生化酶课件.ppt

,第五章 酶,第一节 概述2 第二节 酶的化学本质和结构29 第三节 酶催化作用机制55 第四节 酶反应动力学80 第五节 酶活力的测定133 第六节 酶的分离、纯化141,第五章 酶,第一节 概述 第二节 酶的化学本质和结构 第三节 酶催化作用机制 第四节 酶促反应动力学 第五节 酶活力的测定 第六节 酶的分离纯化 第七节 酶工程简介,第一节 概述,一、酶(Enzymes)的概念 酶是由活性细胞产生的、具有高效催化能力和催化专一性的蛋白质，被称为生物催化剂。 不同生物体所含的酶在种类和数量上各有不同，这种差异决定了生物的代谢类型。,二、酶的发展史和酶的本质,1857, 巴斯德发现酒精发酵由酵母活动引起 1878，认识到是细胞中的“酶”的作用 1897，离体酶发酵酒精成功 1926，第一次提纯出结晶酶，证明了酶的本质 酶制剂 酶工程,酶化学本质的逐步认识,1大多数酶是蛋白质,James Batcheller Sumner,John Howard Northrop,1925年，美国化学家萨姆纳首次从刀豆中提纯了脲酶，并证明是一种蛋白质。 美国化学家诺思谱把一系列酶提纯出来，证明它们都是蛋白质。他俩因而共同获得了1946年诺贝尔奖。,Thomas R. Cech University of Colorado at Boulder, USA,近年来，一些研究结果表明，某些RNA分子也有催化活性。 1982年美国科罗拉多大学的T.R.Cech等人发现四膜虫的rRNA前体在完全无蛋白质存在的情况下能进行自我拼接，得到成熟的rRNA产物，因此首次提出了RNA具有酶活性的概念。,2某些RNA有催化活性,Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA,1983年，耶鲁大学的S. Altman 发现核糖核酸酶P至少能催化六种tRNA前体的加工。真正发挥催化活性的是核糖核酸酶P中的RNA成分，而其中的蛋白质成分是非活性的。 酶的化学本质不完全是蛋白质，某些RNA分子也具有催化活性。这类RNA被称为ribozyme（核酶）。 Cech和Altman因此获得1989年的诺贝尔奖。,抗体：特异性地结合抗原且帮助巨噬细胞摄入，摧毁抗原。 酶：高选择性地结合化学反应中特定结构的物质，并催化化学反应，使反应在温和条件下高效率地进行。 抗体酶：具有催化功能的抗体分子。在抗体分子肽链的N端是识别抗原的活性区域，同时被赋予了酶的特性。,3. 抗体酶,4有些DNA也有催化活性,1995年Cuenoud等发现有些DNA分子亦具有催化活性，命名为脱氧核酶（deoxyribozyme).,酶的化学本质：,现在，可以给酶下这样的定义： “酶是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质，包括蛋白质和核酸等”。,What is the difference between an enzyme and a protein?,Protein,All enzymes are proteins except some NAs and not all proteins are enzymes,NA,Enzymes,三、酶催化作用的特点,1、酶与非生物催化剂的共性 1) 反应前后不发生质与量的变化。 2) 用量少、催化效率高。 3) 能加快反应的速度，但不改变反应的平衡点。 4) 都能降低反应的活化能。 例如：H2O2分解 反应在无催化剂时活化能为75.3KJ/mol，用 胶态钯作催化剂时为49.0KJ/mol，而由过氧 化氢酶催化时仅为8.4KJ/mol。,2、酶作为生物催化剂的特性 1) 催化效率极高 反应速度比无催化剂时高1081020倍，比其他催化剂高1071013倍。 常用分子比来表示，即每摩尔的酶催化底物的摩尔数。 Kcat:每秒每个酶分子能催化多少个微摩尔的底物发生转化。,2) 高度的专一性 酶对反应物(底物)具有严格的选择性。一种酶只能催化某一种或某一类特定的底物发生反应。 