紫杉醇对两种白血病细胞增殖抑制的比较【推荐论文】 .doc

精品论文紫杉醇对两种白血病细胞增殖抑制的比较研究朱丽娜，夏瑞龙，卢燕，付彩云，赵辅昆5（浙江理工大学生命科学学院蛋白质组学与分子酶学研究室，杭州 310018） 摘要：紫杉醇作为一种广谱的抗癌制剂，目前已经用于多种实体肿瘤的治疗。本文旨在比较 紫杉醇对两种白血病细胞增殖的影响。结果显示紫杉醇呈时间和剂量依赖地抑制了 MEL 细 胞和 K562 细胞的增殖。紫杉醇既可以将 K562 细胞周期阻滞在 G2/M 期，还可以诱导 K562 细胞凋亡。相反，经过紫杉醇处理的 MEL 细胞则表现出明显的细胞坏死现象，这些都表明10紫杉醇对两种白血病细胞的作用机制是不相同的。进一步对白血病细胞周期，细胞凋亡和细 胞坏死的研究可以帮助理解紫杉醇诱导白血病细胞死亡的机制。对紫杉醇诱导 MEL 细胞坏 死机制的进一步研究可以促进以紫杉醇为基础的抗癌制剂的发展。关键词：白血病细胞；增殖抑制；细胞凋亡；细胞坏死；细胞周期中图分类号：Q2815Different regulatory pathways are involved in the proliferative inhibition of two kinds of leukemia cell lines induced by PaclitaxelZHU Lina, XIA Ruilong, LU Yan, FU Caiyun, ZHAO Fukun20(Lab of Proteomics & Molecular Enzymology, School of Life Sciences, Zhejiang Sci-TechUniversity, Hangzhou 310018)Abstract: Paclitaxel, one of the broadest-spectrum anticancer agents, is currently used in thetreatment of patients with solid tumors. In our present study, we compared the effect of paclitaxel on two kinds of leukemia cells. Our results showed that paclitaxel could inhibit the proliferation of25MEL cells and K562 cells in a dose- and time-dependent manner. The mechanism of proliferative inhibition treated by paclitaxel on K562 cells was related with the arrest of cell cycle in G2/Mphase, as well as the induction of apoptosis. In contrast, the MEL cells treated by paclitaxel showed obvious necrotic phenomenon, which indicated that the mode of cell death induced by paclitaxel in these two kinds of leukemia cells is different. Advances in research of the cell cycle,30apoptosis and necrosis will extend our understanding of the mechanisms of paclitaxel-induced celldeath, especially in leukemia cells. Further elucidation of necrotic mechanism in MEL cells should expedite the development of better paclitaxel-based regimens for cancer therapy.Keywords: Leukemia cell lines; Proliferation inhibition; Apoptosis; Necrosis; Cell cycle350引言紫杉醇是从太平洋红衫中提取出来的天然抗肿瘤药物，对宫颈癌，肺癌和乳腺癌具有强 烈的抑制作用1-3。作为一种肿瘤化疗药物，紫杉醇的化学结构特殊，由一个环形的紫杉烷 和四个环氧丙烷组成，在 C-13 位置上有一个脂侧链，这个结构拥有一个特殊的作用机制： 抑制微管解聚4。