HCV核心蛋白在HEPG2细胞中对COX2表达的影响.pdf

I S S N 1 0 0 7 一 8 7 3 8 细胞与分子免疫学杂志( C h i n J C e l l M o l I m m u n o l ) 2 0 0 6 , 2 2 ( 3 ) 3 4 3 · 论著 ·文章编号: 1 0 0 7 一 8 7 3 8 ( 2 0 0 6 ) 0 3 一 0 3 4 3 一 0 3 H C V核心蛋白在H e p G 2 细胞中对 C O X - 2 表达的影响 刘艳丽， 闰岩， 白文涛， 张芳琳， 吕 欣， 张伟， 徐志凯* ( 第四 军医 大 学微生 物学教 研 室， 陕 西西 安7 1 0 0 3 2 ) T h e e f f e c t o f H C V c o r e p r o t e i n o n t h e e x p r e s s i o n o f c y c l o o x y g e n a s e 2( C O X - 2 ) i n H e p G 2 c e l l s L I U Y a n - l i ， Y A N Y a n ， B A I W e n - t a o ， Z H A N G F a n g - l i n , L U X i n ， Z H A N G W e i ， X U Z h i - k a i * D e p a rt m e n t o f M i c r o b i o l o g y , F o u rt h M i l i t a r y M e d i c a l U n i v e r s i t y , X i ' a n 7 1 0 0 3 2 ， C h i n a A b s t r a c t A I M: T o in v e s t ig a t e t h e e ff e c t o f H e p a t it is C v i r u s( H C V ) c o r e p r o t e in o n t h e e x p r e s s io n o f c y c lo o x y g e n - a s e 2 ( C O X - 2 ) . ME T H O D S : T h e g e n e s e n c o d e d H C V c o r e p r o t e in w e r e a m p lif ie d f r o m p la s m id c o n t a in in g f u ll le n g t h g e - n o m e o f H C V s t r a in H 7 7 u s in g P C R , a n d w e r e c lo n e d in t o e u k a r y o t ic e x p r e s s io n v e c t o r p c D N A 3 . 1 .T h e r e c o m b in a n t H C V - C / p c D N A 3 . 1 w a s t r a n s ie n t ly c o - t r a n s f e c t e d i n t o H e p G 2 c e lls w it h lu c if e r a s e r e p o rt e r v e c t o r c o n t a in in g C O X - 2 p r o - m o t o r ( C O X 2 p r o l . 5 k b / lu c ) .T h e lu c if e r a s e a c t iv it y a n d C O X - 2 p r o t e in e x p r e s s io n w e r e d e t e c t e d . R E S U L T S : T h e r e o m b in a n t s H C V - C / p c D N A 3 . 1 h a v e b e e n c o n s t r u c t e d s u c - c e s s f u lly . T h e lu c if e r a s e a c t iv it y o f C O X - 2 p r o m o t o r w a s a c - t iv a t e d b y t h e e x p r e s s e d H C V c o r e , a n d t h e in c r e a s e d p r o - t e i n e x p r e s s io n o f C O X - 2 i n t r a n s f e c t e d H e p G 2 c e l ls w a s d e - t e c t e d b y We s t e r n b l o t . C O N C L U S I O N: H C V c o r e p r o t e in c a n a c t iv a t e t h e C O X - 2 p r o m o t o r a n d in d u c e it s e x p r e s s io n , w h ic h p r o v id e s a n e w e x p e r i m e n t a l b a s is f o r f u rt h e r r e s e a c h o n r e l a t io n s h i p b e t w e e n C O X - 2 a n d H C V p a t h o g e n e s is . K e y w o r d s H C V ; c o r e p r o t e in ; C O X - 2 摘 要 目的: 研究丙型肝炎病毒( H C V ) 核心蛋白是否影 响环氧化酶- 2 ( C O X - 2 ) 的表达。