例：H可同时催化淀粉、脂肪、蛋白质等的水解，而淀粉酶专一催化淀粉水解，脂肪酶专一催化脂肪水解，蛋白酶专一催化蛋白质水解。,3) 反应条件温和 酶在强酸、强碱、高温、高压等条件下会变 性失活，故催化反应一般在常温、常压、接 近中性的溶液中进行。 4) 酶的催化活性是受调节控制的 这是酶与非生物催化剂的本质区别。,四、酶的命名与分类 （一）酶的命名 1、习惯命名法 命名原则： 1、根据被作用底物命名 例： 催化淀粉水解的酶称为淀粉酶；催化蛋白质水解的为蛋白酶。 2、根据催化反应的性质 例： 水解酶催化底物分子水解；脱氢酶催化脱氢反应;转氨酶催化两个底物分子间的氨基转移反应。,3、酶作用的底物和催化反应性质结合起来命名 例：琥珀酸脱氢酶催化底物琥珀酸发生脱氢反应；谷丙转氨酶催化谷氨酸和丙酮酸之间发生氨基转移反应。 4、将酶的来源与底物结合起来 例：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等等。 5、将酶作用的条件（pH）与底物 结合起来 例：碱性磷酸酶、中性纤维素酶等。,2、国际系统命名法 按照国际系统命名法的原则，每一种酶有一个系统名 称和一个习惯名称。系统名称应当明确标明酶的底物 及催化反应的性质。 如谷丙转氨酶，催化反应为： COOH COOH CO COOH H2NCH COOH CH2 H2NCH CH2 CO CH2 CH3 CH2 CH3 COOH COOH -酮戊二酸 L-丙氨酸 谷氨酸 丙酮酸 系统名称： L-丙氨酸-酮戊二酸氨基转移酶,己糖激酶催化反应为： Glc + ATP 6-P-Glc + ADP 系统名称为： ATP己糖磷酸基转移酶 乳酸脱氢酶催化反应为： COOH COOH HOCH NAD CO NADH H CH3 CH3 系统名称为： L-乳酸 NAD氧化还原酶,酶的命名中，习惯命名法简单，但缺乏系统性，有时会出现一酶数名或一名数酶的情况；系统命名法严谨，科学性强，但有时名称太长，使用不便。 在科学文献中，某酶第一次提到时，应 采用系统名称，而在不引起误解的情况下， 可使用习惯名称。,（二）酶的国际系统分类法及编号,根据酶催化反应的性质将酶分为6大类，每个 大类分为若干亚类，每个亚类又分为亚-亚类， 均采用1、2、3、4编号，中间以“.”分开。 EC1.1.1.27： L-乳酸：NAD+氧化还原酶 第一个数字表明：哪一大类 第二个数字表明：哪一亚类 第三个数字表明：哪一亚-亚类 第四个数字表明：在亚-亚类中的排号,乳酸脱氢酶 EC1.1.1.27,表示酶学委员会,1、氧化还原酶类(Oxidoreductases) 反应通式： A.2H + B A + B.2H 特点： 催化氧化还原反应，通常含有辅酶 NAD、NADP、FMN、FAD。 例：乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、过氧化氢酶等。 COOH COOH HOCH NAD CO NADH H CH3 CH3,乳酸脱氢酶,氧化还原酶类中进一步分出亚类来表示底 物中发生氧化的基团的种类。,2、 转移酶类(Transferases),反应通式： A-R + B B-R + A R基团: 除H外的基团，如：-CHO、 -CH3 、 -NH2 、 PO3H2 等 例：谷丙转氨酶(EC2.61.2)、己糖激酶等。 COOH COOH CO COOH H2NCH COOH CH2 H2NCH CH2 CO CH2 CH3 CH2 CH3 COOH COOH,转移酶类中分出亚类表示底物中被转移基 团的性质。 2.1一碳基团 2.2醛或酮基 2.3酰基 2.4糖苷基 2.5除甲基之外的羟基或酰基 2.6含氮基 2.7磷酸基 2.8含硫基,3、水解酶类(Hydrolases),反应通式： A-B + H2O A-OH + BH A-B之间键：糖苷键、肽键、酯键、磷酸 二酯键等。 例：淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶等。 大多属于胞外酶，目前工业上大量生产的 酶制剂中水解酶所占比例最大。