液相色谱仪20120226.ppt

液 相 色 谱,高效液相色谱法,液相色谱是色谱中的一类分离与分析技术，其特点是以液体作为流动相。对于大量有机化合物、离子型化合物以及易受热分解或失去活性的物质，不能直接或不适合用气相色谱方法进行分析，因此高效液相色谱的应用领域不断扩大和深入。特别是近几十年来，液相色谱固定相的高度发展，仪器不断更新，高效液相色谱目前已成为许多学科科学研究和日常分析的重要手段。,一、高效液相色谱法的特点,1、高效液相色谱可以分离分析高极性，高分子量和离子型的各种物质，只要被分析对象能够溶解于可作为流动相的溶剂中并能够被检测，就可以直接进行分析。某些目前尚不能被直接检测，或检测灵敏度不够的，也可以采用各种衍生技术，实现这些物质的检测。 2、高效液相色谱仪主要由高压输液泵、进样阀、柱子和检测器等组成。 3、柱子的柱效（以理论板数计）很高，每米可达3万块以上。一般只使用2025cm长的柱子。由于填料的不断发展和改进，目前最短的柱子只有3cm长，板数可达30004000。已能够满足一般分析的需要，并具有很高的分析速度。,4、高效液相色谱仪通常在室温下操作，样品一般不须预处理，操作简便，很容易掌握。 5、高效液相色谱操作的难点在于流动相的选择。可以采用纯溶剂，二元或多元混合溶剂作流动相。但流动相的选择必须遵循一定的规律，并以科学的方法优选。 6、高效液相色谱技术也存在一些问题。柱子价格昂贵，要消耗大量的溶剂，而且许多溶剂对人体是有害的。高效液相色谱仪的价格和损耗也比气相色谱仪高。此外，尚缺少象气相色谱中氢火焰离子化检测器那样的通用型、高灵敏度的检测手段。因此，高效液相色谱无论在技术上，在理论上，还是在应用上都处于发展阶段。,二、高效液相色谱系统,下图是高效液相色谱系统的示意图。 它由输液泵为核心的输液系统、进样器、柱子和检测器四个基本部分组成。实际仪器比图要复杂得多，它们可能有几个泵，几种检测器，自动进样系统，柱和检测器的温度控制系统等。,1、 输液系统 输液系统的作用是向柱子提供压力高，流速稳定的流动相。它以高压输液泵为核心，由溶剂储槽、过滤器、输液泵、梯度溶剂混合器等组成。为了测量系统流量和压力，在输液系统的输出通路上还安装了不同类型的传感元件。 储液槽 储液槽是盛装溶剂的容器。它可以是一个普通的溶剂瓶，或是一个专门设计的储液槽，用于除去溶剂中的气体。 过滤器 各种泵的柱塞、进样阀的阀芯加工的精密度都非常高，微小的机械杂质将导致这些部件的损坏，而不能很好的工作。同时杂质在柱头的积累还影响柱子的使用，增大柱压，因此过滤溶剂，设置过滤器是必须的。 过滤器的芯子通常是一个由多孔聚四氟乙烯制成的具有一定空隙度的圆柱体，镶嵌在一个不锈钢的壳体中，形成一个完整的、安装方便的部件。,高压输液泵 高压输液泵是现代液相色谱装置中最关键的设备，输出高压溶剂是实现快速分析的前提。除了最高使用压力外，还有线性流量范围，输出流量的精确度，泵的操作方式，流量输出或压力恒定的稳定性，以及易于操作和维修等。 高效液相色谱仪中所用的泵可分为两类：恒压泵和恒流泵。恒压泵主要指气动放大泵，泵出口压力在系统中是恒定的，流速由柱的阻力决定。恒流泵有往复泵和注射泵，这类泵输出的溶剂流量恒定，柱前的压力由柱后的阻力确定。目前使用最多的是往复泵。,梯度洗脱装置 当样品是一个含有不同种类组分的复杂混合物时，通常用一种纯的或固定组成的混合溶剂难以实现满意的分离，往往是先溜出来的峰分不开，而后溜出来的峰保留时间太长。因此，在液相色谱中常在一个样品的分析过程中，不断调整混合溶剂的组成，改变溶剂强度或溶剂的选择性。如果溶剂组成随洗馏时间按一定规律变化，称这种洗馏过程为梯度洗脱。梯度洗脱过程溶剂组成的变化可以是线性的，也可以是非线性的；可以是二元的，也可以是三元，甚至多元溶剂的混合。梯度洗脱装置根据溶剂混合时的压力分为两种类型：低压梯度和高压梯度。,低压梯度是溶剂在常压下混合，然后用一个高压输液泵把它输送至柱系统中。多元溶剂在混合室或溶剂罐中混合，并以一定速度改变溶剂的组成。这种方式简单、经济，只能用往复泵。高压梯度使用两台高压输液泵，每台输送一种溶剂，两台泵输出的溶剂在一个混合室内混合。每台泵的溶剂流量由独立的电路或计算机控制，它们按一定比例改变。 对于梯度系统系统来说，关键是要保证流速的稳定，梯度洗脱洗脱重现性好。