GFRα1蛋白在小鼠隐睾精原细胞中的表达及意义.pdf

山东医药2 0 0 6 年第 4 6 卷第 5 期 G F R u l 蛋白在小鼠隐肇精原细胞中的 表达及意义 刘春妞 ， 王玲珑 ， 张茨“ ， 叶发根 ( 武汉大学人民医院， 湖北武汉 4 3 0 0 6 0 ) 【 摘要】 目的探讨胶质细胞源性神经营养因子受体a l ( GF R a I ) 蛋白在小鼠隐皋精原细胞中的表达及对 精原干细胞增殖的调节作用。方法取成年小鼠4 0只制作单侧隐肇模型， 饲养2 -3 个月后， 切取宰丸行光镜和 电镜观察， 并用免疫组织化学方法检测皋丸细胞G F R a l 的表达， 与对侧皋丸做对照。结果隐皋模型G F R a 1 主 要表达在位于基底膜的A s型精原千细胞， 在凡 型细胞和A . i 型细胞长见表达， 与对侧相比， GF R a l 表达增多， P 0 . 0 5 .结论隐皋皋丸组织中A , ,-A: 分化受阻， 已分化的精原细胞缺失， 反馈性的GF R a l 表达增多， 可促进 精原干细胞增殖. 【 关键词】 胶质细胞源性神经营养因子受体 a l ; 隐肇; 精原细胞 【 中图分类号I R 3 9 4 . 2 文献标识码I A【 文童编号I 1 0 0 2 - 2 6 6 x( 2 0 0 6 ) 0 5 - 0 0 0 7 - 0 2 A b s tr a c t : Ob je c t iv e ; T o d i s c u s s e x p r e s s i o n o f g l ia l c e l l - d e r i v e d n e u r o t r o p h ic fa c t o r(G DN F ) r e c e p t o r a l p r o t e i n ( GF R a Di n t h e g e r m c e l ls o f c r y p t o r c h i d m i c e a n d r e g u l a t in g p r o l if e r a t io n o f g e r m i n a l s t e m c e ll ( GS C. Me t h o d ; 4 0 u n il a t e r a l a r t i f ic ia l c r y p t o r c h 且 d is m mo d e ls we r e e s t a b l is h e d w it h 6 -5 w e e k s o l d m a l e K M mi c e . 2 - 3 mo n t h s a f t e r o p e r a t i o n , t e s t is we r e c u t a n d o b s e r v e d b y l ig h t a n d e l e c t r o n mic r o s c o p y . G F R a l e x p r e s s io n in t e s t i s t i s s u e w a s d e t e c t e d b y immu n o h i s t o c h e mn is t r y . Th e o p p o s it e s i d e t e s t i s w e r e u s e d a s c o n t r o l . R e s u l t ; G F R a l w a s m a i n l y e x p r e s s e d a t A s g e r min a l s t e m c e l ls n e a r t o b a s e m e n t m e mb r a n e , n o t e x p r e s s e d a t A, a n d 人卜 I t s e x p r e s s io n in c r e a s e d c o mp a r e d t o t h e c o n tr o l ( P 0 . 0 5 ) . c o n c l u s io n , I n c r y p t o r c h id t e s t i s , t h e d if f e r e n t i a t io n f r o m A, t o A, w a s b l o c k e d . Th e d if f e r e n t ia t e d g e r m c e l l s d e p le t e d . G F R a l e x p r e s s e d in c r e a s e l y b y f e e d b a c k m e c h a n i s m a n d p r o mo t e d t h e p r o l if e r a t i o n o f GS C . K e y w o r d s ; GF R a l ; c r y p t o r c h id te s t is ; s p e r ma t o g o n ia 精原干细胞是体内惟一在细胞水平能对其增殖 和分化及调节进行识别和研究的干细胞， 但生精上 皮的复杂性使得临床很难在分子水平对其进行研 究。 胶质细胞源性神经营养因子( G D N F ) 是精原干细 胞自我增殖与分化的主要调节因子f = 1 架丸组织中 的 G D N F是由支持细胞分泌的， 与其受体 G F R a l , R e t 结合介导信号传递. 可调节细胞的增殖与分 化 ， 。 