,水解酶类中亚类表示被水解的键的类型 3.1酯键 3.2糖苷键 3.3醚键 3.4肽键 3.5其他CN键 3.6酸酐键,4、裂合酶类(Lyases),反应通式： A-B A + B 特点：催化非水解的从底物上移去一个基团留下 双键的反应或逆反应。 可裂解键：C-C、 C-O、C-N、C-S等。 例：醛缩酶、柠檬酸裂合酶、延胡索酸水化酶等。 CH2O P CO CH2O P CHO HOCH CO HCOH HCOH CH2OH CH2O P HCOH CH2O P,醛缩酶,裂合酶类中亚类表示分裂下来的基团与残 余分子间的键的类型 4.1 CC 4.2 CO 4.3 CN 4.4 CS,5、异构酶类(Isomerases),反应通式： A B 其中A与B互为同分异构体（含催化D、L， 、的酶）。 例：磷酸葡萄糖异构酶、磷酸丙糖异构酶等。 CH2OH CHO CO H C OH CH2O P CH2O P,磷酸丙糖异构酶,异构酶类中亚类表示异构的类型 5.1 消旋及差向异构酶 5.2 顺反异构酶,6、合成酶类(Ligases),反应通式： A + B + ATP A-B + ADP + Pi 特点：催化一切须与ATP分解相偶联，由 两种物质合成一种物质的反应。 例：谷氨酰胺合成酶、CTP合成酶、谷胱甘肽合成酶等。 UTP NH3 ATP CTP ADP Pi,CTP合成酶,注意：合成酶催化的反应必须与ATP分解 相偶联，若无ATP的分解，则不属合成酶 类。例如柠檬酸合成酶催化反应为： COOH CO O CH2COOH CH2 CH3CSCoA HOCCOOH CoA COOH CH2COOH 该酶催化柠檬酸的合成反应，但反应无ATP 参与，故该酶应属裂合酶类，称为柠檬酸裂 合酶比较合适。,合成酶类中亚类表示新形成的键的类型 6.1 CO 6.2 CS 6.3 CN 6.4 CC,第二节 酶的化学本质和结构,一、酶的化学本质与组成 酶的化学本质绝大多数是蛋白质*，所以人们 根据酶分子的组成将他们划分为： 单纯酶分子组成全为蛋白质。 结合酶分子组成中除蛋白质外，还有非 蛋白质部分。,对于结合酶来说： 全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子 金属离子 辅助因子(cofactors) 小分子有机化合物 辅助因子本身无催化作用，但一般在酶促反应中 起运输转移电子、原子或某些功能基团的作用。,辅基(prosthetic group)与酶蛋白结 合紧密,辅酶(coenzyme)与酶蛋白结合松弛，用 透析法可以分开,小分子有机化合物,对双成份酶（结合蛋白质）来说，辅助因子与酶蛋白应是11，缺失就表现不出活性，缺少就会影响活性，但超过比例也不会提高活性。,生物体内酶的种类极多，但辅助 因子种类很有限。同一种辅助因子往 往能与多种不同的酶结合，形成不同 的全酶，如氧化还原酶类一般都以 NAD(P)、FMN、FAD为辅助因子。 而某种特定的酶一般只与一种辅酶结 合。故酶蛋白决定酶的专一性，而辅 助因子与酶的活性有关。,二、酶分子的结构与功能,酶催化的高效率、高度专一性和酶活 性可调节性都与酶蛋白本身的结构直接相 关。酶蛋白的一级结构决定其空间结构， 而酶的空间构象是酶催化功能的结构基础。,(一) 单体酶、寡聚酶和多酶复合体,根据酶蛋白分子的特点又可将酶分为三类 1、单体酶(monomeric enzyme ) 催化水解反应的一般都是单体酶。 它是一个具有完整生物功能、独立三级结构的蛋酶蛋白部分只有一条多肽链的酶称为单体酶。分子量在1300035000之间。 如溶菌酶、胰蛋白酶。,2、寡聚酶(oligomeric enzyme ),由两个或两个以上亚基组成的酶称为寡聚酶。 它以四级结构作为完整生物功能分子结构形式。 亚基可以是相同的，也可以是不同的。亚基之间 不是共价结合，彼此之间很容易分开，分开后酶 活性就会丧失。 分子量较大，从35000到几百万。 与单体酶相比，寡聚酶具有变构作用，与调节因子结合后，能发生构象变化，导致催化活性的变化，从而对代谢起调节作用。