骨髓细胞化学染色.ppt
骨髓细胞化学染色,细胞化学染色是以细胞形态学为基础，利用化学反应原理，对细胞中的酶类、脂类、糖类及蛋白质等化学物质进行定性、定位或半定量分析的方法。 用于血液系统疾病的诊断、鉴别诊断及疗效判断；用于白血病细胞类型的判断。,基本步骤,1. 固定:目的是保持细胞固有结构和化学成份不变，分蒸汽固定和液体固定。 2. 显示:通过化学反应显示被测物质，有偶氮偶联法，联苯胺法，金属沉淀法等。 3. 复染：作为背景染色，使反应的细胞结构能更清楚显示出来。,原理 机体多余的铁以铁蛋白及含铁血黄素的形式储存。这些铁与低铁氰化钾在酸性溶液中发生反应而呈蓝色。,铁染色,试剂,40g/l亚铁氰化钾溶液。 4%盐酸（38%浓盐酸40ml，小心倒入340ml冷蒸馏水中，混匀） 20g/l伊红溶液。 甲醛溶液。,方法,取骨髓片2张，加固定液固定10min，水洗待干。 将II缓缓滴入I内，混合后染液滴于骨髓涂片上， 37°C放置60分钟，流水冲洗数分钟 流水冲洗，一张待干观察外铁，一张冲洗后用核固红复染1分钟，冲洗待干，观察细胞内铁。,结果观察,幼红细胞核染成鲜红色，胞浆呈淡黄色，铁粒呈蓝绿色。 （1）细胞外铁：用低倍镜观察骨髓小粒,细胞外铁主要存在于巨噬细胞胞浆内,而被染成蓝色，再用油镜判断阳性程度。分为（-）、（+）、（+）、（+）、（+）。,细胞外铁阳性（+）,（2）细胞内铁：油镜下计数100个有核红细胞，记录阳性细胞（胞浆中有蓝色颗粒即铁粒幼细胞）的百分率。同时注意有无环形铁粒幼细胞（6颗以上，并绕核1/2以上者）。,环形铁粒幼红细胞,1.细胞内铁：计算100个中幼红细胞、晚幼红细胞，计数阳性率，正常值20-45%；铁颗粒1-5粒，一般不超过10粒。 2.细胞外铁：观察骨髓小粒中巨噬细胞胞浆内蓝色颗粒。正常为（+）或（+）。,参考值,临床意义 铁染色主要用于缺铁性贫血与铁粒幼细胞性贫血的诊断，也是指导铁剂治疗的一个灵敏而可靠的指标。特别是铁粒幼细胞贫血形成特有的环形铁粒幼细胞，也易与其他类型贫血区别。,中性粒细胞碱性磷酸酶 (NAP)染色(钙-钴法）,原理 当细胞内的NAP活性存在时，在pH为9.29.5的碱性条件下，它可将作用液中的基质-甘油磷酸钠水解，释出磷酸，进而与作用液中的钙离子结合，成为磷酸钙沉淀，再经过硝酸钴和硫化胺的作用，生成不溶性硫化钴，呈黑色沉淀定位于胞浆。,NAP染色测定(偶氮偶联法）,检测原理 血细胞内的碱性磷酸酶（NAP）在碱性环境下，水解-磷酸萘酚钠，产生 -萘酚。后者与重氮试剂偶联形成有色沉淀物，沉淀物的显色深浅 与NAP活性成正比。 试剂盒组成 1. NAP固定液：1瓶×5 2. NAPI液(-磷酸萘酚钠)：1瓶× 5 3. NAPII(坚牢蓝B+tris-HCl)液:1瓶× 5 4.苏木素复染液:1瓶× 5,方法,1.新鲜涂片滴加固定液(4 °C)30秒,水洗待干。 2.将I液置入II液混合成为基质液。将涂片置入后，37°C放置30分钟，流水冲洗数分钟，取出待干。 3.苏木素复染1-2分钟，水洗，待干，镜检。 4.结果显示： 阳性细胞内出现暗红色沉淀物，定位于胞质。 阴性细胞内无红色沉淀物。,(-),(+),(+),(+),(+),(+)、（+）、（+）,积分计算,在油镜下计数100个成熟中性粒细胞，包括杆状核和分叶核粒细胞，结果分级为（-）、（+）、（+）、（+）、（+），分别为0-4分，所有细胞分值之和即为积分值，阳性细胞之和为阳性率。正常范围：10-100分，阳性率10-50%,注意事项,1.标本宜新鲜，若不能及时测定可先用固定液处理后，可保存数天。 2.基质液配制后要及时应用，以免失效或降低阳性强度。 3.基质液为一次性使用，配制后不能反复应用。,临床意义,1.各种急、慢性粒细胞性白血病，其NAP积分可降低甚至为零。 2.各种炎症（细菌性），手术后，灼伤等NAP积分均可升高。 3. NAP活性对下列疾病有鉴别诊断价值： 1）.慢性粒细胞白血病与类白血病反应的鉴别2 ）.