[农业标准]-NYT555-2002 动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法.pdf

I C S 1 1 . 2 2 0 s4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 N Y / T 5 5 5 -2 0 0 2 动物产品中大肠菌群、 粪大肠菌群 和大肠杆菌的检测方法 D e t e c t i o n me t h o d s f o r c o l i f o r m g r o u p , f a e c a l c o l i f o r m g r o u p ， c o l i f o r m b a c t e r i a i n a n i ma l p r o d u c t s 2 0 0 2 一 0 8 一 2 7发布2 0 0 2 门 2 一 0 1实施 中 华 人 民 共 和 国农 业 部发 布 4 3 1 N Y/ T 5 5 5 -2 0 0 2 前言 大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠杆菌是食品卫生的三项重要的卫生指标。 当前国际上采用的方法有美 国公职分析化学家协会( A O A C ) 方法及日 本人介绍的煌绿乳糖胆盐肉汤( B G L B ) 和E C试管发酵法。 为 满足要求， 依照日 本采用的B G L B和E C试管发酵法并进行适当改进， 建立了本检测方法。 本方法用 B G L B发酵管检测大肠菌群并计算最大可能数( MP N) 值， 用E C肉汤发醉管检测粪大肠菌群并计算 MP N值， 在检测粪大肠菌群的基础上通过生化鉴定检测大肠杆菌并计算MP N值， 鉴定中省去了革兰 氏染色。 这些重要改进缩短了检验时间， 简化了操作程序， 而且经对比试验证明结果可靠， 适合于动物产 品中大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠杆菌的检测。 本标准的附录A是规范性附录， 附录B是资料性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位: 天津动植物检疫局。 本标准主要起草人: 秦贞奎、 张碧波、 侯艳梅、 杨金良、 薛振源。 NY / T 5 5 5 -2 0 0 2 动物产品中大肠菌群、 粪大肠菌群 和大肠杆菌的检测方法 1 范围 本标准规定了动物产品中大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法。 本标准适用于动物产品中大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠杆菌的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 2 . 1 大肠菌群c o l i f o r m s ; c o l i f o r m g r o n p 一群能分解乳糖产酸产气、 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆茵。 2 . 2 粪大肠菌群 f a e c a l c o l i f o r m s ; f a e c a l c o l i f o r m s g r o n p 4 4 . 5 C 发酵乳糖产气的一群细菌， 是用来表示来源于粪便的大肠菌群。 2 . 3 大肠杆菌e s c h e r i c h i a c o l i ; c o l i f o r m b a c t e r i a 符合大肠菌群和粪大肠菌群定义， 用I MV i c ( 靛基质、 甲基红、 维培和西蒙氏柠檬酸盐) 生化试验进 一步鉴定， 四种生化反应结果依次为+一一和一+一一的细菌。 2 . 4 最大可能数 m o s t p r o b a b l e n u m b e r , MP N 采用多次稀释方法所求得的最近似数， 是通过概率计算出来的。 2 . 5 I MVi C 靛基质试验、 甲基红试验、 维培( V P ) 试验和构椽酸盐利用试验的缩写。 