高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞株【精品论文大全】 .doc

精品论文推荐高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞株转录组和蛋白质组研究1孙成荣1 ，唐建武1* ，宋波1 ，孙明忠2 ，刘淑清3 ，张宏颖1 ，王波1 ， 张亚楠1 ，张竹清11大连医科大学病理教研室，辽宁大连 （116027）2大连医科大学生物技术专业，辽宁大连 （116027）3大连医科大学生化教研室，辽宁大连 （116027）E-mail：sun_chengronghotmail.com摘要：转移是恶性肿瘤的基本特征，是造成恶性肿瘤患者死亡的主要原因，其发生机制不 清，是肿瘤学研究面临的难题之一。淋巴道转移是恶性肿瘤早期转移的主要方式，区域性淋 巴结转移是上皮来源恶性肿瘤患者最重要的临床预后因素。因此研究和发现淋巴道转移关键 分子机制和通路，建立起行之有效、有针对性的阻遏手段，对恶性肿瘤治疗具有重要的现实 意义。本课题应用基因芯片、定量蛋白质组学的高通量技术手段在 mRNA 与蛋白质水平对 高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞株基因的差异性表达进行研究，以发现与淋巴道转移相关的 关键性分子及通路，这可为解析肿瘤淋巴道转移的分子机制提供理论基础。首先使用小鼠基 因芯片检测和比较了 Hca-F 细胞（淋巴结转移率高于 70%）和 Hca-P 细胞（淋巴结转移率 低于 30%）的基因在 mRNA 水平表达谱，筛选出在 Hca-F 细胞中表达上调的 901 个基因和129 个 EST，以及在 Hca-P 细胞中表达上调的基因 593 个，EST 208 个。同时，在蛋白质水 平，应用荧光差异双向凝胶电泳（2D DIGE）与质谱（LC-ESI-MS/MS）技术比较了 Hca-F 和 Hca-P 细胞的蛋白质组表达谱，筛选出 163 个有统计学差异的蛋白质点，并对其进行蛋白质鉴定，共得到 168 种蛋白质，其中在 Hca-F 中表达上调的蛋白质为 80 种（86 个蛋白质点），在 Hca-P 中表达上调的蛋白质为 88 种（77 个蛋白质点）。这些差异性表达的基因和蛋白质 可能与肿瘤淋巴道转移有关，分别起到促进或抑制转移的作用。对差异性表达的基因和蛋白 质进行了生物信息学分析，发现具有核苷酸结合功能及参与到核苷酸代谢和蛋白代谢与修饰 的基因和蛋白质占有明显比例，是最为重要的肿瘤淋巴道转移相关基因/蛋白,其中 Anax7、 Clic1 及 Ech1 等是值得深入研究的主要靶基因/蛋白。 关键词：淋巴道转移；肝癌；基因芯片；定量蛋白质组学中图分类号：R735.71. 引言转移是恶性肿瘤的基本特征，是恶性肿瘤患者死亡的主要原因1。恶性肿瘤大部分是上 皮来源的，其转移首先发生在淋巴道，临床上区域性淋巴结转移是上皮来源恶性肿瘤患者最 重要的预后因素2。因此对淋巴道转移机制和转移干预的研究，对于提高恶性肿瘤患者的生 存率和预后有重要的意义。肿瘤的异质性学说指出，高转移力的亚克隆细胞存在于原发瘤中，通过比较遗传背景相 似且具有不同转移能力的肿瘤细胞，可获得影响肿瘤细胞转移能力的重要分子信息。Hca-F（淋巴结转移率高于 70%）和 Hca-P（淋巴结转移率低于 30%）就是这样一对来源于同一亲 本细胞、高度同源且淋巴道转移力显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株3-5。因此将二者在肿瘤淋巴道转移机制研究中互为参照，是难得而有效的细胞系膜型。1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20040161005）和国家自然科学基金（项目编 号 30572098）的资助。- 1 -目前对淋巴道转移机制的初步研究指出，该过程是多基因参与的多参数动态网络体系。本课题应用基因芯片，定量蛋白质组学的高通量技术手段在 mRNA 与蛋白质水平对 Hca-F 和 Hca-P 细胞株基因的差异性表达进行研究，以发现与淋巴道转移相关的关键性分子及通 路，这可为解析肿瘤淋巴道转移的分子机制提供理论基础。