例如，紫杉醇通过增强微管蛋白的聚合作用稳定微管并且直接与微管相互40作用4。 微管蛋白基因点突变及微管蛋白抑制剂与紫杉醇之间有强烈的抑制反应5-7。 自从 1970 年对紫杉醇与微管特殊作用机制的发现开始8，更多的研究表明紫杉醇可以抑制微管的正常解聚，并且将细胞周期阻滞在 G2/M 期。这种抗肿瘤药物的细胞内作用机制基金项目：浙江省“生物医学工程”重中之重学科开放基金(SWYX0903) 作者简介：朱丽娜，（1988-），女，硕士研究生，主要研究方向：肿瘤蛋白质组学。 通信联系人：付彩云，（1981-），女，副教授，主要研究方向：多肽药理学及细胞生物学。E-mail:fucy03126.com- 11 -也引起了广泛的研究兴趣。1993 年，Bhalla 等研究发现，临床使用紫杉醇可以诱导急性粒性白血病细胞 HL-60 和 KG-1 细胞 DNA 断裂为 200 bp 的片段，细胞形态学变化处于程序性45死亡及细胞凋亡之间9。随后，1994 年 Li 等人报道，对化疗期间 110 个不同样本的白血病 病人的骨髓细胞和外周血细胞检测，发现伴随细胞凋亡的 DNA 断裂现象10。近年来，紫杉 醇通过诱导细胞凋亡引起细胞死亡在许多实验室得到证实，如宫颈癌11，胃癌12，前列腺 癌13，肾上腺皮质癌14还有神经胶质瘤15等等。这些研究表明紫杉醇除了抑制微管解聚和阻滞细胞周期这些典型的作用机制外，还可能50通过诱导细胞凋亡杀伤细胞。临床上，紫杉醇已经广泛的应用于实体瘤的治疗，例如宫颈癌， 乳腺癌和肺癌。但是，目前临床上还未见紫杉醇对白血病治疗的报道。因此，研究紫杉醇对 不同种类的白血病细胞的作用机制显得尤为重要。本研究主要比较了紫杉醇对两种不同类型 的白血病细胞（由病毒转染引起的小鼠红白血病细胞株 MEL 以及人慢性髓性白血病细胞株 K562）作用机制的异同。551材料和方法1.1 细胞系及培养人慢性髓性白血病细胞株 K562 由中科院上海生化细胞所提供，浙江理工大学蛋白质组 学和分子酶学研究室培养，保种，并用于实验。小鼠红白血病细胞株 MEL 由北京协和基础 研究所提供，浙江理工大学蛋白质组学与分子酶学研究室培养，保种，用于实验。两种细胞60均使用含 10 %灭活小牛血清的 DMEM 培养基，置于 37 含 5 % CO2 的饱和湿度环境下培 养。取对数生长期细胞作为实验材料。1.2 细胞增殖抑制实验（MTT 实验）取对数生长期的 MEL 细胞和 K562 细胞，以 3×104 个/mL 接种于 96 孔板中培养，每孔 加 100 L 细胞悬液。紫杉醇设立 6 个药物浓度组，每组紫杉醇的终浓度为 0.3 ng/mL，165ng/mL，3 ng/mL，10 ng/mL，30 ng/mL 和 100 ng/mL。每个药物浓度设三个复孔，每孔加入20 L 紫杉醇药物，对照组则加入与药物相同体积的 DMEM 培养基。最终向每孔中补充 80 L DMEM 培养基，使每孔的总体积达到 200 L。将 96 孔板中的细胞置于 37 含 5 % CO2 饱 和湿度环境下培养 24 h，48 h，72 h 和 96 h，在培养结束前 4 h 向每孔加入 10 L 噻唑蓝（MTT） 溶液（5 mg/mL），继续培养 4 h 后离心去掉上清，每孔加入 150 L DMSO 充分溶解紫色结70晶约 10 min，用酶标仪（Varioscan Flash，Thermo）检测 570 nm 处吸光度 OD 值，根据以 下公式计算细胞增殖抑制率。抑制率=（加药组 OD 值对照组 OD 值）对照组 OD 值×100%1.3 细胞形态学观察取对数生长期的 MEL 细胞和 K562 细胞，以 3×104 个/mL 接种于 96 孔板中，每孔加 10075L 细胞悬液。加入终浓度为 0.3 ng/mL，1 ng/mL，3 ng/mL，10 ng/mL，30 ng/mL 和 100 ng/mL 的紫杉醇 20 L，对照组则加入与药物相同体积的 DMEM 培养基。最终向每孔中补充 80 L DMEM 培养基，使每孔的总体积达到 200 L。在 37 含 5 % CO2 的饱和湿度环境下培养24 h，48 h，72 h 和 96 h。先在倒置显微镜（TU-2000 Nikon 显微镜）下观察各个时间点细胞形态学变化，然后吸掉培养基加入 50 L Hoechst 33342（10 ug/mL）避光孵育 10 min 后80在荧光显微镜（TU-2000 Nikon 显微镜）下观察其细胞核荧光变化。精品论文8590951001051101.4 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞坏死取对数生长期的 MEL 细胞和 K562 细胞，以 12×104 个/mL 接种于 10 mL 培养瓶中， MEL 细胞加入终浓度为 50 ng/mL 紫杉醇，同时设置空白对照组加入相应体积的 DMEM 培 养基。