因此混合室的体积应尽可能地小，且不存在死角。,进样装置 在液相色谱中，进样方式有微量注射器进样，进样阀进样，自动进样装置等。高效液相色谱最主要的特点要求进样器设计要耐高压，死体积小，与溶剂接触的部分具有很好的耐蚀性。 进样口处的隔垫把系统和外界分开。为了使隔垫能承受上百公斤的压力，顶盖的通孔很细，而且长。在系统处于高压时，用一根金属棒压住隔垫的通孔部分，避免内部压力太大把隔垫冲破。液相色谱的进样口目前大部分都是采用六通阀，六通阀进样的原理如图所示。,进样时样品中不应混入杂质。溶解样品的溶剂最好和使用的流动相一致，以防止溶剂变化出现不溶物而堵塞柱子。,检测器 检测器在色谱系统中非常重要。因为液相色谱系统的所有特性都通过检测器的输出信号表现出来。目前液相色谱仪常备的检测器主要是紫外分光光度计和光二极管阵列检测器，示差折光仪，荧光检测器。紫外和示差折光检测器是液相色谱最基本的检测器，下面介绍这两种检测器的工作原理。,紫外、可见紫外分光检测器 这种检测器在液相色谱中应用最广。几乎是一切色谱仪必备的检测器，它的特点是：噪音低、具有相对高的灵敏度、结构简单、易于维修。紫外检测器的工作原理是：当一束紫外光通过样品池时，入射光的一部分被溶液中的某种物质吸收，吸收的多少取决于溶质的性质。溶质的浓度和响应值之间存在线性关系。紫外检测器有固定波长检测器，可变波长检测器两种。可变波长检测器采用氘灯或氘灯与钨丝组合的光源，波长在190800nm范围可调。,示差折光检测器 示差检测器的工作原理每一种物质在一定的温度、压力等条件下都有固定的折光指数。样品组分从柱中洗馏出来与流动相组成一混合物，它的折光指数与纯流动相或纯溶质都不相同。示差折光检测器就是以纯溶剂作参照物，连续监测柱后洗馏物折光指数的变化，并根据变化的差值决定样品中各组分的量由于折光指数具有加合性，任何溶剂都具有一定的折光指数，因此对所有物质都有响应，是通用型检测器。,三、高效液相色谱柱,1、 柱型 目前液相色谱常用的标准柱型是内径为4.6或3.9mm,长度为2025cm的不锈钢柱。柱流动相的体积流速是每分钟1ml左右。填料颗粒度510µm，柱效以理论板数计大约在700010000。液相色谱柱发展的趋势，一是减少颗粒度（35µm）提高柱效，缩短柱长，提高分析速度。另一方面是减小柱径，节省溶剂用量，提高检测浓度，特别是用于复杂组分的分析。,2、 柱的选择性 柱的选择性主要指柱固定相对分离的控制。固定相对不同类型的化合物有一定的选择性。选择固定相的一般标准还是以“相似相溶”原理为基础。如果溶质溶于烃类溶剂，表明它是低极性化合物，这样就可以选用非极性或亚极性固定相。若样品溶于极性溶剂中，如醇类，则可选择极性固定相，也可以选择非极性固定相。实际上，在液相色谱中，由于每一种分离方法所用固定相的种类很少，分离主要靠溶剂的选择。由于十八烷基（ODS或C18）柱能够用于多种化合物的分离，因此它是最常用的固定相。,3、 柱效的评价 要实现对溶质分离，要求柱子具有很高的柱效。影响柱效的因素很多，对柱效的评价也就比较难，一般是测定它们的理论板数n，板数n主要依赖于保留时间（tR）与峰底宽度（Wb）的比值。Wb越窄，这项比值越大，柱效越高。同时还要考虑柱的渗透性，即操作条件下的最小进口压力，以及峰的对称性。 商品柱子在出厂时都附有一张标准谱图，根据所标明的条件，得到重复的谱图，说明这根柱子是合格的。 柱子经过长期使用或保存不当，柱子的性能会下降。突出的表现是在给定溶质和溶剂等操作条件下，峰变宽且对称性不好，可K值下降。,计算峰不对称性的方法见图，峰不对称性因子是在峰高10处测量的。如果柱子引起峰的不对称性大于1.2，说明改柱子的质量不好了，若超过1.6，则这根柱子就不能再使用了。,四、液相色谱流动相及其选择性,1、 流动相的作用 在给定固定相的情况下，溶质的保留和对溶质的分离主要由溶剂的性质决定。在液相色谱中，溶剂可以是非极性的，也可以是极性的。如果与固定相的极性相比，溶剂极性小于固定相的，称这种色谱过程为正相液相色谱。如硅胶作为固定相，正己烷作为流动相的吸附色谱过程。如果与此相反，溶剂的极性大于固定相，如以ODS键合相作为固定相，水和甲醇等作为流动相的分配色谱过程，称为反相液相色谱。有的固定相，如NH2基键合相，可以使用非极性溶剂，极性溶剂，PH27的磷酸缓冲液作为流动相。