2. 材料与方法2. 1 材料2.1.1 实验动物和细胞系 近交系615小鼠由大连医科大学病理学教研室繁育并提供辽实动质字( 2000) 028号。小鼠腹水型肝癌细胞株Hca-F和Hca-P由本教研室建立并保存。2.2 方法2.2.1 细胞培养与动物实验从液氮罐中取出冻存的 Hca-F 细胞与 Hca-P 细胞，复苏后，以每只 2×106/ 0.2ml 分别接 种于入 615 小鼠腹腔内（第一代）。小鼠腹腔孵育一周后，取腹水 0.2ml 分别再接种于入 615 小鼠腹腔内（第二代）。第二代瘤株腹腔孵育一周后，取腹水细胞进行体外培养 24 小时，巨 噬细胞贴壁，瘤细胞悬浮，收集瘤细胞。一部分用于鉴定淋巴结转移率的动物实验，一部分 用于总 RNA 和总蛋白提取。Hca-F细胞和Hca-P细胞以每只2×106/ 0.2ml分别接种于入20只615小鼠的右腋中皮下。接 种后28天，处死小鼠，收集引流淋巴结，经固定，石蜡包埋后，进行常规HE染色，在光镜 下观察并检测淋巴结转移率。2.2.2RNA的提取和表达探针的制备采用 TRIzol 试 剂 分别提 取 Hca-F 和 Hca-P 细 胞的总 RNA, 用 T7-Oligo(dT) 24 引物 ( 5-2GGCCAGTGAATTGTAAT2ACGACTCACTATAGGGAGGCGG2(dT) 24-3)反转录合成 双链cDNA,使用Affymetrix 公司的Enzo RNATranscript Labeling Kit体外反转录合成生物素 标记的cRNA探针。cRNA探针经片段化处理后用于与基因芯片杂交。2.2.3 芯片杂交和扫描实验所用芯片为Affymetrix公司生产的Genome MOE430A (包括22 690个转录本,对应于 约14 500个小鼠已知基因和4 371个EST) 。芯片的杂交、洗脱、染色均在Affymetrix公司的 专用设备Affymetrix Hybridization Oven 640和Affymetrix Fluidics Station 400中完成。使用 Affymetrix公司的G2500AGene- Array Scanner对杂交信号进行扫描。在与小鼠MOE430A 芯 片杂交前, cRNA探针的质量已在与“test chip ”的杂交中被检验和证实。2.2.4 数据处理芯片扫描后获得的数据利用Affymetrix Microarray Suit Software 5.0计算和处理。在比较2 张芯片的结果之前,先对每张芯片的数据进行(Normalzation or Scaling)处理。以Signal Log Ratio (在2张芯片相比较时代表了一个转录本变化的大小和方向) 1 (表明转录本的水平至少 提高2倍)和Change P-value (代表了2张不同的芯片之间一个探针对表达水平相同或不同的可 能性) 0.05 (表明实验组芯片表达水平高于对照组)作为筛选差异表达基因的标准。- 14 -2.2.5 总蛋白提取、定量及荧光标记Hca-F 和 Hca-P 细胞经 TRIS（10mM ）和乙酸镁（5mM, pH 8.0）洗涤三次，并在冷冻 离心机离心三次（12，000 转，4 分）。去上清，取沉淀加入三倍体积的细胞裂解液，并在冰 浴下超声破碎，作用 5 秒，间歇 10 秒，15 个循环。取混合液体在冷冻离心机离心 13，000r/min，15 分，提取上清于新的试管中。采用蛋白定量标准定量.蛋白的荧光标记按照厂家介绍的步骤进行，Cy3（Cy5）染料 400pmol 标记 50g Hca-F 细胞提取的蛋白；Cy5（Cy3）染料 400pmol 标记 50g Hca-P 细胞提取的蛋白；Cy2 染料标 记 Hca-F 细胞和 Hca-P 细胞提取的蛋白各 25g，共计 50g。然后溶于新鲜配制的二甲基甲 酰胺中，在室温，暗室中反应 30 分钟， 10nmol 赖氨酸终止反应。