K562 细胞加入终浓度为 21 ng/mL 紫杉醇，同时设置空白对照组加入相应体积的 DMEM 培养基。置于 37 含 5 % CO2 的饱和湿度环境下培养 48 h 后收集细胞，2000 rpm/5 min ，去掉培养基后用冷的 PBS 洗 2 次，每次 2000 rpm/5 min 。细胞凋亡检测使用 Annexin-V-FITC 和 PI 双染试剂盒（贝博生物科技有限公司），加入 400 L Annexin-V 结合 液重悬细胞，调整细胞浓度至 1×106 个/mL，向细胞悬液中加入 5 L Annexin-V-FITC 染液 4避光孵育 15 min，再加入 10L PI 染液 4 孵育 5 min 后立即上流式细胞仪检测（ass Aria，BD）。1.5 流式细胞术检测细胞周期取对数生长期的 MEL 细胞和 K562 细胞，以 12×104 个/mL 接种于 10 mL 培养瓶中， MEL 细胞加入终浓度为 50 ng/mL 紫杉醇，同时设置空白对照组加入相应体积的 DMEM 培 养基。K562 细胞加入终浓度为 21 ng/mL 紫杉醇，同时设置空白对照组加入相应体积的 DMEM 培养基。置于 37 含 5 % CO2 的饱和湿度环境下培养 24 h 后收集细胞，2000 rpm/5 min，去掉培养基后用 70%乙醇固定过夜，次日用冷的 PBS 洗 2 次，每次 2000 rpm/5 min。 细胞周期检测使用 PI 单染试剂盒（凯基生物科技有限公司），加入 10L PI 染液室温孵育30 min 后立即上流式细胞仪检测（ass Aria，BD）。2结果2.1 紫杉醇对白血病细胞增殖的抑制作用MTT 实验结果显示，紫杉醇可以呈时间和剂量依赖效应地抑制 MEL 细胞和 K562 细胞 的增殖，如图 1 所示，紫杉醇在 48 h 抑制 MEL 细胞和 K562 细胞增殖的 IC50 值分别为 99.5 ng/mL 和 42.7 ng/mL。此外，对紫杉醇处理后的 MEL 细胞进行显微镜观察显示出细胞坏死 现象如图 2 所示，而紫杉醇处理后的 K562 细胞则显示出明显的细胞凋亡现象如图 3 所示。图 1. MTT 实验检测紫杉醇对 MEL 细胞（A）和 K562 细胞（B）增殖的抑制作用。结果显示紫杉醇可以呈 时间依赖和剂量依赖效应抑制两种白血病细胞的增殖，进行三次独立的重复实验后，使用统计学软件分析， 紫杉醇处理组与对照组相比达到差异极显著水平（*p<0.05, *p<0.01 和*p<0.001）。Fig. 1. Effects of paclitaxel on cellular growth of MEL cells (A) and K562 cells (B) using the MTT assay. The cellular growth was inhibited significantly in a dose- and time-dependent manner. The results are presented as the mean ± SEM of at least three independent experiments. *p<0.05, *p<0.01 and *p<0.001, statistics significant differences vs the control.115120125130图 2 经不同浓度紫杉醇处理 MEL 细胞 24 h （A），48 h （B），72 h （C）和 96 h （D）后形态学和细胞数量变化（400×）。进行三次独立的重复实验后选择代表图片，紫杉醇处理后 MEL 细胞体积增大，数量 减少。Fig. 2. Morphological and quantity changes of MEL cells after paclitaxel treatment at 24 h (A), 48 h (B), 72 h (C) and 96 h (D), respectively. Photographs were taken at 400× magnification. Representative images from three independent experiments were shown.图 3. 经不同浓度紫杉醇处理 K562 细胞 24 h （A），48 h （B），72 h （C）和 96 h （D）后形态学和 细胞数量变化（400×）。进行三次独立的重复实验后选择代表图片，不同浓度紫杉醇处理后 K562 细胞形 态变的不规则，数量减少。