[商检标准]-SNT 1089-2002 布氏杆菌病补体结合试验操作规程.pdf

SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 s N / T 1 0 8 9 -2 0 0 2 布氏杆菌病补体结合试验操作规程 P r o c e d u r e o f c o mp l e me n t f i x a t i o n t e s t f o r b r u c e l l o s i s 2 0 0 2 一 0 3 一 1 5发 布 2 0 0 2 一 0 9 一 0 1 实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 S N / T 1 0 8 9 -2 0 0 2 前言 本标准是按照G B / T 1 . 1 -1 9 9 3 标准化工作导则第 1 单元: 标准的起草与表述规则第1部分: 标准编写的基本规定 而制定的。 本标准参考了原中华人民共和国动植物检疫局编写的 中国进出境动物检疫规范 ， 并结合了起草 单位多年的检验检疫经验。 本标准的附录A、 附录B 、 附录 C 、 附录D是标准的附录。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国天津出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 王玉玲、 朱世强、 番蕾、 范华炜。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 布氏杆菌病补体结合试验操作规程 s N / T 1 0 8 9 -2 0 0 2 Pr o c e d u r e o f c o mp l e me n t f i x a t i o n t e s t f or br u c e l l o s i s 范围 本标准规定了布氏杆菌病补体结合试验的操作技术要求。 本标准适用于家畜布氏杆菌病的血清学诊断， 其他动物可参考执行。 2引用标 准 下列标准所包含的条文， 通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时， 所示版本均 为有效。所有标准都被修订， 使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 试剂和材料 3 . 1试剂 3 . 1 . 1 试验用蒸馏水为G B / T 6 6 8 2中的三级水。 3 . 1 . 2 稀释液: 生理盐水。 3 门. 3 补体结合抗原: 按说明书使用， 使用前充分摇匀。 3 . 1 . 4 标准阳性血清: 冻干品， 使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 3 . 1 . 5 标准阴性血清: 冻干品， 使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 3 . 1 . 6 溶血素: 冻干品， 使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 3 . 1 . 7 补体: 冻干品， 使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 3 . 1 . 8 3 %绵羊红细胞悬浮液 选健康成年绵羊， 无菌颈静脉采血， 1 . 2 份阿氏液加 1 份血， 混匀， 4 冰箱内保存 5 d后备用。 使用 前摇匀取出所需量， 用稀释液离心洗涤 3次， 每次在水平转子离心机上 2 0 0 0 r / min离心 5 mi n ， 最后一 次 1 0 mi n , 除去上清液及白细胞层， 取下沉红细胞泥， 用稀释液稀释成 3 写的红细胞悬浮液。 3 - 2材料 3 . 2 . 1 玻璃试管: 1 0 mmX7 5 m m， 圆底， 洁净。 3 . 2 . 2 试管架。 3 . 2 . 3 微量移液器。 3 . 2 . 4 可调连续加样器。 3 . 3 被检血清 3 . 3 . 1 按常规方法采血和分离血清。 血清必须新鲜， 无蛋白絮凝物， 无溶血， 无腐败气味。 3 . 3 . 2 运送和保存血清 防止血清冻结和受热， 若 3d内不能送到实验室， 可用冷藏方法运送血清。 中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2 0 0 2 - 0 3 - 1 5 批准2 0 0 2 - 0 9 - 0 1实施 1 S N / T 1 0 8 9 -2 0 0 2 4操作方法 4 . 