,3、多酶体系(multienzyme system) 细胞中许多酶常常在一个连续的反应链 中起作用，前一个酶促反应的产物是后一个 酶促反应的底物，这种由若干酶相互连接形 成的反应链体系称为多酶体系，而具体的化 学反应过程称为代谢途径。 例如：糖酵解途径中的10种酶构成了一个多 酶体系。,多酶复合体 有的多酶体系结构化程度更高，由几种酶彼此嵌 合形成一个功能完整的具有特定结构的复合体， 这种多酶体系称为多酶复合体。它有利于一系列 反应的连续进行，大大提高了催化效率，同时有 利于进行调控。 如：脂肪酸合成酶复合体、丙酮酸脱氢酶复合体 这类多酶复合体分子量很高，一般在几百万以上。 四级结构对于多酶复合体很重要，一旦复合体解 体，各个酶单独无法实现催化。,丙酮酸脱氢酶复合体催化的连续反应,（二）酶的活性部位 （ the active site or active center）,酶蛋白分子并不是所有基团都与酶的活性 有关，只有少数特定AA残基的侧链基团和 酶的催化活性有直接关系，这些功能基团 称为酶的必需基团。 必需基团不一定都在活性部位、有些在活 性部位以外起维持酶分子结构的作用。,酶的活性中心 在酶分子三级结构的构象中，有少数必需基团组成的，能与底物分子结合并完成特定催化反应的微区，构成酶的活性部位或酶的活性中心。 构成活性中心的主要是某些AA残基的侧链基团及结合酶的辅助因子。 有的部位负责与底物分子结合称之为结合基团或结合位点；有些部位负责催化反应称之为催化基团或催化位点。,胰凝乳蛋白酶活性中心示意图,酶的活性中心是由少数几个氨基酸组成，这几个氨基酸可能位于同一条肽链上，也可能位于不同的肽链上，因此，酶的活性中心是一个三维的结构，这些活性中心的氨基酸残基在一级结构上可能相距很远，但通过多肽链的盘绕折叠，在空间结构上都处于十分邻近的位置。,活性中心的判断： 1、酶的专一性研究：有专一性底物结构特点确定活性中心的结构。 2、酶侧链基团的化学修饰：保持酶活力的基团，如丝氨酸蛋白酶类活性中心都有丝氨酸。 3、X-射线衍射法,（三）酶的别构部位 有些酶分子除有与底物结合的活性部位外，还具有与非底物的物质结合的部位。这种部位有别于活性部位，而且与之结合的物质对其催化能力有调节作用，故称这个部位为别构部位或调节部位。与别构部位结合的物质为调节剂或别构剂。 具有别构部位的酶称为别构酶（变构酶），它们都属于寡聚蛋白质。,不同亚基组成的寡聚酶 催化亚基-具酶活性中心； 调节亚基-只有调节中心，无酶活中心 相同亚基组成的寡聚酶，每个亚基上同时具有活性中心和调节中心。,苏氨酸脱水酶,（四）酶原（zymogen或proenzyme） 和酶原激活（proenzyme activation） 某些酶（特别是蛋白酶）在细胞内合成时并无催化活性，经过一些酶和酸的作用后激活，才能变成具有活性的酶。这些无催化活性的酶分子前体称之为酶原。 酶原的激活使酶原转变为具有活性酶的作用称为酶原的激活。 如 胰蛋白酶原的激活,胰蛋白酶原激活示意图,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,有活性,有活性、稳定,胰凝乳蛋白酶原,人体肠道内蛋白酶的激活方式： 胰蛋白酶原 肠激酶 胰凝乳蛋白酶原 弹性蛋白酶原 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 弹性蛋白酶 羧肽酶原 羧肽酶,（五）同工酶,又称同功酶，是催化同一化学反应， 而酶分子的结构、组成有所不同的一系列 酶。它们存在于同一个体或组织中，但在 生理、免疫活性和理化性质上都存在差异。 同工酶是由不同亚基组成的二聚体、 四聚体或多聚体，不同的亚基在酶分子中 所占比例不同，酶分子之间即存在差异。,例如：乳酸脱氢酶为四聚体，由M链和H链 以不同的比例组成，共有五种分子形式： M4、M3H、M2H2、MH3、H4。它们虽然都 催化丙酮酸与乳酸之间的氧化还原反应， 但对底物的亲和力不同，对调节因子的敏 感性也不同。,第三节 酶催化作用机制,酶为什么具有如此高的催化效率和专一性? 这与酶催化作用的机制有关。 