方法: 用 P C R从含 H C V H 7 7 株全长基因组序列质粒中扩增H C V核心蛋白 基因， 并克隆至 p c D N A 3 . 1 载体中， 构建H C V 核心蛋白 基因的真核表达载 体 H C V - C / p c D N A 3 . 1 。用H C V - C / p c D N A 3 . 1 和含C O X 一启动子 的荧光素酶报告载体C O X 2 p r o 1 . 5 k b / l u c 瞬时共转染H e p G 2 细胞， 测定萤火虫荧光素酶的活性， 并用 W e s t e rn b l o t 检测 C O X - 2 蛋白的表达水平。结果: 成功地构建了H C V - C / p c D - N A 3 . 1 重组质粒。瞬时转染后的H e p G 2 细胞中， C O X 2 启动 收稿日 期: 2 0 0 5 一 1 0 - 1 7 ; 修回日期: 2 0 0 5 一 1 2 - 2 9 基金项目: 国家自 然科学基金资助项目( N o . 3 0 3 7 1 2 8 0 ) 作者简介: 刘艳丽( 1 9 8 0 一) ， 女， 山西临汾人， 助教， 硕士. T e l ; ( 0 2 9 ) 8 4 7 7 4 5 2 6 ; E m a i l ; l i u h 3 0 6 y a h o o . c o m . c n * C o r r e s p o n d i n g a u t h o r 子荧光素酶的活性显著增强。W e s t e rn b l o t 检测， 发现C O X - 2 的表达明显升高。结论: H C V核心蛋白在H e p G 2 细胞中激活 C O X 一启动子， 并且明显诱导C O X 一的表达， 为进一步研究 C O X 一与H C V 致 病 性的 关系 提供了 新的实 验依据。 关键词丙型肝炎病毒; 核心蛋白; 环氧化酶一 2 【 中图分类号8 3 7 3 文献标识码 A 丙型肝炎病毒( H C V ) 致慢性感染、 肝硬化和肝 癌的机制仍不清楚， 病毒的持续感染与机体免疫状 况以及病毒和机体的相互作用有关。病毒感染可激 活多种信号通路并影响炎症相关基因， 如诱导型一 氧化氮合酶( i N O S ) 基因， 环氧化酶一( c y c l o o x y g e n - a s e - 2 , C O X - 2 ) 基因和干扰素( I F N ) 等 1 , 2 的表达。 C O X是前列腺素( P G s ) 合成过程中的限速酶， 可将 花生四烯酸转变为P G H 2 ， 并可进一步转化为其他前 列腺素如P G E 2 o C O X有两种同工酶C O X - 1 和C O X - 2 0 C O X - 1 在大多数细胞中持续表达， 并参与维持机体 正常的生理功能; 而C O X - 2 在正常组织中通常不表 达， 只有受促有丝分裂原、 细胞因子和其他因素刺激 的 细胞中才被诱导表达团。 近年的研究显示， 多种 肿瘤组织中C O X 一的过度表达与肿瘤发生密切相关。 H C V阳性的慢性肝炎、 肝硬化和H C C患者肝组 织中C O X 一的表达明显高于正常组织或癌旁正常组 织， 提示C O X 一的过度表达在H C V病毒致病过程中 起一定作用。H C V核心蛋白具有多种生物学功能， 可调节多种细胞基因的表达， 影响宿主细胞凋亡和 免疫系统功能， 对病毒持续性感染和H C C的发生起 重要作 用 4 。 本研究旨 在探索H C V 核心蛋白 是否可 影响C O X 一的表达， 为进一步阐明其在 H C V致病过 程中的作用奠定一定的理论基础。 1 材料和方法 1 . 1 材料 大肠杆菌D H 5 a和载体p c D N A 3 . 1 由本室保存。 含H C V全长基因组序列的质粒 H / F L由美国洛克菲勒大学 R i c 。 教 授 提供' 5 ' o C O X - 2 启动子萤火虫荧光素酶报告载体 ( C O X 2 p r o l . 5 k b / l u c ) 为将约1 . 5 k b C O X - 2 启动子区( 一 1 4 3 2 一+ 1 0 4 ) 克隆人p G L I I ， 由 本室构建。 作为内参对照的R e n i l - l a 荧光素酶报告载体购自P r o m e g a 公司。H e p G 2 ( h e p a t o b l a s - t o m a ， 肝母细胞癌)由本科室保存。R P M 1 1 6 4 0 购自G ib c o 公 司。新生牛血清购 自杭州四季青生物材料工程有限公司。 3 4 4 I S S N 1 0 0 7 一 8 7 3 8 细胞与分子免疫学杂志( C h i n 3 C e l l M o l I m m u n o l ) 2 0 0 6 . 2 2 ( 3 B a M H I 和X b a 1 为，T a k a r a 公司产品。引物由上海博亚公司合 成。质粒小量提取试剂盒购自 博亚公司。质粒大量提取试剂 盒、 凝胶回收试剂盒及L u c i f e r a s e 分析试剂( D u a l - L u c i f e r a s e R e p o rt e r A s s a y S y s t e m ) 购自P r o m e g a 公司。