未标记的各组蛋白 150g 与以上标记的蛋白混合，再与同等体积的 2 倍缓冲液混合（2%载体两性电解质 3-10、2%DTT、8mol/L 尿素、4%CHAPS），然后再与 IPG 泡涨液（20mmol/LDTT、8mol/L 尿素、2%CHAPS、0.5%IPG 缓冲液）混合，制成一向等电聚焦体系。2.2.6 双向凝胶电泳及凝胶图像分析20条件下，以上等电聚焦体系重泡涨 IPG 干胶条 10 个小时后，使用 IPGph电泳仪（Amersham Bioscience），按照操作说明，以 50mA 电流等电聚焦 76KVh，具体参数如下：30 V，12 hrs；300 V ，900vhrs；600 V ，1350 vhrs；1000 V ，2400 vhrs；8000 V13500 vhrs；7000 V ，56000 vhrs。将等电聚焦结束的 IPG 胶条放入 SDS 平衡缓冲液和 0.5% DTT (W/V)中 10 分钟，再放 入 SDS 平衡缓冲液和 4.5% 碘乙酰胺(W/V)中 10 分钟。然后将胶条放于 12.5% SDS-PAGE 上，其上含有溴芬蓝，并用低熔点的 1%琼脂糖覆盖。电泳参数为：温度为 15°C， 0.2W，1 小时；0.4 W，1 小时；1.8W，14 小时 4 分钟，直至溴芬蓝从胶的顶部到底部。 显示标记蛋白应用 TyphoonTM9410 成像系统（Amersham Bioscience），Cy2 图像、Cy3图像、Cy5 图像分别使用以下激光扫描和发射过滤器：488nm、532 nm、633 nm；520 nm(BP40)、580 nm (BP30)、670 nm (BP30)。采用 DeCyder （ Amersham Bioscience ） 软件 DIA(differential in-gel analysis) 和 BVA(biological variation analysis)模式，进行凝胶图像分析。估计蛋白点数为 2500，不同凝 胶内分析模式采用配对比较。以 Cy2 为内标计算比值，通过 Cy3 /Cy2 及 Cy5 /Cy2 的比率对 应每个蛋白点含量，并对其进行标准化计算。重复 8 块胶用来计算每个蛋白点平均量的改变， 并进行 t 检验，计算 p 值，设定 p0.05 为有显著性差异。2.2.7 蛋白质点酶切及电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析经 DeCyder 软件分析有统计学意义的蛋白质点后，经自动蛋白质点切割机（Amersham Bioscience）切取后，转移至 96 孔板中，进行胰蛋白酶胶内酶解：以 25mM 碳酸氢胺，100% 乙腈分别洗两次，每次各 10 分钟，弃液体，加入胰酶工作液于冰上水化胶，在 37，50mM 碳酸氢胺中孵育样品过夜，加入 1%三氟乙酸终止反应。冰浴下超声处理胶后离心 20 分， 共进行 2 次，以 50%乙腈和 0.1%三氟乙酸反复提取液体 3 次，然后应用超速真空吸干机浓 缩样品，样品用于电喷雾电离串联质谱。以下为液质联用工作条件和参数，流动相组成：A，5%乙腈与 0.1%三氟乙酸；B，95%乙腈与 0.1%三氟乙酸；梯度条件：7 分钟脱盐，2%乙腈 梯度洗脱（B 的 0%-80%，40 分钟）；柱温度：25；柱流速：200nl/min；仪器校正方法： 由厂家提供的标样进行内校正。毛细管电压：39.5V；毛细管温度：200；能量碰撞：35%；锥孔电压：4.50kV；所有测定均在 ESI（DecaXpPlus ，ThermoFinnigan）方式下进行，碰撞气体为 He；检索参数设定：Xc 值单电荷时设为 1.50，2 个电荷设为 2.00，3 个电荷设为 2.50。 通过 Sequest 软件检索 NCBInr 数据库鉴定肽片段。2.2.8 生物信息学分析进入 DAVID 的网址：http：/david.abcc.ncifcrf.gov/conversion.jsp 点击进入 start analysis， 将鉴定出的蛋白质 Gi Accession 号上传，将蛋白质的 Gi Accession ID 转变为 Entrez GeneID， 将 Entrez GeneID 提交，进行数据库检索。