酶和底物的相互作用和变化过程称之为酶 的作用机制。,关于酶的作用机制，目前较为公认的是Michalis和Menten在 1913年首先提出的中间产物学说，即 中间产物学说的关键在于中间产物的形成，中间产物稳定性较低，易于分解成产物。,E+S,ES,E+P,一、与酶高效催化作用有关的因素,1、底物与酶的接近与定向效应(邻近反应学说与轨道定向学说) 研究发现酶活性中心的底物浓度特别高，并且底物的反应基团与酶活性中心的催化基团相互严格的定向，从而使反应速度提高很多。,金属离子,辅酶,辅酶,金属离子,酶蛋白,2、酶使底物分子的敏感键产生张力或变形 酶分子中某些基团可使底物分子的敏感键中电子云密度部分的增加或减少从而产生“电子张力”使敏感键更敏感，更易于反应。,3、共价催化作用,某些酶能与底物形成一个反应活性很 高的共价中间复合物。底物只需越过较低 的活化能就可以形成产物，从而提高了反 应速度。 共价催化又分为亲核催化和亲电催化。,4、酸碱催化 分为两种： 狭义酸碱催化：由H或OH来催化反应 广义酸碱催化：由质子供体或质子受体来催化反应 这里指的是广义的酸碱催化。酶活性中心的一些基 团（如：氨基、羧基、酚羟基、咪唑基等）可作为 质子供体或受体对底物进行催化，从而加快化学反 应速度。,5、活性中心部位的微环境效应,酶活性中心多半靠近位于疏水微环境 的凹陷中，疏水环境中介电常数较低，故 在疏水环境中两个带电物（底物、酶中心） 之间的静电作用力显著增加，从而使反应 速度加快。,不同酶起主要作用的因素可能不同，各自都有特点。一般来说，多种因素联合作用才是整个反应加快的原因。 例：(11-5C)丝氨酸蛋白酶的催化机制 其中包括共价催化、酸碱催化及底物的靠近与定向,胰凝乳蛋白酶：MW25000 活性中心：Ser195, His57, Asp102。 DFP：二异丙基氟磷酸修饰时，只有Ser195反应，且活性丧失。 TPCK：与His57结合，降低酶活性。 Asp102 在构象中与His57, Ser195靠近， 与水解活性有关。,第一阶段水解反应的酰化阶段。 Ser195羟基氧原子对底物的羰基碳原子亲核攻击，形成短暂四联体过渡态(Transition state)，通过电荷中继网发生了反应，导致敏感肽键断裂，底物中的胺通过氢键与酶的His57咪唑基相连，底物的羧基部分酯化到Ser195羟基上。,胰凝乳蛋白酶对多肽底物水解,第二阶段水解反应的脱酰阶段。 胺释放，水分子进入活性中心，电荷中继网从水中吸收一个质子，结果OH立即攻击Ser195上底物的羰基碳原子，形成了一个短暂的四联体过渡态，然后，His57供出一个质子到Ser195的氧原子上，底物中酸成分从Ser195上释放出来，酶恢复自由状态，进行下一轮催化。,二、关于酶对作用底物的专一性,（一）专一性的类型 1、结构专一性 （1）绝对专一性 一种酶只能作用于一种特定的底物，发生特定的反应，而不作用于其它任何物质。 如：脲酶只能水解将尿素水解为CO2和NH3，对尿素的各种衍生物如甲基取代物或氯化物无催化作用，当然也不能催化尿素发生其它反应。,（2）相对专一性 有些酶的专一性程度较低，能作用于一类化合物或化学键。按酶对所作用的化学键两端的基团有无要求，又分为基团专一性和键专一性。 有的酶作用于底物时，对化学键的某一端的基团要求严格，对另一端的基团则无要求，称为基团专一性。,如：-半乳糖苷酶催化乳糖水解 该酶不仅要求底物具有(14)糖苷键，还要求糖 基部分必须是一个半乳糖。 再如：胰蛋白酶催化蛋白质水解时 O O NHCHCNHCHC R1 R2 不仅要求肽键的存在，还要求在肽键中提供羧基 的氨基酸是Lys或Arg。,而有的酶只要求作用于特定的化学键，对键 两端的基团并无要求，称为键专一性。 如：酯酶可以水解几乎所有有机酸和醇形成 的酯键，对酯键两端的基团没有严格的要求， 只是底物不同时反应速度有所不同，其反应 通式为： O RCOR' H2O RCOOH R'OH,酯酶,2、立体异构专一性,几乎所有酶对立体异构物的作用都具有高度专一性。 （1）旋光异构专一性 当底物具有旋光异构体时，酶只作用于其中的 一种，这种对于旋光异构底物的专一性被称为旋光 异构专一性。 如：L-氨基酸氧化酶只能催化L-AA氧化，对D-AA 无催化作用。 COOH COOH H2NCH H2O O2 CO NH3 H2O2 R R,L-AA氧化酶,（2）几何异构专一性,含碳碳双键的物质有顺反两种异构体，而酶往往 只能作用于其中的一种，称为几何异构专一性。 如：延胡索酸水化酶只能催化延胡索酸（反丁烯 二酸）水化生成L-苹果酸的反应及其逆反应，对 顺丁烯二酸无催化作用。 H COOH COOH C HOCH C CH2 HOOC H COOH,H2O,延胡索酸水化酶,酶的立体异构专一性有时还表现在能 区分从有机化学的观点来看完全等同的基 团。如：甘油激酶只催化甘油分子中的一 个伯醇基与ATP作用，而对另一个伯醇基 不起作用。 CH2OH CH2OH CHOH ATP CHOH ADP *CH2OH *CH2O P,甘油激酶,（二）蛋白酶的专一性,内肽酶,胃蛋白酶R1为芳香族氨基酸或其他疏水性氨基酸 即水解芳香族或疏水氨基酸的羧基或氨基形成的肽键 胰凝乳蛋白酶R1为芳香族氨基酸或疏水性氨基酸 即水解芳香族或疏水氨基酸的羧基形成的肽键 弹性蛋白酶R2为Ala, Gly, Ser等短脂肪链的氨基酸 即水解短脂肪链氨基酸的羧基形成的肽键 胰蛋白酶 R3为碱性氨基酸Lys或Arg 即水解碱性氨基酸的羧基形成的肽键,外肽酶 羧肽酶A Rm：芳香族氨基酸 羧肽酶B Rm：碱性氨基酸 氨肽酶 水解氨基末端的肽键 二肽酶 要求相邻两个氨基酸上的-氨基和-羧基 同时存在,（三）关于酶作用专一性的假说,1、刚性模板学说 这类学说认为酶是刚性结构。 （1）锁钥假说 认为酶和底物的关系类似于锁和钥匙，底物或底物分子的一部分就象钥匙那样能专一性契合到酶的活性中心锁中。它们在结构上具有互补关系。,（2）三点附着学说,认为底物分子中有三个部位与酶分子 中的三个位点互补结合，只有三个点的结 合都匹配时，酶才能显示活性，催化底物 反应。 该学说可以很好的解释酶的立体异构 专一性。例如前述甘油激酶只催化甘油分 子中的一个伯醇基与ATP作用的现象。,CH2OH,C,HO,CH2OH,H,甘油激酶,x,y,z,*,2、诱导契合学说,该学说认为酶分子的结构不是刚性的，而是具有一定的可变性，当底物分子与酶分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于与底物结合的变化，在此基础上酶与底物契合，发生反应。,酶在催化反应时会发生构象变化 例如己糖激酶与底物的结合 例如：柠檬酸裂合酶,第四节 酶促反应动力学(单底物） （酶反应速度和影响因素） 酶促反应动力学(Kinetics)是研究酶促反应速度，反应过程的规律及各种环境因素（底物浓度、温度、pH、E、S、抑制剂、激活剂）等对酶促反应速度的影响的科学。 酶促反应动力学的研究对酶的基础理论和生产 实践都有重要意义。 多底物酶促反应动力学部分请自学（363367）,酶反应速度的测定 酶的反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。 初速度的概念：在酶促反应最初一段时间内的反应速度。 反应速率下降的原因： 1、底物浓度的降低 2、酶的部分失活 3、产物的抑制 4、逆反应速度的增加,dt,dt,一、底物浓度对酶反应速度的影响 1、V-S关系曲线 底物浓度对反应速度的影响,1 当S较低时 一级反应 v=kS 2 当S增大时 混合级反应 3 当S很大时 零级反应 v=Vmax 酶活性中心被底物饱和,反应趋向于极限Vmax,Leonor Michaelis (1875-1949) Maud Menten (1879-1960),2、米氏方程及推导 1913年Michaelis和 Menten提出了底物对反应速度影响的数学表达式： 1925Beiggs和Haldane，提出稳态理论，进行了重要修正和完善： 称为米氏方程（ Mechaelis-Menten Equation ）,假设条件： （1） ES E + P为限速步骤 （2）反应快速达到平衡 dES/dt=0 （3） SEt （4）第二步正反应速度远大于逆反应, k4k3,E + S k2k1 ES k4k3 E + P,稳态法米氏方程的推导：,ES 的生成速度：k1 ES k4EP 0 ES 的分解速度：k2ES k3ES 稳态： k1 ES = （ k2 + k3 ）ES （ k2 + k3 ）/ k1 = ES / ES 令（ k2 + k3 ）/ k1 = Km 则 ES = ES/ Km 据酶守衡方程：Et = E + ES 有： ES = Et S/ （Km + S）,v = k3ES = k3Et S / （Km + S） 又 Vmax = k3ES max = k3Et 有方程：,3、米氏常数的意义 在米氏方程 中，当 时，有 ，得到KmS。 物理意义：使反应速度达到最大速度一半时 的底物浓度。它的单位是浓度单位(mol/L)。,（1）Km是酶的特征性常数，一般只与酶的性 质有关，而与酶浓度无关。不同的酶有不同 的Km值。 Km值受温度、pH的影响。 Km作为常数只是对一定的底物、一定的pH、一定的温度条件而言。测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段，但须在指定的实验条件下进行。,见P359 表9-1 一些酶的Km值,(2) 如果一个酶有几种底物，则对每一种底 物，各有一个特定的Km值。其中Km值最小 的底物称为该酶的最适底物或天然底物。 例如：己糖激酶，催化Glc时的Km值为0.15 mmol/L，催化Fru时的Km值为1.5mmol/L， 故Glc是该酶的天然底物。,(3) Km值的大小可以近似反映酶与底物 的亲和力。 Km值越小表明酶对底物的亲和力越大， Km值越大表明酶对底物的亲和力越小。天然底物与酶的亲和力最大，故Km值最小。,(4) Km与Ks值的关系 Ks称为底物常数， 而 只有当速度常数k2k3时，Km=k2/k1=Ks Km值实际上是指中间产物ES分解速度与形 成速度的比值，而Ks值是指ES的解离常数。 所以严格来说Ks才是真正表示酶与底物亲 和力的指标。,（5）Km与米氏方程的计算,根据米氏方程，由所需达到的v可求得S，也可 由S求得该条件下的v。 例1：要求酶反应按最大速度的99进行，求所 需底物浓度。 将v=0.99Vmax代入米氏方程： 得S=99Km。 例2：已知S=9Km，求该酶催化反应的速度？ v为最大反应速度的90。, Km值还可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径及寻找代谢过程的限速步骤： 测定能催化正逆反应酶的Km及底物的浓度，可根据Km差别判断主要催化方向； 比较代谢途径连续反应中Km差别可推测出限速步骤。,4、米氏常数的求法（双倒数法较常用） 实际上，很难通过v-S曲线直接得到Km。 对米氏方程进行变形，等式左右各取倒数后 可以得到直线方程： 令x=1/S，y=1/v，得到y=ax+b直线方程。,v =,此表达式对应图形A作图最方便，但如用于求常数则最不准确，因为： 很难准确地画出矩形双曲线； 很难画出渐进线； 误差不易察觉。,=,+,该式对应图形B，称为Lineweaver-Burk作图，较常用 ，也称双倒数作图；但也有一些缺陷： 点分布不均匀，集中于1/v轴，不过此缺点可适当选择S克服； 误差放大。在低的S时，本身就容易产生误差；而化成1/v与1/S后，误差显著放大。,=,+,相应的图形为C，称为Hanes作图。这种作图法的优点是点分布均匀，缺点是由于取1/v的缘故，使误差放大，但是比较一致，一般认为适用于常数测定。,v = Vm Km,相应图形为D，称为Eadie-Hofstee作图。这种作图法缺点是点分布不均匀，但没有误差放大，可信度高，更大的优点是各种因素的影响可在图形上表现出来，因此越来越受到人们的重视。,二、酶浓度对反应速度的影响 在正常情况下，酶反应速度与酶浓度之间存在线性关系，在生产上可通过酶量来控制生产时间。 v = k E 前提条件：S足够大， 不存在影响酶活性的 试剂如激活剂和抑制剂。