L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 转染试剂购自I n v i t r o g e n 公司。胰蛋白脉及酵母提取物购自 宝泰克公司。 兔抗C O X - 2 ( H - 6 2 ) 抗体购自S a n t a C r u z B i o t e c h - n o l o h g y 公司。红外荧光标记的羊抗兔I g G购自R o c k l a n d 公 司。其余试剂均为国产分析纯。 、1 . 2 方法 2 . 1 H C V核心蛋白基因的扩增及真核表达载体的构建 根据G e n B a n k 中H C V的核昔酸序列， 设计引物， 其序列如 下:正 义 链 为:5 ' - G T G G A T C C G C C A T G A G C A C G A A T C C T A - A A C C - 3 ' ( 划线处为B a m H I 的酶切位点) 。反义链为: 5 ' - G T - 工 旦 工 鑫 旦 鑫 TTA G G C T G A A G C G G G C A C A G - 3 ' ( 划线处为X b a I 的 酶切位点) 。用P C R扩增H C V核心蛋白基因， 扩增反应体系 为H / F L 模板微量， 1 0 x T a q B u f f e r 5 N ,L , 2 5 m m o l/ L M g C l , 3 R L , 2 . 5 m m o V L 4 x d N T P 2 p ,L 、 上下游引物各2 0 p m o U L , 加无 菌纯 水至 终体积为5 0 w L 。 反 应条 件为: 9 5 9 0 1 0 m i n , 温 度维持在8 0 加T a q D N A 聚合酶1 w L ( 5 U / p ,L ) 1 m i n ， 扩 增9 4 9 0 4 5 s , 5 0 9 C 4 5 s , 7 2 9 C I m in ， 共3 5 个循环后， 再于 7 2 延伸1 0 m i n ， 置4 冷却。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 鉴定后， 依次经酚/ 氯仿抽提、 乙醇沉淀、 B a m H I 和X b a I 双 酶切过夜， 将回收纯化后的P C R 产物， 与用B a m H I 和X b a I 双 酶切、 低 熔点 琼脂 糖凝胶回 收的 载体p c D N A 3 . 1 于1 6 连 接过夜， 取连接 产物2 p .L 用电 穿孔法转化E . c o l i D H 5 a_ ， 接 种于2 x Y T 培养基， 随机挑取单克隆个菌落， 用试剂盒提取 质粒， 并经B a m H I , X b a I 双酶切鉴定后， 送博亚公司测序证 实， 命名为H C V - C / p c D N A 3 . 1 0 1 . 2 . 2瞬时转染和荧光素酶报告载体的活性测定将 H e p G 2 细胞培养于含1 0 0 m UL 新生牛血清的完全R P M 1 1 6 4 0 ( p H值7 . 1 一 7 . 4 ) 培养基， 置于3 7 9 0 、 5 0 m UL C 0 2 培养箱中 培养。 取2 x 1 护个H e p G 2 细 胞接种于1 2 孔板中， 待细胞长 至9 0 % 一 9 5 %汇合时， 按 I n v i t r o g e n 公司L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 R e a g e n t 试剂说明书进行转染。转染质粒用P r o m e g a 公司质粒 大 量提取 试剂盒 提 取， 以2 W g 的H C V - C / p c D N A 3 . 1 + 0 . 8 p ,g C O X 2 p r o 1 . 5 k b / l u c + 0 . 0 4 W g 的R e n il l a 荧 光 素 酶 报 告载 体为 试验孔， 以2 w g 的p c D N A 3 . 1 + 0 . 8 ji g C O X 2 p r o l . 5 k b / l u c + 0 . 0 4 p ,g 的R e n i l l a 荧光素酶报告载体为无H C V核心蛋白阴性 对照孔， 以2 w g H C V - C / p c D N A 3 . 1 十 萤火虫荧光素酶报告载 体p G L II ( 无启动子空载体) + 0 . 8 p g C O X 2 p r o l . 5 k b / l u c + 0 . 0 4 p ,g 的R e n i l l a 荧光素酶报告载体为无启动子阴性对照 孔， 每孔加3 IL L L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 R e a g e n t 的用量。转染后 6 h ， 换成含 1 0 0 m UL 新生牛血清、 无抗生素的R P M 1 1 6 4 0 培 养液。 转染2 4 h 后收集细胞， 参照P r o m e g a 公司的D u a l - L u - c i f e r a s e R e p o rt e r A s s a y S y e t e m试剂盒中 的 说明 书， 测 定萤 火虫 和R e n il l a 荧光素酶的活性， 根据R e n il l a 荧光素酶的结果校正 萤火虫荧光素酶的结果。 1 . 2 . 3 C O X - 2 蛋白 表达的W e s t e rn b l o t 分析 将3 x 1 0 5 个 H e p G 2 细胞接种于6 孔板内， 至细胞密度达到9 0 %一 9 5 %汇 合时 进行 转染， 转染方法同 上。 