Fig. 3. Morphological and quantity changes of K562 cells after paclitaxel treatment at 24 h (A), 48 h (B), 72 h (C) and 96 h (D), respectively. Photographs were taken at 400× magnification. Representative images from three independent experiments were shown.2.2 Hoechst 33342 荧光染色实验Hoechst 33342 可以与 DNA 双链中的小沟（minor groove）结合16，在 350 nm 左右的紫 外光激发下，在 461 nm 处发出蓝靛色荧光。当细胞发生凋亡现象时会出现明显的染色质固 缩，DNA 片段化等凋亡小体现象。实验结果显示，紫杉醇处理后的 MEL 细胞显示出明显的 细胞坏死现象，如图 4 所示。然而紫杉醇处理后的 K562 细胞表现出明显的细胞凋亡现象， 如图 5 所示。135140图 4. Hoechst 33342 荧光染色实验检测紫杉醇处理 MEL 细胞后细胞核形态学变化。使用不同浓度紫杉醇处理 MEL 细胞，培养 24 h （A），48 h （B），72 h （C）和 96 h （D），对照组加入相同体积的 PBS。 培养结束后加入 Hoechst 33342 避光孵育 5 分钟，荧光显微镜观察（400×）。红色箭头所指为坏死细胞。Fig. 4. Effect of paclitaxel on the nuclear morphological changes of MEL cells with the Hoechst 33342 uptake assay. MEL cells were incubated with buffer as the control or with paclitaxel at each concentration for 24 h (Fig.4A), 48 h (Fig. 4B), 72 h (Fig. 4C) and 96 h (Fig. 4D). Then cells were stained with Hoechst 33342 in the dark for5 min, and photographed by inverted fluorescent microscope (magnification 400×). A representative image from three independent experiments was shown. Red arrows indicated the representative necrotic cells.145150图 5. Hoechst 33342 荧光染色实验检测紫杉醇处理 K562 细胞后细胞核形态学变化。使用不同浓度紫杉醇处理 K562 细胞，培养 24 h （A），48 h （B），72 h （C） 和 96 h （D），对照组加入相同体积的 PBS。 培养结束后加入 Hoechst 33342 避光孵育 5 分钟，荧光显微镜观察（400×）。黄色箭头所指为凋亡细胞。Fig. 5. Effect of paclitaxel on the nuclear morphological changes of K562 cells with the Hoechst 33342 uptake assay. K562 cells were incubated with buffer as the control or with paclitaxel at each concentration for 24 h (Fig.4A), 48 h (Fig. 4B), 72 h (Fig. 4C) and 96 h (Fig. 4D). Then cells were stained with Hoechst 33342 in the dark for5 min, and photographed by inverted fluorescent microscope (magnification 400×). A representative image from three independent experiments was shown. Yellow arrows indicated the representative necrotic cells.