因此，正相与反相的概念是相对的，取决于两相极性的比较。 在液相色谱中溶剂还用来溶解样品，并用于样品的预处理中。总之，溶剂在液相色谱中是非常重要的，不应和气相色谱中的载气比较，因为后者只起携带样品的作用。,2、 作为流动相的溶剂性质,溶剂的种类和数目是很多的，但是可作为流动相的溶剂的数目相对来说是很少的，说明溶剂的选择在液相色谱中是比较不容易的。1所有的溶剂；2具有合适物理性质的溶剂；3K值合适的溶剂；4值合适的溶剂,可作为流动相的溶剂至少应该具备如下一些性质： 、溶剂具有稳定的化学性质。它不能和固定相发生不可逆的化学反应，也不引起固定相表面活性基团的流失及基质的溶涨。除特殊的分配过程，溶剂只溶解样品，而不发生化学反应。 、溶剂的选择与使用的检测器要有相溶性。在使用紫外检测器时，溶剂应该在选定的紫外区没有吸收，或在溶质最大吸收波长段没有吸收。使用示差折光检测器时，溶质和溶剂的折光指数应有较大的差别，否则检测灵敏度不够高。 、溶剂粘度既影响系统的压降，也影响分析时间。因此使用粘度小的溶剂作为流动相在降低操作成本和加速分析时间方面具有明显的意义。, 溶剂可以从市场买到并易于纯化。在某些分析中，特别是检测灵敏度高时，溶剂的纯度要求很高，所以溶剂应易于获取并易于纯化。 溶剂的沸点不应太低。如果沸点太低在溶剂传输过程中易出现气泡，它将影响输送流量的精度和混合溶剂的组成。 溶剂的毒性应尽可能小，并不易起火。大多数溶剂对人体都是有害的，因此操作者应该注意溶剂使用中的各种安全措施。 成本低。使用液相色谱分离或分析样品要消耗大量的溶剂，这些溶剂使用后一般都不再回收，因此应尽可能使用低成本溶剂。,3、 常用的溶剂 在日常工作中比较常用的溶剂是有限的十几种，如表中列出的16种常用溶剂的性质，其它可选择的溶剂还有：异丙醇、丁醇、异丁醇、环己烷、乙醚等。,在液相色谱中不仅使用纯溶剂，更经常使用二元或多元溶剂的混合流动相，以调节流动相的洗脱强度或流动相的选择性。,4、 缓冲溶液和流动相添加物,在色谱分离过程中常使用缓冲溶液作为流动相，有时只在流动相中添加少量的酸，以保持流动相的氢离子浓度（PH值），提供一定的离子强度。它通过控制酸性或碱性化合物的离解度或络合物的络合常数，达到调整保留时间和分离的目的，也有助于某些化合物峰形的改善。 常用的酸是磷酸、醋酸及其它弱酸。缓冲液是这些酸和它们的盐所构成的水溶液。一般是先确定盐的浓度，通过加入酸的办法调整合适的PH值。磷酸的PH值范围为3.7 5.6，5.88.0，醋酸的PH值范围在1.83.5之间。选择介质和PH值除了考虑被分析样品外，还要考虑色谱系统所用的材料及固定相承受的能力。因为普通色谱系统使用的材料，包括柱管、泵和检测器等，主要是不锈钢，因此对不锈钢有侵蚀作用的酸不宜选用。以硅胶为基体的固定相，PH值在27之间，高于或低于这个范围，由于固定相的不稳定会失去分离效能。,流动相添加物主要指为了某些化合物的分离在流动相中添加一些物质，这些物质与被分析化合物通过共价键、氢键、偶极矩的相互作用形成各种形式的络合物、鳌合物等改变其原有的化学性质，达到分离的目的。在流动相添加手性试剂，利用非手性固定相可获得旋光异构体的分离等。在流动相中添加少量精心选择的试剂，不仅改善了某些化合物的分离，也扩大了色谱的应用范围。,5、 液相色谱的分离度 液相色谱过程的最终目的是实现多组分混合物的分离。色谱中用分离度（R）衡量相邻物质峰的分离程度，它的定义是 R= tR / Wb tR是相邻一对物质的保留时间差（tR2tR1），Wb是它们峰低宽度的平均值（Wb1Wb2）/2。R=1表明两种溶质基本被分开。R=1.5时实现完全分开。要改善分离度，最好的办法是选择合适的溶剂。,6、 梯度洗脱 在液相色谱分离过程中不断改变溶剂组成的方法称为梯度洗脱。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，保持好的峰形，增加溶剂的选择性，保证多组分的分离，提高样品中各物质的分离程度。,五、柱子的维护,高效液相色谱柱子的价格很高，要维持柱子较长的使用寿命应注意以下几点： 1、 固定相对流动相的要求，如溶剂的化学性质、溶液的PH值等 2、 在使用缓冲溶液时，盐的浓度不应过高，且日工作结束后要及时用 纯溶剂清洗柱子，不应过夜。 