根据检索结果分别进入 Functional Annotation Clustering、 Functional Annotation Chart、Functional Annotation Table 和 Functional Annotation Classification。进入 PANTHER 的网址：http:/www.pantherdb.org/点击进入 Batch ID Search，将在 DAVID 转换的 Refseq Protein Accessions 上传，选择的数据库为 Celera 和 NCBI 的 M. musculus。点 击 search。3.结果3.1 成瘤率和淋巴结转移率Hca-F 细胞株和 Hca-P 细胞株的成瘤率 100%，淋巴结转移率分别为 75%（15/20）和 25%（5/20），两者相比的统计学检验有显著性意义（p0.05），符合本实验对细胞模型的要求。Table 1 The lymph node metastasis rates of Hca-F and Hca-PGroupMetastasisNon-metastasisTotalsP-valueHca-F15520Hca-P51520Totals2020400.002*：2=10.003.2 表达探针及检测芯片的质量Hca-F 和Hca-P 细胞cRNA 探针与Test Chip 杂交后的扫描图显示图上方的“GeneChip TEST 3”字和四角的点及中央的“ + ”字均清晰可见,整张扫描图内的点线分布较均匀,表明 cRNA 探针质量良好(图1) 。图2 是Hca-F细胞cRNA探针与小鼠MOE430A芯片杂交后的扫 描结果,图3是Hca-P细胞cRNA探针与小鼠MOE430A芯片杂交后的扫描结果。检测报告表明 这两张芯片中看家基因-actin和GAPDH 的5端和3端均被检测到且5端和3端的信号比值 明显低于3.0的标准值。此外,外加的阳性对照bioB、bioC、bioD和cre也被检测到且信号强度 随着浓度由低到高呈现出由弱到强的趋势,表明芯片质量良好,检测结果可信。3. 3 芯片检测的结果根据“材料与方法”中介绍的筛选标准, Hca-F与Hca-P相比, Hca-F中表达上调的有901个 已知基因(1 097个转录本) ,占芯片中已知基因的6.2% ,和129个EST(157个转录本),占芯片中 EST的3%；Hca-P中表达上调的已知基因和EST分别为593（686个转录本，4.1%）和208个（231 个转录本，4.8%）。以上数据在本文中未公布。Fig.1 Scanning result of test chipFig.2Scanning result of real chip after hybridization with cRNA from Hca-F cell line Spots indicated the signals of positivegenes in Hca-F cell.Fig.3 Scanning result of real chip after hybridization with cRNA from Hca-P cell line Spots indicated the signals of positive genes in Hca-Pcell.3.4 双向凝胶电泳分离荧光标记蛋白的结果为产生有统计学意义的可靠结果，共跑 4 块平行胶，使用 DeCyder 软件分析图谱，检 测到蛋白质点和匹配上的蛋白质点，结果如表 2 所示。Table 2 The number of detected protein spots and matched protein spots in gelsGel IDLabelNo.of SpotsMatchedGroup1Cy225151486StandardCy325151486FCy525151486P2Cy225081455StandardCy325081455PCy525081455F3Cy224221591StandardCy324221591FCy524221591P4Cy224061551StandardCy324061551PCy524061551F3.5 荧光差异双向凝胶电泳蛋白图谱中差异性蛋白质点的分析所建立的 Hca-P 和 Hca-F 细胞的蛋白质荧光差异双向凝胶电泳蛋白图谱如图 4 所示。 