同时将5 j g 的H C V - C / p c D - N A 3 . 1 或5 W g 的空载体p c D N A 3 . 1 ， 分别与1 0 w L的L i p o - f e c ta m i n e 2 0 0 0 r e a g e n t 混 合后进行转染， 转染后6 h ， 换成含 1 0 0 m UL 新生牛血清、 无抗生素的R P M 1 1 6 4 0 培养液。转染 2 4 h 后， 用P B S 溶液洗细胞 1 遍， 加入1 0 0 m L l x S D S 裂解液 ( 6 2 . 5 m m o U L T r i s H C l p H 6 . 8 、 1 0 0 m UL 甘油、 2 0 岁L S D S , 5 0 m m o l/ L D T T , 0 . 1 g / L 澳酚兰) 裂解细胞， 再以超声波裂解 细胞2 一 3 次， 每次1 0 一 1 5 s o 9 5 煮沸5 m i n 后， 用1 2 0 岁L 的分离胶做 S 坦 S - P A G E ， 并转移至 P V D F膜上。用封闭液 ( 5 0 群L 脱脂奶， 1 x T B S , 0 . 0 1 % N a N 3 ) 室温封闭3h ， 加 1 : 1 0 0 稀释于封闭液的兔抗C o x 一抗体， 于4 摇床过夜， 用 1 0 m L T B S / T 漂洗3 次， 每次1 5 m i n ， 然后加人 1 : 5 0 0 ( ) 稀释 于封闭液的红外荧光标记的羊抗兔I 多， 4 9 C 避光孵育1 h , 1 0 m L T B S 避光漂洗4 次， 每次5 m i n ， 用O d y s s e y 红外荧光扫 描成像系统进行扫描分析。 Z 结果 2 . 1 H C V核心蛋白基因的扩增及表达载体的构建P C R扩 增的H C V核心蛋白 基因片段大小约为5 7 3 帅( 图1 ) 。 将扩增 的片段克隆入p c D N A 3 . 1 ， 并用电穿孔法转化E . c o l i M o t , 接种于2 x Y T 培养基后， 随机挑取克隆提质粒经B a m H I 和 X b a I 双酶切鉴定可切出5 7 3 b y 的插人片段( 图2 ) ， 测序后与 p c D N A 3 . 1 的质粒序列相比较其核昔酸序列未发现突变， 翻 译起始码前的K o z a k 序列及基因末端的终止码序列均正确插 人， 命名为H C V - C / p c D N A 3 . I o 图1 H C V核心蛋白基因的P C R产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定 F i g 1 I d e n t i fi c a t i o n o f P C R p r o d u c t o f H C V c o r e g e n e b y a g a r o s e e l e c t r o p h o r e s i s M I : L a m b d a D N A H i n d I I I + E c o R I m a r k e r ; 1 : c o r e g e n e f r a g m e n t P C R p ro d u c t ; M 2 : p G E M 7 z f 1i a e I I I D N A m a r k e r . 图2 重组质粒H C V - C / p c D N A 3 . I 酶切鉴定 F i g 2 R e s t r i c t i o n a n a l y s i s o f r e c o m b i n a t i o n p l a s m i d H C V - C / p c D - NA 3 . 1 M 1 : p G E M 7 z f H a e I I I D N A m a r k e r s ; 1 ， 2 ; H C V - C / p c D N A 3 . I / B a m H I + X b a I ; M 2 : L a m b d a D N A H i n d I I I + E c o R I m a r k e r . I S S N 1 0 0 7 一 8 7 3 8 细胞与分子免疫学杂志( C h i n J C e l l M o l I m m u n o l ) 2 0 0 6 , 2 2 ( 3 ) 3 4 5 2 . 2 荧光素酶报告载体的活性测定用 H C V - C / p c D N A 3 . I 和含C O X 一启动子的荧光素酶报告载体C O X 2 p r o 1 . 5 k b / l u c 共转染H e p G 2 细胞后， 测定萤火虫荧光素酶的活性( 结果已 根据R e n i l l a 荧光素酶活性进行校正) 见图3 。可见在 H e p G 2 细胞中瞬时表达的H C V核心蛋白可显著增强C O X 一启动子 的活性， 而H C V核心蛋白 对无C O X 一启动子的p G L I I 几乎无 激活作用。 用p c D N A 3 . 1 与C O X 2 p r o 1 . 5 k b / l u c 共转染H e p G 2 细胞的结果显示， p c D N A 3 . 1 对C O X 一启动子也无激活作用。 以上结果说明， 在H e p G 2 细胞中瞬时表达H C V核心蛋白可 激活C O X 一启动子。 