二倍体和三倍体虹鳟精液低温保存寿命的研究.doc

二倍体和三倍体虹鳟精液低温保存寿命的研究第24卷第1期2011年3月水产学杂志CHINESEJOURNALFISHERIESVo1.24,No.1Mar.2011文章编号:10053832(2011)01003004二倍体和三倍体虹鳟精液低温保存寿命的研究龚丽,刘奕,杨翟平,郑金霞,范兆廷(东北农业大学动物科技学院,黑龙江哈尔滨,150030)摘要:与二倍体(2n组)精原液做比较,以不同密度为组别,研究了4下两组(3nHD和3nLD)三倍体虹鳟(Oncorhynchusmykiss)精原液的保存时限.结果发现,随着保存时间的延长,精液中精子的活力和寿命逐渐降低.2n组,3nHD组和3nLD组虹鳟精原液中精子分别在保存5d,4.5d和12.5d后失去活力;在7d,15d和14.5d后死亡,即三倍体虹鳟精原液4保存时间约为二倍体的2倍,说明低温短期保存三倍体虹鳟精原液可以取得较好效果.关键词:虹鳟;三倍体精液;低温保存;寿命中图分类号:$961.1文献标识码:ACryopreservationofSemeninDiploid-andTriploidRainbowTroutOncorhynchusmykissGONGLi,LIUYi,YANGZhaiping,ZHENGJinxia,FANZhaoting(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NortheastAgricultureUniversity,Harbin150030,China)Abstract:Thecryopreservationtimeofsemenwasstudiedindiploid(2n)andtriploidrainbowtrout(Oncorhunchyusmykiss)at4.Theresultsshowedthatthespermmotilityandlifespanweredecreasedwiththepreservationtimeprolongation.Thespermlostrapidmotilityafter5dreservationingroup2n,after4.5dreservationingroup3nHI)andafter12.5dreservationin3nLD.andwasdiedaf-ter7dreservationingroup2n,after15dreservationingroup3n-HDandafter14.5dreservationin3nLD.At4,thepreservationtimeofsemeninthetriploidrainbowtroutwasfoundtobetwotimeslongerthanthatinthediploidrainbowtrout,indicatingthatthesemenofthetriploidrainbowtroutcanbepreservedforashorttimeat4.Keywords:rainbowtrout;semenoftriploids;cryopreservation;lifespan虹鳟(Oncorhynchusmykiss)原产北美洲山区河流中,是一种冷水性鱼类,其肉质肥厚细嫩,刺少味鲜,是世界上重要的养殖鱼类之一.虹鳟的繁殖生物学具有典型的冷水性鱼类的特征,冬季产卵繁殖,配子便于长期储存和运输,因此全面深入地了解虹鳟精液低温短期保存对优良种质的利用,长距离配子的运输以及繁殖季节不同群体的杂交具有重要意义.因奇数染色体引起的减数分裂障碍,三倍体虹鳟具有生长快个体大,肉质好,并可部分避免因性成熟而导致的商品性能下降,生长期缩短的问题,因而得到广泛的利用.三倍体虹鳟卵巢发育出现类雄性化趋势,不能正常发育产生卵子,在生产中利用这一现象生产大规格商品鱼(三文鱼)具有较大的优势.然而,j倍体虹鳟精巢能够发育成熟,但较二倍体发育迟缓,其产生的精液外观正常,精子具有活力,但对其生物学研究的很少,尤其是没有可授精的对象,其授精能力尚且未知.本文深入研究了低温保存状态下普通二倍体和人工诱导三倍体雄性虹鳟精子寿命与活力,以期为虹鳟精子的保存方法及三倍体雄性的育性的进一步探讨提供基础.1材料与方法2009年12月采集9尾健康成熟的三倍体虹鳟(3n组)(平均体重:1764.714-87.61g;平均叉长:收稿日期:2011-1_19作者简介:龚丽(1985一),女,四川眉山人,在读硕士研究生,从事鱼类遗传育种研究.Email:gongli2704163.cOYl?通讯作者:范兆廷(1954一),男,主婪从事鱼类育种及生物技术研究.email:fanzt2003yMmom1期龚丽等:二倍体和三倍体虹鳟精液低温保存寿命的研究?31?51.63-4-3.75cm)的精液,其中5尾精液样本为乳白色,密度较高,记为3nHD组,4尾的精液为淡白色,密度较低,记为3nLD组,以及5尾二倍体虹鳟(2n组)(平均体重:1373.14±23.86g;平均叉长:46.53±4.07cm)的精液,分别装于5mlEP管中,低温带回实验室,不做任何处理,4保存.采精过程中防止水溅人,避免粪,尿污染.参考王炳谦等t'进行的不同保存温度及时间对大鳞大马哈(Oncorhynchustshawytscha)精子活力影响的试验,本试验以4为精液低温保存温度.每间隔12h于室温下(约18)用解剖针针尖沾取少量精原液于干净的载玻片上,加l0ul蒸馏水激活,光学显微镜(×40)下观察,秒表测定精子活力和寿命,每次3个重复.精子活力时间(movementtime,)与寿命时问(1ifetime,LT)的确定参见李胜忠等的研究标准.精子密度由红细胞计数板测定.得到的数据经SPSS11.5分析,用Excel作图.2结果与分析试验发现,二倍体(2n组)个体问精液的密度范围在2.08E+102.21E+10个/mll之间,差异不显着(p>0.05),几乎是三倍体密度最大个体的3倍.