将每块凝胶重叠的总图谱分解为三张图，分别对应 Cy2 标记的标准样品（蓝）、Cy3 标记的 样品（绿）和 Cy5 标记的样品（红）。DeCyder 软件的 DIA 能检测一块胶中完全重叠的三幅 图像，并对三幅图像（一个内标和两个样品）进行共找点，得到一致、精确的比值计算。全 自动进行背景扣除，定量，归一化胶内的匹配以便达到低实验偏差的高通量分析。DeCyder 软件的 BVA 在凝胶之间进行匹配，并检测所有凝胶上的样品之间差异的一致 性，并应用统计学计算每个差异的可信度水平。经分析，Hca-F 和 Hca-P 样品间有统计学意 义的差异性蛋白质点共 163 个（见图 5）。其中比值改变 2 倍以上的差异性点 23 个；1.5 倍-2 倍的差异性点 79 个；1-1.5 倍差异性点 61 个。在 Hca-F 细胞中上调的蛋白质点为 86 个， 在 Hca-P 细胞中上调的蛋白质点为 77 个。Fig.4 2D DIGE image of Hca-F and Hca-P (Gel 1)Fig.5 163 differencial protein spots with statistical significance betweenHca-F and Hca-P in master gel3.6 差异性蛋白质点的质谱鉴定以质谱技术（LC-ESI-MS/MS）对荧光差异双向凝胶电泳技术筛选出的 163 个有统计学 差异的蛋白质点进行蛋白质鉴定分析，共得到 168 种蛋白质，其中在高淋巴道转移力细胞株 Hca-F 中表达上调的蛋白质为 80 种，在低淋巴道转移力细胞株 Hca-P 中表达上调的蛋白质 点为 88 种（本文未公布以上数据）。图 6、图 7 以 Ero1 样蛋白为例的鉴定结果。Fig.6 MS/MS spectrum of LIANM#PESGPSYEFQLTR from protein spot 15Fig.7 The searching result in database from differential protein spot 153.7 差异性表达基因/蛋白的生物信息学分析对以上差异性表达基因和蛋白在在 DAVID 与 PANTHER 数据整合分析系统分别进行基 因表达的细胞位置、发挥的分子功能及所参与的生物学过程及代谢、信号通路的生物信息学 分析。3.7.1 细胞成分（Cell conponent）分析通过 DAVID 分析平台，对差异性 mRNA 和蛋白质进行细胞成分分析，按照 GO（Gene Ontology）的 5 个层次进行分析，每一层次有交叉，且部分概念分类内也有交叉。表 3 为部 分分析结果。Differential mRNAs*Differential proteins*CytoplasmOrganelle402 (25.3%)787（49.6%）93 (55.4%)104（61.9%）Nucleus308（24.0%）Mitochondrion104（6.6%）40（23.8%）Endoplasmic reticulum57（3.6%）10（6.0%）cytoskeleton87（5.5%）18（10.7%）Ribosome23（2.4%）Table 3 The part results of cell conponent category of the differential mRNAs and proteins*该结果所得百分比为涉及在某一概念分类中的差异性基因和蛋白质数量与总的差异性差异性基因和 蛋白质数量的比值。由于分类中有交叉，所以各分类的百分比之和可能超过 100%。3.7.2 分子功能（Molecular function）分析PANTHER 分析结果显示如图 8、9，基因芯片筛选出的差异性表达基因的分子功能分 类中最多的是无法进行分类的基因为 350 个（22.3%）；其次为核苷酸结合基因为 290 个（18.5%）；然后为转录调节因子的基因为 137 个（8.7%）。