,而当S不足或有影响酶活性的试剂存在时，该关系曲线会发生变形。,三、pH对酶促反应速度的影响 大部分酶的活性受环境pH的影响，在一定pH下酶促 反应有最大速度，高或低于此pH酶反应速度均下降。,钟形曲线,pH影响酶促反应速度的原因： 1. 过酸过碱会影响酶分子的构象，破坏 其稳定性，使酶失活。 2. 当pH改变不剧烈时，酶虽然不会变性， 但底物分子或酶活性中心基团的解离状态 会发生变化，而在它们诸多解离状态中往 往只有一种状态会适于发生反应。 3. pH的改变会影响到酶分子中另一些基 团的解离，从而会影响酶的专一性或活性 中心的构象。,有关最适pH须注意的概念: 最pH并不是酶的特征性常数，它受到底物 的种类和浓度，缓冲液成分等因素的影响。 酶的最适pH和酶的等电点通常并不一致。 多数酶的最适pH在中性或略偏酸性的范围内，但也有例外，胃蛋白酶的最适pH为1.5，精氨酸酶的最适pH为9.8。,一定条件下，能够使酶分子空间结构保持稳定，酶活性不损失或极少损失的pH范围，称为酶的pH稳定范围。每种酶往往都有自己的稳定pH范围，它也是酶的一个基本性质。,酶的pH稳定范围,四、温度对酶促反应的影响,温度对酶促反应速度的影响有两方面： 1. 同一般的化学反应一样，温度升高，底物分子内能增加，进入活化态的分子数增多，速度加快。 2. 随温度的升高，酶蛋白逐渐变性失活，速度降低。 在这两种因素的共同影响下，v与温度间表 现出钟形曲线。,最适温度不是酶的特性性常数，它受反应时间、酶浓度、底物浓度、pH等因素的影响。 酶的热稳定性：一定条件下，不使酶变性或极少变性的温度和温度范围。,五、激活剂对酶促反应的影响 凡是能提高酶反应活性的物质都称为激活剂。,激活剂,无机离子,小分子有机物,金属离子：K+、Na+ 、Mg+、Zn+、Fe+、Ca+,阴离子： Cl-（唾液淀粉酶）,氢离子,螯合剂EDTA，解除重金属对酶的抑制,还原剂：半胱氨酸、谷氨甘肽,具蛋白质性质的大分子物质，可激活无活性的酶原,注意区分酶的激活剂和辅助因子： 辅助因子是酶的组成部分，一旦失去酶就完全丧失活性；而激活剂并非酶的组分，即使没有酶也有活性，它们的存在能提高酶活性。,激活剂特别是无机离子激活剂对酶的作用有以下 特点： 1、选择性 一种激活剂对某种酶有激活作用，对另一种酶可能有抑制作用。 2、存在拮抗现象 例如Na能抑制K对酶的激活， Ca2能抑制Mg2对酶的激活。 3、可相互替代 例如Mg2对激酶的激活作用可被Mn2所取代。 4、浓度的影响 有的激活剂在低浓度范围内对酶有激活作用，浓度过高反而起抑制作用。,六、抑制剂对酶反应速度的影响 区分两类不同的作用： （1）酶的失活 由于理化因素的作用破坏了酶分子的三维结构， 使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。 （2）酶的抑制 不引起酶蛋白变性，而是使酶的必需基团或活 性中心的化学性质改变而导致酶活力下降或丧失 的作用。,抑制剂：某些物质，它们并不引起酶蛋白 变性，但能使酶分子上某些必需基团（主 要指酶活性中心的一些基团）发生变化， 因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶 反应速度降低，能引起这种作用的物质称 为抑制剂。,（一）抑制作用的类型,1、不可逆抑制作用 （irreversible inhibition） 这类抑制剂通常以比较牢固的共价键与酶蛋白中的基团结合而使酶失活，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性。 如有机磷、砷、汞等重金属。,2、可逆抑制作用(reversible inhibition) 这类抑制剂与酶蛋白结合时是可逆的， 可用透析法除去抑制剂，恢复酶的活性。可 逆抑制剂与酶的结合存在一个平衡，根据抑 制剂与底物的关系，可分为三类：,可逆抑制,反竞争性抑制(uncompetitive inhibition),非竞争性抑制(noncompetitive inhibition）,竞争