细胞总RNA提取及逆转录.ppt
分子生物学实验,1、 每组同学做一份实验； 2、 遵守实验室规则，穿白衣； 3、 同学们在听课时要作好记录; 4、 上课时间。,欢迎大家参加分生实验课的学习！,1. 实验成绩考核占总成绩15%。 2. 每次实验报告5分含随堂测试，共三次，合15分。 3. 缺实验课成绩者，本课程不予通过。 【每名同学的3个实验报告放在一起，最后一次实验课交。学生交卷后签名。教师按学号排卷。】,2013年 五年制 实验课考试形式,1. 加样器 2. 离心机,先介绍本轮实验中两种常用仪器的使用方法,3、 根据取样量，选择合适量程的加样器。,顶部标记加样器的最大量程，分别为： 20 l: 0.5 20 l 100 l: 20 100 l 1000 l: 200 1000 l,一、加样器的使用及注意事项,1、 用途 微量吸取液体 2、 每组3支加样器,Q：如果要吸取5l、50l、150l、 500l的液体，应选择哪个加样器?,练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少?,4、如何调节？,(1)首先观察目前的读数,假设为050: 最大量程为20l的加样器 5l 最大量程为100l的加样器 50l 最大量程为1000l的加样器 500l (2) 顺时针调节- 读数变小 逆时针调节- 读数变大 (3) 注意：调节前，加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。,5、加样器使用步骤： 1）选择加样器,观察读数,调节读数。 安装吸头要紧密(不要用手直接拿吸头)，安装后旋转固定一下。 2）在液面外，先按到第一挡。 3）将吸头插入液面下的适当深度: 过深可能会腐蚀加样器, 过浅可能会吸入空气。 4）缓慢松开拇指,吸取液体。 完全放开拇指后，停留半秒钟。急于离开液面，易吸入空气。 5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去 6）贴容器内壁，加样器推到第二挡将液体匀速打出。(吸头内有液体时，不能将加样器平放或倒置，液体会倒流损坏加样器！) 7) 观察吸头内液体是否完全打出，将吸头弃于废物盒内。,第一挡为实际读数体积， 第二挡为帮助彻底打出液体，避免吸头内液体残留。,1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。,1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。,3、将样品标记好并配平, 对称放入离心机（管的连接处朝外）。 4、设定离心的转速和时间。 5、统一离心。,Team Work,二、离心机的使用及注意事项,实验一、 细胞总RNA的提取及逆转录,实验内容： 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的变性琼脂糖凝胶电泳 3、以总RNA为模板的逆转录反应,一、真核细胞的总RNA 1、mRNA: 1-5% 5鸟嘌呤7位甲基化CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3poly(A)尾巴结构 20-200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt,第一步： 提取小鼠肝脏组织的RNA,二、RNA提取的注意事项,RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C. 一次性塑料器材最好是新开封， (DEPC水处理后）高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。,RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。,1) 发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。 将1mL Trizol试剂移入Eppendorf管中。 2) 实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3) 将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mL的Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以上。 使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4)室温孵育10 min。,三、RNA提取的实验操作,1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 RNase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。,课间介绍 RNA提取的几种方法,RNase抑制剂介绍,1、DEPC ( 二乙基焦炭酸盐) 最常用的RNase抑制剂: 与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。 有效浓度：0.05%-0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。用于浸泡各种器材。 灭活条件：高压。 在Tris溶液中半衰期为1.25min。 试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制, 高压) 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。 2、肝素： 使用浓度：0.110mg/ml 效 果: 37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。 如果与DEPC联合应用， 具有极强的抑制 效果。,5)加入200 l氯仿， 震荡混匀20-30s， 室温放置5min（此期间液体开始分层，此时不要轻易搅动液体）。 )10000 rpm，离心5min。,7) 将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。,三、RNA提取的实验操作,8) 沉淀RNA： 加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。 10000rpm，离心10min。弃上清。 ) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 (注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀) 10) 7500rpm离心1min，弃上清。 再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。,用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。 当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。,12)室温干燥35min。 （干燥的时间由RNA沉淀大小决定） （干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）,注意事项：,RNA: 避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无法溶解。 RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因 。 判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。,RNA pellet：透明胶样 干燥后应该无色透明,13） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5l，加到RNA上，反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。 14) 吸出 4.5 l溶液放到冰上备用 (将用于电泳)。 15) 剩余 9 l溶液放到冰上备用 （将用于RTPCR）。,注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。,避免气泡的方法： 用加样器的第一挡 每次吹打都不要打出气体,判断溶解程度： 吹打时液体流动不拐弯为止。,逆转录酶： 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC 。 以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNAcDNA。 RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。,第二步：逆转录反应,mRNA,3-TTTTTT(18)-5,68-70oC, annealing,3-TTTTTT(18)-5,37-42oC, RTase,mRNA,mRNA,cDNA,10min,1-2h,RT,第一步： 打开RNA链之间的二级结构， 使Oligo dT 特异性地结合到 PolyA 尾。 总RNA 9 l Oligo dT (0.05g/ml) 1 l (终浓度：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置65水浴10min， 然后立即冰浴2min（防止RNA形成二级结构）。,在水浴10分钟时，开始RNA电泳。,按照下列方法进行RT反应：,RNA的变性（甲醛变性法）： 打开RNA分子二级结构，其分子量和电泳距离相关。 5×甲醛变性缓冲液 2 l 甲酰胺 10 l 37%甲醛 2 l RNA样品 4.5 l 上样缓冲液 3 l 混匀后， 21.5 l 直接电泳上样（100伏，1030分钟） 上样前可先预电泳5min。,注意: 电泳槽的清洁！ 所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果,第三步：RNA 的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂： 5RT-buffer 4 l RNasin (40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV 1 l 轻弹管底混合，置42水浴1h。 将上述反应移至68水浴10min（灭活RTase）， 并冰浴，保存备用。,混匀后，可用离心机甩一下,基本过程同DNA电泳一样，但： 1. 必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解； 2. 因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行变性电泳以打开其空间结构，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。,RNA电泳,RNA电泳结果,rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。 RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。,分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。,RNA电泳结果分析,RT引物的用量非常少，因为模板量是固定的，而且只进行一次反应。,关键点： RNA是否充分溶解 根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用1ml Trizol试剂提取出来的总RNA适合于20l体积的逆转录反应体系。 引物的量是否合适 高温退火避免Oligo dT锚锭点错误，同时，打开RNA链之间的二级结构，利于RT。 退火后一定迅速放在冰上,实验报告思考题：,提取细胞内RNA时，如何防止RNA酶的污染？ 如何分析RNA变性电泳的结果，可以据此准确判断RNA是否降解吗？为什么？,实验结束后： 整理实验台； 交实验报告； 值日生值日。,Thanks everyone,