蛋白质组学筛选的差异性蛋白质 的分子功能分类中最多的是核苷酸结合蛋白为 32 个（19.4%），其次是氧化还原酶与细胞骨 架蛋白各为 20 个（12.1%）。Fig.8 The category of molecular function of differential mRNAs in GenechipFig.9 The category of molecular function of differential proteins in proteomics3.7.3 生物过程（Biological process）分析PANTHER 分析结果显示如图 10、11。基因芯片筛选出的差异性表达基因所参与的生物 学过程的分类中，不能进行分类的基因仍占最多为 360 个（23.0%），其次为核苷酸代谢的 基因为 333 个（23.1%），及蛋白质代谢与修饰的基因为 263 个（16.8%）。蛋白质组学筛选 出的差异性蛋白质所参与的生物学分类最多的为蛋白质代谢与修饰为 48 个（29.1%），其次 为核苷酸代谢与细胞结构与移动分别为 27 个（16.4%）、21 个（12.7%）。Fig.10 The category of biological process of differential mRNAs in GenechipFig.11 The category of biological process of differential proteins in proteomics3.7.4 通路(Pathway)分析DAVID 与 KEGG 等数据库连接，能将所查询的多个基因/蛋白整合至一条代谢或信号通 路上。差异性基因和蛋白质在 KEGG 数据库的代谢和信号通路涉及精氨酸与脯氨酸代谢、 尿素的循环和氨基的代谢、糖酵解和糖异生、碳固定、细胞交流、肌动蛋白骨架调节、黏着 斑、丙酮酸盐代谢、抗原的加工和提呈等，图 12 为黏着斑（focal adhension）通路图。4.讨论*The genes signed by red colour are upregulated in Hca-F Fig.12 The pathway of focal adhension浸润性生长和转移潜能是恶性肿瘤不同于良性肿瘤的根本特征，是恶性肿瘤顽固性和难治性的根本原因。由转移所导致的恶性肿瘤患者死亡率高、预后差和其发生机制不清，长期 以来一直是肿瘤学研究面临的难题。恶性肿瘤淋巴道转移是早期转移的主要方式，因此对于 淋巴道转移机制进行研究，发现淋巴道转移关键分子机制和通路，并建立起一套行之有效的 针对性阻遏手段，将对恶性肿瘤的治疗具有重要的现实意义。小鼠和人类基因组序列具有高度相似性，80%的人类基因在小鼠基因组中能找到相应的基因。因此应用小鼠肿瘤淋巴道转移模型，可为人类肿瘤转移相关基因的筛选、分离提供必 要的基础材料，对探讨恶性肿瘤淋巴道转移机制意义深远。肿瘤的异质性学说指出，原发瘤 的瘤细胞群体异质性强，其内有不同转移潜能的亚群存在6。因此基于该理论，筛选并建立 了多种不同转移潜能肿瘤细胞的细胞模型。Hca-F 和 Hca-P 是本教研室利用可移植性小鼠腹 水性肝癌细胞（H22）将其接种于有正常免疫功能的 615 小鼠足垫，经多次淋巴系统筛选， 得到的高度同源且淋巴道转移能力明显不同细胞株，其中 Hca-F 是具有高转移潜能的细胞 株， Hca-P 是具有低转移潜能的细胞株，二者的差异主要集中在淋巴道转移表型上。因此 应用来源于同一亲本细胞、高度同源，但转移潜能不同细胞模型进行对比研究，可为解析淋 巴道转移机制提供可靠的研究平台。肿瘤转移是由多因素参与，多步骤，多阶段的复杂过程，许多基因及其产物参与并调控 了这一过程。针对这样一个多参数调节的精密动态网络系统，传统的技术手段已不能满足这 一需要，需应用目前国际上已发展起来的高通量技术手段，对这一网络系统进行完整，立体 地诠释。本课题应用高通量的小鼠基因芯片检测和比较了 Hca-F 和 Hca-P 细胞的基因在 mRNA 水平表达谱，筛选出在 Hca-F 表达上调的 901 个基因和 129 个 EST，以及在 Hca-P 表达上调的基因 593 个，EST 208 个。