3 检测方法 3 . 飞 材料准备 3 . 1 . 1 仪器 吸管， 恒温水浴箱， 培养箱， 匀浆器， 1 0 0 m 1 . , 2 0 0 m L和5 0 0 m L三角瓶及广口瓶， 直径5 m m的玻 璃珠。 3 . 1 . 2 培养基及试剂 配制方法见附录A( 规范性附录) 。 31 . 2 . 1 煌绿乳糖胆盐肉汤( B G L B ) , 配制方法见第 A . 1 章。 3 . 1 . 2 . 2 E C肉汤， 配制方法见第A . 2 章。 3 门. 2 . 3 伊红美蓝琼脂( E MB ) ， 配制方法见第A. 3 章。 3 . 1 . 2 . 4 甲基红一 维培( MR - V P ) 培养基， 配制方法见第A. 4 章。 3 . 1 . 2 . 5 西蒙氏柠檬酸盐培养基， 配制方法见第A . 5 章。 N Y/ 'r 5 5 5 -2 0 0 2 3 . 1 . 2 . 6 靛基质( “ 引 噪) 试验培养基， 配制方法见第 A. 6章。 3 . 1 . 2 . 7 科瓦克( Ko v a c s ) 氏靛基质试剂， 配制方法见第 A. 7章 3 门. 2 . 8 甲基红指示剂， 配制方法见第A . 8 章。 3 . 1 . 29 维培( V P ) 试剂， 配制方法见第 A. 9 章。 3 . 2 检测程序 本标准的检测程序见图1 . ，图1 检测程序流程图 3 . 3 样品制备 3 . 3 . 1 无菌操作从动物产品中采取有代裹性的样品 如有包装则用 7 5 %乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检测， 应将冷冻样品置于一1 5 冰箱保 存。非冷冻而易腐的样品， 应置于4 冰箱保存。检测前冷冻样品可于2 一一5 下在1 8 h内， 或于 4 5 下在1 5 m i n内 解冻。 13 . 2 不同样品匀浆液的制备 3 . 3 . 2 . 1 液体样品: 以无菌吸管取样2 5 m L加人到装有2 2 5 m L灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶( 瓶内预 置适当数量的玻璃珠) 内， 制成 1 : 1 0 的样品匀浆。 3 . 3 - 2 . 2 固体和半固体样品: 以无菌操作取样 2 5 'g ， 加人到装有 2 2 5 m L灭菌生理盐水的灭菌匀浆器 内， 于8 0 0 0 r / m i n 均浆2 m i n ， 制成1 : 1 0 样品匀浆( 也可用灭菌乳钵研磨的方式代替) 。 N Y/ T 5 5 5 -2 0 0 2 3 . 3 . 2 . 3 样品稀释液的制备: 根据样品污染情况， 用灭菌生理盐水将样品匀浆制成一系列十倍递增的 样品稀释液( 通常采用 1 0 - ' , 1 0 - 1 和1 0 - 稀释) 。从制备样品匀浆至稀释完毕， 全过程不得超过 1 5 m i n e 3 . 4 大肠菌群的测定 3 . 4 . 1 大肠菌群MP N值的测定 3 . 4 . 1 . 1 每个样品通常选用 1 0 - 1 , 1 0 - 2 和1 0 - 3 三个连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管 B G L B ( 见第A . 1 章) ， 每管接种1 m L ， 每接种一个稀释度换一支无菌吸管。 3 . 4 . 1 . 2 将接种管置于( 3 6 士1 ) 培养2 4 h , 3 . 4 . 1 . 3 观察试管的产气情况: 检查管内是否有气泡产生， 并记录2 4 h内产气的B G L B管数。如所有 培养管均未产气， 则报告大肠菌群阴性; 如有产气管， 进一步试验证实。 3 . 4 . 2 大肠菌群的证实试验 3 . 4 . 2 . 1 将所有产气管中的培养物用接种环接种到伊红美蓝琼脂平板， ( 3 6 士1 ) 培养2 4 h , 3 . 4 . 2 . 2 大肠菌群在伊红美蓝琼脂平板上生长， 其菌落为有金属光泽、 黑紫色或紫色带黑心。 3 . 4 . 2 . 3 查有金属光泽、 黑紫色或紫色带黑心菌落的B G L B产气管数及其稀释倍数。 