2 0 0 4 年1 2 月 一2 0 0 5 年6 月， 我们借助小鼠隐 梁模型富集未分化的A型精原细胞( 包括精原干细 胞G S C ) ， 研究了G F R a l 在精原细胞中 的表达变化， 旨在探讨其对精原干细胞增殖的调节作用。 1 材料与方法 1 . 1 小鼠隐皋模型的建立和实验分组取 6 - 8周 雄性昆明白小鼠4 0 只( 武汉大学医学院实验动物中 心提供) ， 用 。 . 1 %速眠新( 0 . l mi l l o g ) 麻醉， 取仰卧 基金 项 目 湖 北省 教育 厅 资助项 目( 2 0 0 0 13 0 3 0 0 8 ) 武汉 大学 青年 博 士创新基 金项 目 通 讯 作 者 位， 常规消毒腹部， 参照N i s h i m u n J ' 的 方法， 于 腹部 正中线处剪开l c m长切口， 将一侧辜丸拉人腹腔， 于 脂肪垫靠近附4 .1 处缝 1 针， 将辜丸固定在侧腹壁， 制 成隐果实验组， 另一侧皋丸做对照组， 关闭切口， 术 后继续饲养 2 -3 个月。 1 . 2丸细胞形态学观察分别切取两侧肇丸， 用 B o a i n ' s 液固定2 4 h ， 常规石蜡包埋. 进行苏木精一 伊红染色， 光镜观察; 电镜标本用 2 . 5 %的戊二醛预 固定 2 4 h , P B S清洗后转至 1 %饿酸中固定 2 h , 逐级 丙酮脱水， E p o n 8 1 2 包埋， 超薄切片， 日立 H - 6 0 0 透 射电镜观察。 1 . 3 肇丸组织中G F R a l 表达的检测根据博士德 生物工程公司提供的S A B C免疫组化染色试剂盒说 明书进行， 5 m m石蜡切片， 脱蜡人水， 3 YH , O: 灭活 细胞内源性过氧化物酶, 0 . 1 %胰蛋白酶消化， 正常 血清封闭， 加羊抗小鼠 G F R a l 抗体( S a n t a c r u z s c - 6 1 5 7 ) 4 下过夜， 加生 物素化二抗 3 7 'C 下 孵育 2 O min , S A B C工作液 3 7 下孵育 3 0 mi n ， 以上每两 步之间用 P B S洗涤， D A B显色， 封片 山东医药 2 0 0 6年第 4 6卷第 5期 l . 4 图像分析及统计学分析应用 H V I I A S - 2 0 0 0 彩色图文分析系统测GF R a l 阳性物平均光度和分 光度值， 每组取 功 张片， 每张片取 2个视野。应用 S P S S软件 1 1 . 5 进行统计学分析， 数据以x 士: 表示， 采用 t 检验， P GO . 0 5 为有统计学意义。 2结果 2 . 1 攀丸组织细胞形态H E染色见实验组小鼠生 精小管管腔消失， 精原细胞排列层次紊乱 细胞数量 减少， 小管中央可见分裂期细胞。电镜下见生精小管 内未分化精原细胞增多， 主要是单个的精原干细胞 ( A s ) ， 紧靠基底膜， 呈卵圆形， 核卵圆形， 核仁细而致 密， 分布在核膜周围， 除核糖体外的细胞器不发达; 并可见少量成对的未分化精原细胞 2 . 2辜丸组织 细胞 GF R a 1表达在小 管内， GF R a l阳性表达细胞局限于沿基底膜排列的细胞， 呈单个， 未见细胞质间桥， 根据其形态及在生精小管 的位置可以判定为A s 细胞。 间质细胞( L e y d ig细胞) 可见G F R a l阳性表达， 细胞质背景均见弱着色实 验组 G F R a l a l阳性物平均光度值和积分光度值分 别为 0 . 3 5 3 3 士0 . 0 7 0 4 9 , 1 6 . 4 3 士8 . 3 6 1 ， 对照组分别 为0 . 3 3 4 3 士0 . 0 8 6 6 3 , 1 2 . 9 3 士9 . 1 2 8 , P分别0 . 0 5 , G 0 . 0 1 . 3 讨论 小鼠精子发生过程可以 分为1 2 个阶段( I 一 X II ) ， 在 X阶段未分化 A型精原细胞开始增殖， 约 u 一皿阶段停止增殖; 在其余阶段， 细胞进行分化。在 生精过程中有 两个分化点， 即A s - - A , 和A , , 八 : 。 在 体内可以自我增殖分裂为两个相同的干细胞 A s ， 或 分裂为两个相连的细胞 A , A 继续分裂为 4个、 8 个或 1 6个A , . 细胞. 在v i - v i 阶段， A 。 细胞继续分化 为 A ， 细胞， 这两个分化点是调节增殖和分化平衡的 关键点， 受多种因素的影响。 干细胞的自我增殖与分 化( A s -A , ) 主要受GD NF / G F R a l , R e t 系统调节， 具体机制尚不清楚; Me n g等 + 7 研究发现， 在G D N F 过度表达的小鼠, 3 周龄时在皋丸发现精原细胞瘤， 并证实瘤体中只有单个的 八 s 型精原干细胞存在， 在 这些干细胞上有G D NF的受体R e t , G F R a l 表达; 在 G D N F基因剔除( G D N F * ) 的小鼠， 发现干细胞逐 渐损耗， 推测支持细胞分泌的G D N F促进干细胞的 自我更新。A , ,-A , 受多种因素的影响， 如维生素 A 酸、 干细胞因子及受体系统、 细胞周期蛋白D z , D a z l 蛋白以及翠丸激素水平等， 根据这些因素， 目前已经 找到多种模型来研究精原干细胞的增殖和分化， 如 j s d / j s d , W/ W0 , S 1 1 7 H/ S 1 1 7 H, s l / s l “ 、 维生素 A 缺 乏、 放射线照射、 隐肇鼠， 为进一步在分子水平阐明 8 A s 增殖与分化的调节机制奠定了基础。