1 预备试验 正式试验前， 将试验的各种成分进行测定。 4 . 1 . 1 配制标准比色管 4 . 1 . 1 . 1 制备 3 %血红素 取 1 0mL3 %红细胞悬浮液， 加到 1 5 ml的刻度离心管中， 水平转子离心机上 2 0 0 0 r / mi n离心 1 0 mi n ， 吸弃上清液， 加蒸馏水到 9 m L， 反复吸打， 液体清亮， 然后加 1 mL8 . 5 抓化钠溶液混匀即可. 4 . 1 . 1 . 2 按表 1 配制标准比色管。 表 1 标准比色管的配制 溶血度 / % 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 0 0 3 %血红素/ .L 00 .0 10 . 0 20 . 0 30 . 0 40 . 0 50 . 0 60 . 0 70 . 0 80 . 0 90 . 1 0 3 %红细胞悬浮液/ mL 0 . 1 00 .0 90 . 0 80 . 0 70 . 0 60 . 0 50 . 0 40 . 0 30 . 020 . 0 10 稀释液/ .L 0 . 4 00 . 4 00 . 4 00 . 4 00 . 4 00 . 4 00 . 4 00 . 4 00. 400 . 4 00 . 4 0 处理混匀后离心 4 . 12 补体效价的测定 4 . 下2 . 1 试验当天打开若干瓶( 依试验所需量而定) 补体， 用蒸馏水溶解后， 取效价测定所需量作 1 / 2 0 稀释， 余下的补体置 4 C 保存备用。 4 . 1 . 2 . 2 取 7 个试管， 按表2加样， 然后将试验管置3 7 C 水浴箱中， 感作 3 0 min ( 每 5 mi n振荡 1 次) ， 水平转子离心机2 0 0 0 r / m i n离心3 m i n ， 与标准比色管比较， 记录溶血度。 表 2 补体效价测定 试管号 1234567 1 / 2 0 补体/ .L 0 . 010 . 0 20 . 0 30 . 0 40. 050 . 0 60 . 0 7 稀释液/ mL 0. 290 . 2 80 . 2 70 . 2 60. 2 50 . 2 40 . 2 3 致敏红细胞/ -L 0. 200 . 2 00 . 2 00 . 2 00. 2 00 . 2 00 . 2 0 4 . 1 . 2 . 3 在普通坐标纸上， 以溶血度为横坐标， 1 / 2 0 稀释补体的用量为纵坐标， 绘制曲线。 找出 5 0 %溶 血的补体用量， 作为 1 个单位补体。本试验用 3 个单位补体， 补体效价的计算见附录A。 4 . 1 . 3 溶血素效价的测定 4 . 1 . 3 . 1 稀释溶血素 取 0 . 2 m L溶血素原液， 加人到 1 9 . 8 m L生理盐水中， 制成 1， 1 0 0 稀释的溶血素， 再按表3稀释成 不同稀释倍数的溶血素。 表 3 溶血素的稀释 稀释液溶血素量/ mL 生理盐水/ mL 1 :5 0 0 1 :7 0 0 1 :8 0 0 1 :9 0 0 1 :1 0 0 0 I : 1 2 0 0 1 . 1 4 0 0 1 :1 6 0 0 1: 1 0 0 溶血素1 . 0 1: 1 0 0 溶血素1 . 0 1: 1 0 0 溶血素1 . 0 1: 1 0 0 溶血素1 . 0 1: 1 0 0 溶血家z . 0 1: 1 0 0 溶血素0 . 5 1: 1 0 0 溶血素0 . 5 1: 1 0 0 溶血素0 . 5 4 . 0 6 . 0 7 . 0 8 . 0 1 8 . 0 5 . 5 6 . 5 7 . 5 s x/ T 1 0 8 9 -2 0 0 2 表 3 ( 完) 稀释液 溶血素量/ . L生理盐水/ m L 1 , 1 8 0 0 1+2 0 0 0 1 :2 2 0 0 1 :2 5 0 0 1 :2 8 0 0 1 :3 0 0 0 1 :4 0 0 0 1 :5 0 0 0 1 :1 0 0溶血素0 . 5 1 ，1 0 0溶血家0 . 5 1， 1 0 0 0 溶血素2 . 0 1: 1 0 0 0 溶血素2 . 0 1: 1 0 0 0 溶血索2 . 0 1: 1 0 0 0 溶血素1 . 0 1: 1 0 0 0 溶血素1 . 0 1， 1 0 0 0 溶血素1 . 0 8 . 5 9 . 5 2 . 4 3 . 0 3 . 6 2 . 0 3 . 0 4 . 0 注: 如果溶血素是由等量甘油保存， 则溶血素原液所需量加倍。 并相应减少生理盐水量. 4 . 1 . 3 . 2 制备不同稀释倍数的溶血素致敏红细胞 取 1 6 个试管， 每管加 1 . 