总信息，来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。 芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片阵列中的每一个单元 微点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精髓往往都被用于芯片 的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性， 所以芯片技术也是传感器技术的发展。 DNA芯片技术简介 DVA芯片工作示意图 emission Laser 1Laser 2 computer analysis DNA clonestest reverse transcription Label with fluor dyes PCR amplification purfication hybridize target to microarray robotic printing reference