慢性粒细胞白血病与其他骨髓增生性疾病 的鉴别,3） PNH与再生障碍性贫血的鉴别 4） 恶性组织细胞病与反应性组织细胞增生症的鉴别 5） 真性红细胞增多症与继发性红细胞增多症的鉴别 6） 区别细菌性感染和病毒性感染,粒细胞和部分单核细胞胞浆中存在过氧化酶，它可将底物(H2O2)分解产生出新生态氧，进而使无色的联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，形成稳定的蓝色物质。,过氧化物酶(POX)染色原理,阳性的中性粒细胞,阳性的原始粒细胞和阴性的淋巴细胞,阳性的粒细胞和阴性的巨核细胞,临床意义,用于鉴别急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病。POX主要存在于粒系细胞中，细胞越成熟，其反应越强。原始单核细胞呈阴性，幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应。淋巴系、巨核系、红细胞系各阶段细胞均呈阴性反应。,酸性磷酸酶(ACP)染色,原理 在酸性条件下(pH值4.9)，磷酸酶将作用液中的基质(甘油磷酸钠)水解，产生磷酸，进而与铅作用生成磷酸铅沉淀于细胞酶活性存在处，然后与硫化铵作用，生成黑色硫化铅沉淀。,临床意义,1.网状细胞、吞噬细胞、组织细胞、粒细胞和单核细胞此酶呈阳性反应。 2.毛细胞白血病时，毛细胞呈阳性反应，且不为L-酒石酸所抑制。 3.戈谢细胞ACP染色阳性，而尼曼-匹克细胞呈阴性。,特异性酯酶(SE)染色 原理 氯醋酸AS-D萘酚酯酶为粒细胞所特有，故称特异性酯酶，可将基质中的氯醋酸AS-D萘酚水解而产生萘酚AS-D，后者与重氮盐偶联生成不溶性有色沉淀定位于胞浆中。,临床意义 1.正常血细胞反应：SE在分化好的原始粒细胞可呈弱阳性反应，早幼粒细胞呈强阳性反应，SE活性不随粒细胞的成熟而增强。单核细胞呈阴性或弱阳性反应，其他细胞均呈阴性反应。,2.急性白血病类型的鉴别：急性粒细胞白血病时，原始粒细胞和早幼粒细胞的SE活性显著增强；急性单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性巨核细胞白血病时，其原始、幼稚细胞均呈阴性反应。,非特异性酯酶(NSE)染色 原理 -醋酸萘酚酯酶存在于单核细胞粒细胞及淋巴细胞中，故称为非特异性酯酶。NSE水解基质液中-醋酸萘酯而产生-萘酚，后者与重氮盐偶联生成不溶性有色沉淀定位于胞质中。,阳性的原始单核细胞,被NaF抑制,被NaF抑制的原单细胞和不抑制的中幼粒细胞,临床意义 1.正常血细胞反应：NSE主要存在于单核细胞系，从原单细胞到成熟单核细胞逐渐增强。阳性反应能被NaF抑制，粒细胞一般呈阴性反应。,2.急性白血病类型的鉴别：急性单核细胞白血病时，NSE呈强阳性或阳性反应，但NSE活性能被氟化钠所抑制，称为氟化钠抑制试验阳性。,急性粒细胞白血病时，有部分病例是弱阳性或阳性反应，但其酶活性不被氟化钠抑制，即氟化钠抑制试验阴性。故本试验可以用于急性单核细胞白血病的诊断及其与急性粒细胞白血病的鉴别。,糖原染色（又称过碘酸-雪夫反应，PAS反应） 原理 含有乙二醇基的糖类，在过碘酸的作用下，经氧化而产生双醛基，醛基进而与碱性复红液(Schiff液)结合，使无色液体变成紫红色染料，并沉着于含有糖原的细胞或组织结构上。,正常血细胞中中性粒细胞、单核细胞、巨核细胞及少数淋巴细胞呈阳性反应。 1.红细胞系列的糖原反应及其诊断意义：正常人、再生障碍性贫血、巨幼红细胞贫血的幼稚红细胞均无阳性反应,临床意义,巨幼贫的PAS染色幼红细胞呈阴性,AML-M6 PAS 染色 （幼红细胞呈颗粒状阳性）,溶血性贫血及MDS偶而有弱阳性反应。红白血病、缺铁性贫血、地中海贫血的幼稚红细胞呈阳性反应。,2.急性粒细胞白血病的原始及早幼粒细胞的糖原一般呈阳性反应，但早幼粒胞浆内多呈弥漫性着色颗粒；急性淋巴细胞白血病有l/51/2呈阳性反应，并可见红色粗大颗粒，形成环状。,ALL PAS 染色阳性（ 杆状核粒细胞也阳性）,原始淋巴细胞,淋巴瘤细胞白血病及慢性淋巴细胞白血病，巨核细胞白血病的原始巨核细胞、幼稚巨核细胞，特别是小巨核细胞的糖原呈强阳性反应，弥漫于胞浆内。,