同时，在蛋白质水平，应用荧光差异双向凝胶电泳与 质谱技术比较了 Hca-F 和 Hca-P 细胞的蛋白质组表达谱，筛选出的 163 个有统计学差异的蛋 白质点，并对其进行蛋白质鉴定，共得到 168 种蛋白质，其中在 Hca-F 表达上调的蛋白质为80 种（86 个蛋白质点），在 Hca-P 表达上调的蛋白质点为 88 种（77 个蛋白质点）。这些差 异性表达的基因可能与肿瘤淋巴道转移有关，分别起到促进或抑制转移的作用。这些筛选出的与肿瘤淋巴道转移相关的基因/蛋白质，再次证实了肿瘤淋巴道转移是一个涉及多基因参与的网络体系，但同时我们也注意到，如何对已筛选出的大量差异性基因/蛋白进行深入研 究，以发现肿瘤淋巴道转移的关键基因/蛋白和通路，是目前国内外该领域研究所面临的主 要问题。我们采用国际上新近发展起来的生物信息学技术，对大量数据进行分析，以从中发 现有意义的线索。对这些差异性基因/蛋白所表达的细胞位置分析，显示一半以上的差异性基因/蛋白位于 细胞器。研究表明细胞器活性的损伤能够阻止分化7-8，在细胞死亡过程中，细胞器释放出 的某些因子是诱导凋亡的关键性因素9，一些资料显示细胞器功能紊乱在癌组织的形成、发 展中发挥重要要作用。此外，差异性蛋白质有一半表达在细胞浆内，分析细胞浆内的蛋白质 有较高的溶解性，在双向凝胶电泳中，只有溶解性较高、分子量和等电点适中的蛋白质能被 分离出来，而极性较高，难溶解的膜蛋白难以分离。同时，我们也观察到有多量差异性基因/蛋白质表达在线粒体，线粒体除了参与能量代谢外，它在细胞生理过程中的作用延伸至调 节细胞的增殖、分化和凋亡，当细胞向恶性转化时，这些过程都受到了损害10-11，同样，线 粒体基因组突变、线粒体功能紊乱都能导致癌的形成，甚至能改变癌细胞的表型12-13，因此 线粒体在淋巴道转移中的作用值得进一步探讨。分子功能分析显示出这些差异性基因/蛋白质涉及众多的细胞分子功能。核苷酸结合功 能分类中包含了除无法进行分类以外最多的基因/蛋白，提示这一组基因/蛋白在肿瘤淋巴道 转移中有极其重要的作用。核苷酸结合蛋白（Nucleic acid binding proteins，NBPs）的作用 是调节基因的表达或维持整个基因组结构的完整，据预测人类基因中 13.5%编码该组蛋白 14。干扰 NBPs 的表达能明显改变细胞的基因组表达谱，目前发现的癌基因和抑癌基因很多 都编码 NBPs15。因此该组差异性基因/蛋白可能对肿瘤的淋巴道转移有至关重要的作用。我们进行的生物学过程分析显示，Hca-F 和 Hca-P 差异性基因/蛋白质表达，主要集中于蛋白质代谢和修饰、核酸及核苷酸代谢及信号转导等生物学过程，因而有理由推测这些生物 学过程可能在肿瘤淋巴道转移中发挥了较为重要的作用。值得注意的是涉及信号转导这一生 物学过程的基因/蛋白，在 mRNA 水平的表达数量较多，但在蛋白质水平却很少，这可能是 由于“按需翻译”的基因表达转录后调节机制，Beyer 等 16报道，当环境信号需要细胞快速 反应时，紧急需要的蛋白质，如通过改变转录来调节其表达，显然是太慢了，所以在细胞内 需要保持足够的 mRNA，直到蛋白质被需要时才进行翻译，信号转导功能单位中基因表达 的调节就属于这种转录后调节机制。我们也充分利用数据整合系统在代谢及信号通路上进行分析，发现了许多差异性基因/ 所参与的重要通路。例如粘着斑（focal adhension）与肌动蛋白骨架调节（regulation of actin cytoskeleton）通路。该通路中某些基因过表达能够使肿瘤细胞的侵袭和移动能力增强，而在 黑色素瘤17、口腔癌18及食道癌19中则表现出淋巴道转移的增强。在本研究中有 3 个差异 性蛋白质和基因芯片筛选出的差异性表达基因中的 24 个基因参与到该通路中，而且这些基 因均在 Hca-F 中高表达。此外，基因芯片中 Hca-F 高表达了肌动蛋白骨架调节通路上的 19 个基因，虽只有 3 个差异性蛋白质参与该通路中，但粘着斑通路与该通路是相互联接的，即 粘着斑是通过穿膜粘着受体提供肌动蛋白细胞骨架与细胞外基质的联接，如图 12 所示。