T h e h u m b e rs o f H e p G 2 c e l l s t r a n s f e c t e d w it h d i ff e r e n t p l a s mid s 图3 H e p G 2 细 胞中C O X 一启动 子 荧光素 酶报 告载 体的 活 性 F i g 3 A c t i v i t y a n a y s i s o f C O X - 2 p r o m o t e r l u c i f e r a s e r e p o r t e r v e c - t o r ( C O X 2 p ro 1 . 5 k b / l u c ) i n H e p G 2 c e l l s 1 : H e p G 2 / H C V - C / p e D N A 3 . I + C O X 2 p r o 1 . 5 k b / l u c ; 2 ; H e p G 2 / H C V - C / p c D N A 3 . 1 + p G L I I ; 3 : H e p G 2 / p c D N A 3 . 1 + C O X 2 p r o 1 . 5 k b / l u c . H e p G 2 细胞中瞬时表达的 H C V核心蛋白可增强 . C o x 一启动子的活性， 且增强倍数较高; 而在N u n e z 等 6 的 研 究中H C V 核心 蛋白 对 启 动 子的 激活 倍数均 不高于4 倍。 H C V核心蛋白对细胞内基因表达的调节随所用 病毒株的不同、 核心蛋白的表达水平、 蛋白的表达方 式( 瞬时转染或稳定转染) 以及细胞类型可有所不 同。 如K a 。 等 ， 报道， 在人H C C细胞系H e p G 2 , H u H - 7 , H e p 3 B和人肺癌细胞系H 1 2 9 9中表达低水 平的H C V核心蛋白( 无野生型p 5 3 的细胞系加表达 野生型p 5 3 的表达载体) 可增强p 5 3的转录激活活 J 性; 而表达高水平的H C V核心蛋白则可抑制p 5 3 的 转录激活活性。不同的研究结果也显示 H C V核心蛋 白 可 增 强 或 减弱p 5 3 下游基因p 2 l 的表达 a 。 我们 用p c D N A 3 . 1 真核表达载体在H e p G 2 细胞中表达较 低水平的H C V核心蛋白， 可激活C O X 一的启动子及 增强C O X 一的蛋白表达水平， 为进一步研究 H C V核 心蛋白对C O X 一的表达调节及其在H C V致病中的作 用提供了新的实验依据。 2 . 3 C O X - 2蛋白表达的We s t e r n b l o t 分析用We s t e rn b l o t 检测瞬时转染H C V - C / p c D N A 3 . 1 的H e p G 2 细胞中C O X 一的 蛋白 表达水平( 图4 ) 。 与转染空载体p c D N A 3 . 1 的H e p G 2 细 胞相比较， 转染H C V - C / p c D N A 3 . I H e p G 2 细胞中， C O X 一的 表达水平明显升高。 图4 C O X 一蛋白表达的We s t e rn b l o t 检测 F i g 4 W e s t e rn b l o t a n a l y s i s o f C O X - 2 e x p r e s s io n 1 : H e p G 2 / p c D N A 3 . 1 ; 2 ; H e p G 2 / H C V - C / p c D N A 3 . 1 3 讨论 本研究的结果显示， 在肝癌细胞系H e p G 2中瞬 时表达的H C V核心蛋白， 可显著增强C O X 一的蛋白 表达水平， 同N u n e z 等 “ 的 结果基本一致， 但其研究 中稳定转染H C V核心蛋白的细胞表达C O X 一的水平 与比转染C A T ( 对照) 的细胞相比较C O X - 2 升高的水 平不明显。C O X 一的启.动子中含有 N F - k B , A P - 1 , N F A T , N F - I L 6 和C R E 等多种转录因子的结合位点， 不同的刺激在不同的细胞中诱导 C O X - 2 表达的途径 不同， 这些位点均位于距转录起始位点一 5 2 1 饰以 内， 目 前报道各种因素对C O X - 2 表达的影响均位于 此区 域内。 本研究中 使用的C O X 2 p r o 1 . 5 k b / l u c 中 包 括上述所有转录因子的结合位点， 结果显示， 在 参考文献: 1 R a h m a n M A , D h a r D K , Y a m a g u c h i E , e t a l . C o e x p r e s s io n o f i n d u c - i b l e n i t r ic o x i d e s y n t h a s e a n d C O X - 2 i n h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a a n d s u r ro u n d i n g l i v e r ; p o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f C O X 一 i n t h e a n g i o g e n e s i s o f h e p a t i t i s C v i r u s - p o s i t iv e c a s e s J . C l i u C a n c e r R e s , 2 0 0 1 ， 7 : 1 3 2 5一1 3 3 2 . 