3 . 4 - 2 . 4 结果报告: 按3 . 4 . 2 . 3 检查结果， 查M P N检索表( 见附录B ) ， 报告大肠菌群的M P N / g ( m L ) 值。 3 . 5 粪大肠菌群测定 3 . 5 . 1 粪大肠菌群MP N值的侧定 3 . 5 . 1 . 1 每个样品通常选用1 0 -, 1 0 “和i 0 - ， 三个连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管 E C肉汤， 每管接种 1 mL e 15 . 1 . 2 将所有接种的E C肉汤管于 3 0 m i n内置于温度为( 4 4 . 5 士。 . 5 ) 的带盖水浴箱内， 培养( 2 4 士2 ) h 。水浴箱的水面应高于肉汤培养基液面。用4 4 . 5 产气阳性的大肠杆菌和4 4 . 5 不产气的大肠 杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。 3 . 5 . 1 . 3 记录E C管的产气情况。 E C肉汤管都不产气为粪大肠菌群阴性， 产气为粪大肠菌群阳性。 将 产气管作证实试验。 3 . 5 . 2 证实试验 3 . 5 . 2 . 1 将产气管接种伊红美蓝平板在( 3 6 士1 ) “C 培养2 4 h . 3 . 5 - 2 . 2 查有金属光泽、 紫色带黑心菌落的E C产气管数及其稀释倍数。 3 . 5 - 2 . 3 结果报告: 按3 . 5 . 2 . 2 结果， 查MP N检索表( 见附录B ) 。 报告粪大肠菌群的MP N / g ( m L ) 值。 3 . 6 大肠杆菌测定 3 . 6 . 1 培养 将 3 . 5 - 2 . 1 中伊红美蓝平板上典型大肠杆菌菌落接种到营养琼脂平板， 在( 3 6 土1 ) 培养 1 8 h - 2 4 h 。 每个平板至少挑选2 个菌落。 3 . 6 . 2 生化试验 挑取上述菌落纯培养物接种3 . 6 . 3 生化培养基和乳糖发酵管， ( 3 6 士1 ) 0C 培养2 4 h 后观察结果。 3 . 6 . 3 3 . 6 . 3 . 1 大肠杆菌与非大肠杆苗鉴别试验方法 靛基质试验: 滴加K o v a c s 氏靛基质试剂0 . 1 m L于靛基质试验培养基中混合， 静置， 观察结果。 出现红色环的为反应阳性; 出现黄色环的为反应阴性。 甲基红( MR) 试验: 滴加甲基红指示剂0 . 2 m 1于MR - V P培养基中混合， 观察结果。 出现红色为阳性反应; 出现黄色为阴性反应。 维培( VP ) 试验: 滴加V P试剂甲液 0 . 2 m L于MR - V P培养基中混匀， 再滴加V P试剂乙液 。 . 1 m L混匀， 静 a)b) 3 . 6 - 3 . 2 a ) b) 3 . 6 . 3 . 3 a ) N Y/ T 5 5 5 -2 0 0 2 置， 观察结果。 b ) 在1 5 m i n内出现红色的为阳性反应; 无颜色变化的为阴性反应。 阴性结果 1 h后再观察一次 出现红色也为阳性反应。 16 . 3 . 4 西蒙氏柠檬酸盐试验: 观察培养基颜色变化， 出现蓝色为阳性反应; 不变色为阴性反应。 16 . 4 大肠杆菌鉴定结果 应符合表 1 要求。 表 ， 大肠杆菌鉴定结果 靛基质 M RVP 西蒙氏柠像酸盐鉴定( 型别) + + 典型大肠艾希氏杆菌 非典型大肠艾希氏杆菌 一 卜+ + + 十 典型柠像酸盐杆菌 非典型柠橄酸盐杆菌 十 + 十 典型产气肠杆菌 非典型产气肠杆菌 如出现表1 以外的生化反应类型， 表明培养物可能不纯， 应重新划线分离， 必要时做重复试验。 3 . 6 . 5 结果报告 1 MV i c试验结果为+一一、 一+一一和乳糖发酵管产气者， 查其E C肉汤产气管数及其稀释倍 数， 对照附录 B ( 资料性附录) 中MP N检索表报告样品中大肠埃希氏杆菌 MP N / a ( mL ) 值 N Y/ T 5 5 5 -2 0 0 2 附录A ( 规范性附录) 培养墓和试荆配制方法 ， 煌绿乳精胆盐肉汤( B GL B ) 1 成分 蛋白脉 孚 L 糖 牛胆盐 煌绿水溶液 蒸馏水 AA 1 0 . 