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞坏死细胞凋亡现象和细胞坏死现象可以使用 Annexin-V-FITC 和 PI 双染法通过流式细胞仪检155160165170测。通过双染法将正常细胞 annexin-V/PI（Q3），早期凋亡 annexin-V+/PI （Q4），晚期 凋亡 annexin-V+/PI+ （Q2）和坏死细胞 annexin-V/PI+ （Q1）区分在四个不同的区域17。 本实验结果显示，使用 50 ng/mL 的紫杉醇处理 MEL 细胞 48 h 后，与未加药处理组相比坏 死细胞明显增加，由 3.10±0.21 增加到 14.68±1.76，而凋亡细胞未发生统计学显著变化，如 图 6 所示。相反，使用 21 ng/mL 的紫杉醇处理 K562 细胞 48 h 后与对照组相比，凋亡细胞 比率显著增高，由 5.87±0.77 到 14.53±2.78，而坏死细胞未发生明显变化（由 2.16±0.53 增加到 3.93±1.46），如图 7 所示。这些结果均与显微镜观察结果一致（图 4 和图 5）。图 6.流式细胞术检测紫杉醇诱导 MEL 细胞凋亡现象。使用 Annexin V-FITC 和 PI 双染法检测 50 ng/ml 紫 杉醇处理 MEL 细胞 48h（B）和对照组（A）之间的差异，经过三次独立的重复实验和统计学分析（C）， 紫杉醇处理组与对照组相比达到差异极显著水平（*p<0.05, *p<0.001）。Fig. 6. Effect of paclitaxel on the apoptosis of MEL cells using the flow cytometry. Apoptosis detection assays were done after incubation with paclitaxel (50 ng/ml) at 48 h (B) compared with control (A) by the double stain assay with Annexin V-FITC and PI. The results are presented as the mean ± SEM of at least three independent experiments (C). *p<0.05, *p<0.001, statistics significant differences vs the control.175180185图 7.流式细胞术检测紫杉醇诱导 K562 细胞凋亡现象。使用 Annexin V-FITC 和 PI 双染法检测 21 ng/ml 紫杉醇处理 MEL 细胞 48h（B）和对照组（A）之间的差异，经过三次独立的重复实验和统计学分析（C）， 紫杉醇处理组与对照组相比达到差异极显著水平（*p<0.001）。Fig. 7. Effect of paclitaxel on the apoptosis of K562 cells using the flow cytometry. Apoptosis detection assays were done after incubation with paclitaxel (21 ng/ml) at 48 h (B) compared with control (A) by the double stain assay with Annexin V-FITC and PI. The results are presented as the mean ± SEM of at least three independent experiments (C). *p<0.001, statistics significant differences vs the control.2.4流式细胞术检测细胞周期使用流式细胞仪检测紫杉醇对 K562 周期的阻滞作用。结果如图 8 所示，加入 21 ng/mL 的紫杉醇处理 K562 细胞 24 h 后与对照组相比，细胞周期中 G2/M 期由 14.66 ± 0.50% 增加 到 85.96 ± 3.24%（P<0.001），达到极显著水平，表明紫杉醇可以将 K562 细胞的细胞周期 明显阻滞在 G2/M 期，从而阻滞 K562 细胞增殖。然而，由于紫杉醇使 MEL 细胞产生了明显 的坏死现象，因此无法检测出 MEL 细胞的细胞周期分布。190图 8.流式细胞术检测紫杉醇对 K562 细胞周期分布的影响。（A）表示对照组细胞，（B）表示用 21 ng/ml的紫杉醇处理 24 h 后的 K562 细胞。经过三次独立的重复实验和统计学分析（C），紫杉醇处理组与对照组 相比达到差异极显著水平（*p<0.001）。