如 此多的基因集中于这两条通路中，且均 Hca-F 中高表达，提示这两条通路可能是小鼠肝癌淋 巴道转移中的重要通路。既往的很多研究观察到了基因表达在mRNA与蛋白质水平的不一致性20-21，我们的研究 也显示基因在mRNA水平与蛋白质水平的表达只有很少的相关性，共同在mRNA水平与蛋白 质水平表达的差异性基因，在Hca-F中高表达的基因为18个，占所有在Hca-F中表达上调基因 的1.83%；在Hca-P中高表达的基因为3个，占所有在Hca-P表达上调基因的0.44%。这些在 mRNA水平及蛋白质水平共同表达的差异性基因在肿瘤淋巴道转移中的作用可能至关重要， 如Anax7蛋白属于膜联蛋白家族，具有钙离子结合，钙离子依赖的磷脂结合分子功能， Srivastava等22发现在基因敲除小鼠Anax7(+/-)中，肝癌、淋巴瘤等恶性肿瘤的进展迅速，但 发现其高表达与乳腺癌的侵袭性及HER2阴性的短生存期相关23，故该蛋白还需进一步研究 其与肿瘤淋巴道转移的关系。Clic1的基因产物是一种氯离子细胞内通道蛋白，以可溶性形 式与膜结合形式存在，是胰岛素信号转导通路中的下游影响因子24。在与肿瘤易感性相关 的蛋白研究中，Clic1明显增加25。此外，在分离人肝癌细胞中具有潜在形成肝癌能力的转 化基因时，Clic1明显过表达26。尤其是在一项人胃癌Clic1过表达和它的临床病理学意义的 研究中，Clic1在67.9%的胃癌患者中过表达，且其表达与淋巴结的转移率，病理分期相关， 低Clic1表达组的5年生存率明显高于Clic1高表达组的患者27。除此之外，未再见到Clic1与 肿瘤生长、肿瘤转移相关的报道。Ech1蛋白是一种具有烯酰辅酶水合酶活性的酶，该基因表 达于细胞的过氧化物酶体，参与到脂肪酸氧化的代谢中。过氧化物酶体及其中的酶与肿瘤 之间存在一定关系28， 在Ech1与肿瘤的关系中，有研究发现Ech1在胃癌29中表达下降，在 肠癌中30表达上调。而在其他烯酰辅酶水合酶家族成员中，有与肝癌31、肾癌32、前列腺 癌33的相关报道，但表达结果也不一致，也未见与肿瘤转移的相关报道。因此我们可以对 这些差异性表达的基因/蛋白，进行进一步的功能验证，以作为研究在肿瘤淋巴道转移作用 中的新靶点。5.结论综上所述，本研究利用高通量的基因芯片和定量蛋白质学技术，筛选出大量与肿瘤淋巴 道转移相关的基因/蛋白质，但这些差异性基因/蛋白质中相当一部分有可能是继发性改变， 而非始动因素。因此利用生物信息学对获得的大量数据进行分析，并从中挑选出可能有意义 的基因/蛋白质进行深入研究，可为阐明肿瘤淋巴道转移的机制提供理论基础。参考文献1.Yokota J,Tumor progression and metastasis. Carcinogenesis. 2000 ,21(3):497-5032.Nathanson D. Insights into the Mechanisms of Lymph Node Metastasis, Cancer,July 1, 2003,2( 98),413-423.凌茂英，刘希凤，关素琴，等。小鼠肝癌不同转移力克隆的分离极其特性的研究，中华医学杂志，1990,70（6）：315-3184.陈桑，凌茂英，刘希凤，等。小鼠腹水肝癌高、低转移克隆稳定性的研究，大连医学院学报，1992，14：325.凌茂英，王明辉，郭伶伶，等.Hca/16A3-F 及 Hca/16A2-P 两株小鼠淋巴道转移肝癌细胞系的特性研究， 中华医学杂志，1995,75（3）：170-1716.Poste G,Fidler IJ.The pathogenesis of cancer metastasis.Nature,1980 ,283(5743):139-1467.Kaneko T, Watanabe T, Oishi M. Effect of mitochondrial protein synthesis inhibitors on erythroid differentiation of mouse erythroleukemia (Friend) cells. Mol Cell Biol, 1988,8:331133158.Vayssiere