而三倍体(3n组)中的3nHD组的精液为乳白色,密度为8.00E+9个/ml,明显高于3nLD组的2.35E+9个/ml,其差异极显着(p<0.01)(表1).表1不同组别精液颜色及密度Tab.1Thecoloranddensityofthesemenindiploid(3n)andtriploidrainbowtrout(2n),duringcryopreservation(41二,三倍体的精液经过低温保存,其活力如图1所示.刚采集时2n组快速运动时间为27.92S,显着低于3nHD组和3nLD组(P<0.05),在4下保存120h(5d)后即失去快速运动能力.3nHD和3nLD组刚采集时的快速运动时间为30.89S和30.12s.在4下保存12h后显着上升达最高活力值44.22S和42.25S(P<0.05).随后24h内3nLD组活力显着下降(p<0.05),36h(1.5d)后缓慢降低(p>0.05),直到300h(12.5d)后全部失去快速运动能力.3nHD组精子活力于24h后显着下降(p<0.05),但高于3nLD组,至72h后活力开始低于3nLD组,108h后失去活力.三倍体两组与2n组活力比较发现:3nLD组除3672h区段外,其余时间活力显着高于2n组活力(p<0.05);3nHD组活力仅在保存的前60h显着性高于2n组(p<0.05).即4下保存72h后,2n组和3nHD组的活力都开始显着性低于3nLD组(p<0.05).无论是2n组,还是3n组,精子的活力与寿命随精液保存时间的延长而逐渐降低,但三倍体的两组精液活力与寿命都有先上升后下降的现象.保存时间对精液的寿命影响较大(图2).2n组刚采集时寿命最高为6O.00S,随后显着性降低,至168h(7d)时精子全部死亡.3nHD和3nLD组精子刚采集时的寿命为63.84S和61.65S,4oC下保存12h后显着性上升达最高寿命82.32S和89.90S(p<0.05),在保存48h后两组寿命显着性降低(p<0.05),其余时间寿命缓慢降低,无显着性差异(口>0.05).在360h(15d)和348h(14.5d)时3nHD组和3n-LD组所有精液中的精子完全死亡.与2n组比较发现,2n组的精子寿命保存时问约为3nHD和3nLD组的1/2,且除了初始时问和第60h时间外,其余各时间点3nHD和3nLD组寿命值均显着性高于2n组(p<0.05).3讨论鱼类精液中精子过稠,缺乏氧气与水分,二氧化碳浓度过高,因此,精子在原液中不活动_5,可以通过水或低渗液等溶液激活.鱼类精子的能量储存极为有限,一旦被激活,能量即被迅速消耗.一般鱼类精子的寿命只有几十秒至几分钟.所以对于长距离运输和一些无法现场完成的科研实验,鱼类精液短期保存就显得尤为重要.精子保存方法有常温,低温和超低温保存三种.常温保存是在常温下保存精子,适用于短时间内(048h)的精子保存;超低温保存虽然保存时间长,效果好,但操作难度大,设备复杂,不宜大规模应用r10,11;低温保存精子的保存时问较长,效果较好,且设备要求不高,可在生产实践中大规模应用.但在04CC下,精子的代谢活动并未完全停止,能量?32?水产学杂志第24卷魍蜒:'.王.三:三:.100.0080.0060.0040.0020.O0-0.O04qC保存时间(h)图1低温保存时间对三组精子活力的影晌Fig.1Effectofcryopreservationonthespermmotility=f逛蛾h也在消耗,致使精子会随保存时间的延长,被激活后的运动时间下降,因此,低温保存的保存时间一般仅达510d12.梁伟峰等研究表明,鞍带石斑鱼(inepheluslanceolatus)精液在04C冰箱保存6h活力未显着降低,之后随保存时间的延长,精子活力呈现下降趋势.赵强等l4对暗纹东方纯(Fuguobscuytts)精液低温保存研究发现,随着精液冷藏保存时间的延长,精子的活动时间有所下降,14d下降不明显,57d后精子活动时间明显下降;8d以上精子活动时间下降更加明显.本试验中也发现三倍体精子活力在4条件下保存11.5d后,寿命在保存2d后明显下降;二倍体则在保存0.5d后就出现活力与寿命的显着下降.说明随着保存时问的延长,二,三倍体虹鳟精子活力和寿命都逐渐的降低.有研究表明,在精原液中加入抗生素和氧气或者是用人工精浆稀释都可以有效地保存虹鳟精子达34d和6Od.而本试验未加入抗生素和氧气,发现3nHD组精子活力在保存初期较3nLD组精子活力高,但随着保存时间的延长,其失去活力的时间也早于3nLD组;3nHD组和3nLD组的精子寿命都可以持续到15d左右,但是具有很高密度的2n组精子在7d后就全部死亡.这些现象说明精子的密度对于虹鳟精液保存的活力和寿命都有一定影响,高密度的精液中每个精子占有的空间较小,所必需的各种养分也就相对较少,代谢活动后产生的有害物质更多,相对单位体积氧气少却耗氧多,以及易引发细菌的增长,都会导致精子活力消退和寿命的缩短.另本实验室有研究发现,三倍体虹鳟精子头部要大于二倍体精子头部,可能是由于能量储存要高于二倍体,导致三倍体精子活力和寿命都要高于二倍体(杨翟平等待发表).综上所述,三倍体虹鳟精液低温下短期可以原液保存,且效果好之二倍体精原液.另外,在本试验中发现了三倍体虹鳟精子活力与寿命在保存0.5d后出现极显着性上升(P<0.01),随后再略有降低.而徐革锋等l】7】对尖吻和钝吻细鳞鱼(BrachymystaxLenok)精子研究也发现短时间内低温(4)不会影响精子质量,反而相对增强了精子活力.但是在二倍体虹鳟精子中并未没有发现这一现象,其原因有待进一步探究.上接第18页7891011YHeGH,HoMY,OrbanL,eta1.MicrosatelliteswithingenesandESTsofcommoncarpandtheirapplicabilityinsilvercrucian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