0 g 2 0 . 0 g 1 0 . 0 g 1 3 . 3g 1 0 . 0 m1 A . 1 . 2 配制方法 将蛋白 陈、 乳糖溶于约5 0 0 m L 蒸馏水中， 加人牛胆盐后用蒸馏水稀释到9 7 0 m L , 调p H 7 . 4 。再加 入 。 . 1 0 0 煌绿水溶液 1 3 . 3 mL， 用蒸馏水补足到 1 0 0 0 mL 。分装到 2 0 X 1 5 0 m m试管中( 管内有倒立的 小发酵管) 。每管 1 0 m L 。于1 1 2 k P a 灭菌 1 5 m i n ， 最终p H( 7 . 2 士0 . 1 ) 0 A. 2 A- 2 E C肉汤 A. 2 1 1 2 1 成分 胰蛋白 脉或酪蛋白 胰消化物2 0 . 0 g 3 号胆盐或混合胆盐1 . 5 g 乳糖5 . 0 g 磷酸氢二钾( K 2 H P O , ) 4 . 0 g 磷酸二氢钾( K H 2 P O , ) 1 . 5 g 抓化钠5 . 0 g 蒸馏水1 0 0 0 mL 2 配制方法 将以上成分溶解于燕馏水中， 分装 1 6 X 1 5 0 m m试管( 试管内有倒立的小发酵管) ， 每管 8 m 1 ， 于 k P a 灭菌1 5 m i n ， 最终p H( 6 . 9 士0 . ll , 3 伊红美蓝琼脂( E MB ) 3 . 1 成分 蛋白陈 伊红 Y 乳糖 美蓝 磷酸氢二钾 琼脂 蒸馏水 AA 1 0 . 0 g 0 . 4 g ( 或2 %水溶液2 0 m L ) 1 0 . 0 g 0 . 0 6 5 g ( 或0 . 5 % 水溶液1 3 m L ) 2 . 0 g 1 5 . 0 g 1 0 0 0 mL A. 3 . 2 配制方法 将蛋白陈、 磷酸盐和琼脂加到 1 0 0 0 m L蒸馏水中， 并加热使其溶解。并分装于三角瓶中。每瓶 1 0 0 m l 或2 0 0 m L , 7 5 k P a 灭菌1 5 m i n ， 最终p H ( 7 . 1 士0 . 2 ) 。使用前将琼脂溶化， 于每1 0 0 m 1 ， 琼脂中 N Y / 'r 5 5 5 -2 0 0 2 加5 m L 灭菌的2 0 %乳糖水溶液， 2 mL的2 %伊水溶液和 1 . 3 mL 0 . 5 %的美蓝水溶液， 摇匀， 冷至4 5 - 5 0 C后倾注平皿。 A . 4 MR - V P培养基 A . 4 . 1 成分 胰陈7 . 0 g 葡萄糖5 . 。 9 磷酸氢二钾5 . 。 9 蒸馏水1 0 0 0 mL A . 4 . 2 配制方法 将各成分溶解于蒸馏水中， 分装试管中， 于是1 1 2 k P a 灭菌1 5 m i n ， 最终p H ( 6 . 9 士0 . 2 ) . A . 5 西裁氏柠橄酸盐培养基 A. 5 . 1 成分 抓化钠 硫酸镁( M g S 0 4 · 7 H 2 0 ) 琼脂 磷酸氢二按 2 %澳寮香草酚蓝溶液 磷酸氢二钾 柠檬酸钠 蒸馏水 . 2 配制方法 先将盐类溶解于水， 调整p H 6 . 灭菌1 5 m i n ， 摆成斜面。 5 . 0 g 0 . 2g 2 0 g 1 . 0 g 4 0 mL 1 . 0 g 5 . 0 g 1 0 0 0 mL 8 ， 再加琼脂， 加温溶化后， 加人指示剂， 混合均匀后装人试管， 1 1 2 靛基质试验培养基 . 1 成分 胰陈或胰酪陈 蒸馏水 . 2 配制方法 加热搅拌溶解胰陈或胰酪陈于蒸馏水中。 JaCU洲叭U 态kP几瓦 1 0 . 0 g 1 0 0 0 mL A. 6 分装试管， 每管 5 m L , 1 1 2 k P a 灭菌 1 5 m i n .最终 p H ( 6 . 9 士0 . 2 ) . A . 7 K o v a c s 氏靛基质试荆 A . 7 . 1 成分 对一 二甲胺基苯甲醛 戊醇 盐酸( 浓) A . 7 . 2 配制方法 将对一 二甲胺基溶于戊醇中， 然后慢慢加人浓盐酸即可。 5 . 0 g 7 5 . 0 mL 2 5 . 0 mL N Y / T 5 5 5 - - 2 0 0 2 A . 8 甲基红指示剂 A. 8 . 1 成分 甲基红 9 5 %乙醇 A. 8 . 