3、 样品量不应过载，脏样品应预处理，最好使用预柱保护分析柱。 4、 当柱前压力增加或基线不稳时，往往是柱子被玷污所致，可通过改变溶剂的办法使不溶物溶解，柱子再生。正相柱使用水，甲醇等极性溶剂，反相柱使用氯仿或氯仿与异丙醇的混合溶剂。 5、 柱子应该永远保存在溶剂中，键合相最好的溶剂是乙腈。水和醇或它们的混合物都不是最好的选择。,六、溶剂脱气,在常温、常压下水和有机溶剂都溶解一定量的气体，如果不除去可能带来许多问题。如：产生气泡、空气中的氧可能导致检测器的噪音，灵敏度下降或者它们会氧化分析物，损坏柱子。因此溶剂在使用前需要脱气。,七、高效液相色谱操作规程,方法编辑、保存,案例分析一,案例一：天麻素的高效液相色谱分析 天麻为兰科植物天麻Gastrodia elata Blume的干燥块茎。是一味常用而较名贵的中药，临床多用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等症。天麻过去一直依赖野生资源，20世纪70年代野生变家种成功后，家种天麻成为主要商品来源。有效成分为天麻素。 利用高效液相色谱法测定天麻素的含量。,案例分析一,分析条件 液相色谱仪: Agilent 1200 ; 配置：四元梯度泵，DAD检测器，柱温箱，自动进样器。 色谱柱： Agilent Zorbax SB-Aq,250×4.6cm，5m； 检测波长：220nm； 进样量：10l； 柱温：28.0； 流动相：乙腈：0.05%磷酸溶液= 3 : 97,案例分析一,案例分析一,案例分析二,甘草苷的高效液相色谱分析 甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch 的干燥根及根茎。是一味补益中草药，功能主治：补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，调和诸药。甘草的主要成分是甘草酸（glycyrrhizic acid），分子式C42H62O16。又称甘草甜素。为甘草次酸的二葡萄糖醛苷（见苷），是甘草的甜味成份。它具有抗炎、抗病毒，和保肝解毒及增强免疫功能的作用。临床被广泛用于治疗各种急慢性肝炎、支气管炎和艾滋病，还具有抗癌防癌、干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂等功能。我们可利用高效液相色谱法测定甘草酸的含量。,案例分析二,分析条件 液相色谱仪: Agilent 1200 ; 配置：四元梯度泵，DAD检测器，柱温箱，自动进样器。 色谱柱： Agilent Zorbax SB C18，,150×4.6cm，5m； 检测波长：276nm； 进样量：10l； 柱温：28.2； 流动相：乙腈：0.5%冰醋酸溶液= 20 : 80,案例分析二,案例分析二,案例分析三,人参皂苷的高效液相色谱分析 分析条件 液相色谱仪: Agilent 1200 ; 配置：四元梯度泵，DAD检测器，柱温箱，自动进样器。 色谱柱： Agilent Zorbax SB C18，,150×4.6cm，5m； 检测波长：203nm； 进样量：10l； 柱温：30 ； 流动相：0-25min 19%-20%乙腈：0.1%磷酸溶液，25-60min 20%-40%乙腈，60-90min 40%-55%乙腈，90-100min 55%-60%乙腈。,案例分析三,案例分析三,案例分析四,当归有效成分的高效液相色谱分析 分析条件 液相色谱仪: Agilent 1200 ; 配置：四元梯度泵，紫外可变波长检测器。 色谱柱： Agilent Zorbax SB C18，250×4.6cm，5m； 检测波长：284nm； 进样量：20l； 柱温：28 ； 流动相：采用梯度洗脱。A:乙腈;B：水，0-15min A从5%升至70%，15-30min A保持70%.,案例分析四,案例分析四,案例分析五,红景天苷的高效液相色谱分析 分析条件 液相色谱仪: Agilent 1200 ; 配置：四元梯度泵，DAD检测器，柱温箱，自动进样器。 色谱柱： Agilent Zorbax SB C18,150×4.6cm，5m； 检测波长：275nm； 进样量：10l； 柱温：26.2； 流动相：甲醇：水=15:85,案例分析五,案例分析五,