2 D a n s a k o H , N a g a n u m a A , N a k a m u r a T , e t a l . D i f f e r e n t i a l a c t i v a t i o n o f i n t e r f e r o n - i n d u c i b l e g e n e s b y h e p a t i t i s C v i r u s c o r e p r o t e i n m e d i a t e d b y t h e i n t e r f e ro n s t i m u l a t e d r e s p o n s e e l e m e n t J . V i r u s R e s , 2 0 0 3 ， 9 7 : 1 7一 3 0 . 3 M u r a k a m i M, M a t s u m o t o R , A u s t e n K F , e t a l . P r o s t 司a n d i n e n - d o p e ro x i d e s y n t h a s e - 1 a n d 一c o u p l e t o d i f f e r e n t t r a n s m e m b r a n e s t i m u l i t o g e n e r a t e p r o s t a g l a n d i n D 2 i n m o u s e b o n e m a r ro w - d e r i v e d m a s t c e l l s J . J B io l C h e m, 1 9 9 4 ， 2 6 9 : 2 2 2 6 9一 2 2 2 7 5 . 4 R a y R B , R a y R , R a n j i t R , e t a l . H e p a t i t i s C v i r u s c o r e p r o t e i n ; i n - t r i g u i n g p ro p e rt i e s a n d f u n c t i o n a l r e l e v a n c e J . F E M S M i c r o b i o l L e t t , 2 0 0 1 ， 2 0 2 : 1 4 9一 1 5 6 . 5 K o l y k h a l o v A A , A g a p o v E V , R i c e C M , e t a l . T r a n s m i s s i o n o f h e p a t i - t i s C b y i n t r a h e p a t i c i n o c u l a t i o n w i t h t r a n s c r i b e d R N A J . S c ie n c e , 1 9 9 7 ， 2 7 7 : 5 7 0 一 5 7 4 . 仁 6 N u n e z 0 , F e rn a n d e z - M a r t i n e z A , M a j a n o P L , e t a l . I n c r e a s e d i n t r a - h e p a t i c c y c l o o x y g e n a s e 2 , m a t r ix m e t a l l o p ro t e i n a s e 2 , a n d m a t r i x m e t - a l l o p ro t e i n a s e 9 e x p r e s s i o n i s a s s o c i a t e d w i t h p ro g r e s s i v e l i v e r d i s e a s e i n c h r o n i c h e p a t i t i s C v i r u s i n f e c t i o n ; r o l e o f v i r a l c o r e a n d N S 5 A p ro - t e i n s J . G u t , 2 0 0 4 ， 5 3 : 1 6 6 5 一 1 6 7 2 . 7 K a o C F , C h e n S Y . M o d u l a t i o n o f 卢3 t r a n s c r i p t i o n r e g u l a t o ry a c t i v i t y a n d p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n b y h e p a t i t i s C v ir u s c o r e p ro t e i n J . O n c o g e n e , 2 0 0 4 ， 2 3 ( 1 4 ) : 2 4 7 2 一 2 4 8 3 . 仁 8 L e e M N , J u n g E Y , K w u n H J , e t a l . H e p a t i t i s C v i r u s c o r e p ro t e i n r e - p r e s s e s t h e p 2 l p ro m o t e r t h ro u g h i n h i b i t i o n o f a T G F - (3 p a t h w a y J · I G e n V i r o l , 2 0 0 2 , 8 3 ( 9 ) : 2 1 4 5 一 2 1 5 1