2 配制方法 将甲基红溶解于3 0 0 m l乙醇中， 加水稀释5 0 0 m l - , A . 9 V o g e s - P r o s K a u e r ( V - P ) 试荆 A . 9 . 1 成分 A . 9 . 1 . 1 甲液 a 一 蔡酚 无水乙醇 A . 9 . 1 . 2 乙液 氢氧化钾 蒸馏水 A. 9 . 2 配制方法 A . 9 . 2 . 1 甲液: 将a 一 禁酚溶解于无水乙醇中。 A . 9 . 2 . 2 乙液: 将氢氧化钾溶解于蒸馏水中。 0 . 1 g 3 0 0 mL 5 . 0g 1 0 0 0 ml 4 0 . 0 g 1 0 0 0 ml N Y/ 'r 5 5 5 -2 0 0 2 附录B ( 资料性附录) MP N检索表t 表 B . ' I MP N检索表. 阳性管数 M PN 仁 . L ( g ) I 9 5 %可信限 下限上限 0 . 1 m l - , ( g ) X 30 . 0 1 mL ( g ) X3 0 . 0 0 1 . 1 , ( g ) X 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 3 3 6 9 0 . 59 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 2 3 3 6 9 1 2 0 . 51 3 0 0 0 0 2 2 2 2 0 1 2 3 6 9 1 2 1 6 0 0 0 0 3 3 3 3 0 1 2 3 9 1 3 1 6 1 9 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 2 3 4 7 1 1 1 5 : 5: : 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 7 1 1 1 5 1 9 ;: : 1 1 1 1 2 2 2 2 0 1 2 3 1 1 1 5 2 0 2 4 33 6 1 1 1 1 3 3 3 3 0 1 2 3 1 6 2 0 2 4 29 4 4 0 N Y / T 5 5 5 -2 0 0 2 表 B . 1 ( 续) 阳性管数 M PN - L ( g ) 9 5 %可信限 0 . 1 m L “ ( g ) X30 . 0 1 m L ( g ) X30 . 0 0 1 mL ( g ) X3下限上限 2 2 2 2 0 0 0 0 0 1 2 3 9 1 4 2 0 2 6 ;: 2 2 2 2 1 1 1 1 0 1 2 3 1 5 2 0 2 7 3 4 :; ; 2 2 2 2 2 2 2 2 0 1 2 3 2 1 2 8 3 5 4 2 41 04 71 5 0 2 2 2 2 3 3 3 3 0 1 2 3 2 9 3 6 4 4 5 3 3 3 3 3 0 0 0 0 0 1 2 3 2 3 3 9 6 4 9 5 4 7 1 5 1 2 0 1 3 0 3 8 0 3 3 3 3 1 1 1 1 0 1 2 3 4 3 7 5 1 2 0 1 6 0 7 1 4 3 0 2 1 0 2 3 0 3 8 0 3 3 3 3 2 2 2 2 0 I 2 3 9 3 1 5 0 21 0 2 9 0 1 5 3 0 3 5 3 8 0 4 4 0 4 7 0 3 3 3 3 3 3 3 3 0 1 2 3 2 4 0 4 6 0 1 1 0 0 )2 4 0 0 3 6 7 1 1 5 0 1 3 00 2 4 0 0 4 8 0 0 · 本表采用三管法三个稀释度 0 . 1 g ( . L ) , 0 . 0 1 g ( . L ) 和。 . 0 0 1 ( - L ) ， 每个稀释度接种三管。 表内所列检样量如改用1 g ( . L ) , 0 . 1 g ( . L ) 和0 . 0 1 g ( m L ) 时。表内数字应相应降低1 0 倍t 如改用0 . 0 1 g ( m l , ) , 0 . 0 0 1 g ( m L ) 和0 . 0 0 0 1 g ( . L ) 时， 则表内 数字应相应 增加1 0 倍， 其余类推 4 们