G D N F是一 种转化生长因子超家族的多功能神经营养因子， 其 受体有两种即固定于细胞质膜外的G F R 1 和偶联的 功能亚单位R e t 蛋白。 G F R 1 与 G D NF有很高的亲 和力， 与G D NF结合后复合体与两个分子的R e t 蛋 白结 合， 激 活酪氨酸 自我磷 酸化， 介 导 GD NF / G F R a l , R e t 系统信号传递C s ; 。以前的研究报道， G D N F在未分化精原细胞高表达时促进肇丸肿瘤形 成， 并证实肿瘤细胞团细胞表达 G D N F , R e t , G F R a l ， 为单个的精原干细胞， 生精小管内未见精子 细胞， 所有的雄性鼠 均不育 + 7 。张茨等困 建立一种白 消安损伤的精子再生小鼠模型， 通过检测增殖和分 化阶段 G F R . 1基因表达水平， 证实 G F R . 1 高表达 促进A s 细胞增殖， 低表达促进其分化。推测G F R . 1 表达受内环境调节。我们通过抑制隐攀模型A型精 原细胞 的分化致 A, -A: 受阻， 减少已分化的精原细 胞的干扰， 提高精原千细胞在翠丸细胞的比例后检 测G F R 1 在蛋白水平的表达。 结果细胞总数目减少， 残存的细胞中未分化的精原细胞占， 5 . 7 %士3 . 2 0 0 , 其中主要为单个的精原干细胞， 用抗增殖细胞核抗 原抗体( P C N A) 检测， 发现精原干细胞增殖加速 + 7 本研究发现隐肇精原干细胞表达GF R a l较正常肇 丸增加， 与精原干细胞的数 目和增殖变化相一致， 推 测在未分化精原细胞( AS - A , ) 和分化的精原细胞 ( A , - B ) 之问存在反馈性调节， G F R 1 受这种反馈性 调节， 为应对 G D N F的表达变化而调节精原干细胞 的增殖。其机制有待于进一步研究。 【 参考文献】 1 T a d o k o r n Y , Y o mo g id a K, O h t a H, e t a l. H o m e o s t a t ic re g u l a - l io n o f g e r m in a l s te m c e l l p r o li f e r a t i o n b y t h e G D N F / F S H p a t h w a y 1 . Me c h D - 2 0 0 2 , 1 1 3 ( l) : 2 9 - 3 9 . 2 Me n g X , L ln d a h l M, f l y , n e n M. e t a l . R e g u l a ti o n o f c e ll f a re d e c i s io n o f u n d if f e r e n t ia t e d s p e r m a m g o n ia b y G D N F J . S c i e n c e , 2 0 0 0 , 2 8 7 ( 5 4 5 7 ) : 1 4 8 9 - 1 4 9 3 . 3 N is h i m u n e Y , A iz a w a S , K o m a t s u F . T e s t ic u l a r g e r m c e ll d if f e r e n t ia ti o n In v : o o J F e r t il St-dl, 1 9 7 8 . 2 9 : 9 5 4 ; M e n g X , R o o q D G. We s te r d a h l K, e t a l. P r o m o ti o n o f s e m ln c - tn a t o n s t u m o r s b y t a r g e te d o , e r e x p r e s s io n o f g G a t c e ll l in e d e r iv e d n e u r o t r o p h ic f a c to r in m o u s e t e s t is J . C a n e R e s , 2 0 0 1 . 6 1 : 3 2 6 7 - 3 2 7 1 . 5 S o l e r R M. D o l c e t X, E n c in a s M, e t a l . R e c e p t o r s o f t h e g l ia l c e l l li n e -d e r l, e d n e u r o t r o p h ic f a c to r f a mily o f n e u r o t r o p h ic f a c t o r s ig n a l c e l l s u r , i , a l t h r o u g h th e p h o s p h a t id y l in o s it o l 3 - k in a s e p a t h w a y in s p in a l c o r d m o t o n e u r o n s J . N e u r o s is , 1 9 9 9 . 1 9 ( 2 1 ) : 9 1 6 0 - 9 1 6 9 . 6 张茨 . 胡传义 ， 土玲珑 . 胶质 细胞 源性 神经 营养 因子 受体 巷因 a l 在 小 鼠精 子 再生 过 程 中的 表 达和 念 义 1 . 中华 男 科 学杂 志 ， 2 0 0 3 . 9 ( 9 ) : 6 4 7 - 6 4 9 .( 收摘 日期 :2 0 0 5 - 1 1 - 0 2 )