Fig. 8. Effect of paclitaxel on the cell cycle distribution of K562 cells using the flow cytometry. Cell cycle detection assays were done after incubation with paclitaxel (21 ng/ml) at 24 h (B) compared with control (A) by PI-binding assay. The results are presented as the mean ± SEM of at least three independent experiments (C).*P<0.001, statistics significant differences vs the control.1952002052103讨论紫杉醇作为一种广谱的抗癌制剂目前已广泛的应用于实体瘤的治疗当中18。但是使用 紫杉醇治疗 26 位白血病病人的临床一期数据显示其在体内诱导细胞凋亡的水平不高19。此 外，紫杉醇对 CD34 阳性的白血病细胞毒性小于 CD34 阴性的白血病细胞，比如 HL-60 细胞 和 U937 细胞。白血病是一种含许多不同的细胞类型和免疫表型的疾病19。因此，研究紫杉 醇对不同类型白血病细胞作用机制的差异具有重大的意义。目前的研究显示，紫杉醇类药物在体内诱导白血病细胞凋亡的效率19-22与体外培养的细 胞凋亡效率一致23-24。然而，目前并没有关于紫杉醇治疗由病毒感染引发的白血病细胞研究 模型的报道。Friend 病毒是一种肿瘤逆转录病毒，可以引起小鼠成红细胞增多症和红细胞增 多症25-26，即小鼠红白血病。本文使用由 Friend 病毒感染引起的 MEL 细胞为研究模型，比 较研究了紫杉醇对 MEL 细胞和 K562 细胞作用机制的不同。目前的实验结果显示，紫杉醇 可以时间和剂量依赖地抑制两种白血病细胞的增殖，而且对 MEL 细胞的毒性作用要大于 K562 细胞。紫杉醇可以诱导 K562 细胞产生凋亡现象22，与本实验结果一致。而且，紫杉 醇将 K562 细胞周期阻滞在 G2/M 期也与之前的报道相吻合27。这些结果都说明紫杉醇是通 过阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡，从而抑制了 K562 细胞的增殖28。相反，紫杉醇不能诱导 MEL 细胞产生明显的凋亡现象，这和紫杉醇在 K562 细胞上观215220225察到的现象不同。已经有文献报道，细胞凋亡和细胞坏死是两种不同的，互相排斥的死亡方式29。细胞凋亡的早期事件是细胞脱水，细胞内水分流失引起细胞大小和细胞形态发生变 化，变成狭长的梭型等其他形状，凋亡细胞的细胞核也发生变化，DNA 出现断裂并形成典 型的凋亡小体。在本研究中，紫杉醇作用 K562 细胞后细胞凋亡现象非常明显，然而在 MEL 细胞上却很难观察到细胞凋亡现象。细胞坏死是一个被动的，分解代谢的，核破裂到衰退的 过程，细胞形态与凋亡相反30。本文的实验结果显示，经紫杉醇处理后的 MEL 细胞产生明 显的细胞坏死现象。而且，由于紫杉醇引起 MEL 细胞坏死，无法检测出细胞周期的正常分 布。这些都充分说明了紫杉醇对这两种不同类型的白血病细胞作用机制是不相同的。4结论紫杉醇作为化疗药物的典型代表，能够与微管产生相互作用。然而，本实验结果显示， 紫杉醇可以使由病毒感染引起的小鼠红白血病细胞株 MEL 细胞产生坏死现象，与人红白血 病细胞株 K562 细胞的作用机制不同。对细胞周期，细胞凋亡和细胞坏死的进一步研究将帮 助理解紫杉醇引起细胞死亡的不同机制，尤其是白血病细胞。进一步研究紫杉醇引起 MEL 细胞坏死的机制将有利于促进以紫杉醇为基础的抗癌制剂的发展。参考文献 (References)2302352402452502552601 Belani, Lynch, Docetaxel (Taxotere) in combination with platinums in patients with non-small cell lung cancer:trial data and implications for clinical managementJ.Semin Oncol,2001,28(2):4-102 Burris.Docetaxel (Taxotere) plus trastuzumab (Herceptin) in breast cancerJ.Semin Oncol,2001,28(2):38-44. 3 Majno G, Joris I. 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