5 m L 3 %的红细胞悬液， 然后分别缓慢加人不同稀释倍数的溶血素 1 . 5 m1 _ . 混匀 ， 3 T C水浴箱中感 作 1 5 mi n, 4 . 1 . 3 . 3 按附录B所需量配制 1 / 2 。 稀释的补体。 4 . 1 . 34 用不同稀释倍数的溶血素致敏红细胞分别做补体效价测定( 结果参考附录 B ) , 4 . 1 . 3 . 5 溶血素效价 的确定 对每一个稀释度的溶血素均找出 5 0 %溶血时 1 / 2 0稀释的补体用量， 并换算成补体原液的用量( 方 法: 5 0 %溶血时1 / 2 0 稀释的补体用量除以2 0 ) . 在普通坐标纸上， 以补体原液的用量作为纵坐标， 溶血素的稀释度作为横坐标( 设定 1 / 5 0 0 稀释度 在坐标上的长度为 1 ， 其他稀释度与之相比， 所得的分数为各自在坐标上的长度) ， 绘制曲线。取溶血素 稀释倍数最高， 而补体用量较低的溶血素稀释度为试验用效价。本例所测溶血素为 1 / 1 8 0 0 -1 / 2 0 0 0 , 试验用稀释度取 1 八 8 0 0 ( 见图1 ) , 0. 00 35 qUU目n5 00韶0001 .0.0 0众。众 喇叹名堪医耸一作 0 .0 01 0. 00 05 /4 以 旧lj翻 万洲 胜/ 2田 钾F20淘1/ IR 山. 厂1侧盆 溶血索的稀释度 图 1 溶血素效价的测定 4 . 1 . 3 . 6 制备致敏红细胞悬浮液 按测定的溶血素效价稀释溶血素， 缓慢加人到等量的 3 %绵羊红细胞悬浮液中， 混合均匀， 置 3 7 C 水浴箱中 感作1 5 m in即 可。 4 . 1 . 4 抗原效价的测定 新购抗原可按说明书稀释使用， 如保存过久需要重新测定时， 可按下述步骤进行。 4 . 1 . 4 . 1 标准阳性血清和标准阴性血清分别用稀释液作 1 / 5 稀释， 置 6 0 C 水浴箱内灭活 3 0 mi n , 4 . 1 . 4 . 2 然后再将标准阳性血清做倍比稀释( 见附录C ) , 4 . 1 . 4 . 3 将抗原从 1 / 5 作倍比稀释( 见附录 C ) , S N/ T 1 0 8 9 一 2 D 0 2 41 . 闷 4 建立方阵试验 试管排列见附录C . 试验程序 : 。 . lm L血清+。 . lm L抗原+。 . lm L补体(3 个单位) 振荡摇匀， 4 感作 18 h +OZ mL 致敏红细胞振荡摇匀， 3 7 水浴 30 min。同时建立下列对照管: 红细胞对照: 0 . 3 mLV B S +0 . Zm L致敏红细胞。 1 个单位补体对照: 。 . lm LI 个单位补体+。 . Zm LV B S +02 mL致敏红细胞。 2 个和 3 个单位补体对照: 同上， 只是分别采用 2 个单位补体和3 个单位补体。 1 个单位补体=2 份 VBS +1份3个单位补体; 2 个单位补体=1 份 V BS +2 份 3个单位补体。 4 . 1 . 4 . 5 记录测定结果 从水浴中取出试验管， 水平转子离心机 2。 。 o r / m in离心 3m in， 与标准比色管比较， 观察溶血度， 记录结果( 结果举例见附录C ) 。 4 . 1 . 4 . 6 抗原效价的确定 对阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价。 4 . 2 本试验 4 . 2 . 1 试剂预稀释 4 . 2 . 1 . 1 溶血素、 抗原、 补体按预试验测定的结果稀释。 4 . 2 . 1 . 2 被检血清和标准阳性、 阴性血清用稀释液做 1 / 1 0 稀释， 置 60水浴箱内灭活30 min。 4 . 2 . 2 将灭活后的被检血清和标准阳性、 阴性血清分别做倍比稀释。 一般标准阳性血清的稀释度应超过其效价， 标准阴性血清可做三个稀释度。 4 . 2 . 3 试验程序 0 . l m L血清+0 . l mL抗原+。 . lm L补体振荡摇匀， 4 18 h +。 . Z mL致敏红细胞振荡摇 匀， 3 7 C水浴3 o m i n 。 同时建立抗原、 补体、 红细胞、 血清抗补体和标准阴性、 阳性血清对照( 见表4)。 标准阴性、 阳性血清 对照和被检血清同时做。 表 4血清效价的测宁 血 清试验管 血清抗补体对照抗原 对照 补体 对照 红细胞 对 照 1 / 1 0 1 / 2 01 / 4 01 / 1 01 / 2 01 / 4 0 血清/ mL 抗原/ mL 稀释液/ mL 补体/ rnL 0 1 0 .1 O l O 1 0 . 1 0 . 1 0 . 1 0 l 0 。 1 O 1 0 . 1 0 1 0 .1 0 。1 0 .1 0 .1 0 .1 0 .1 0. 1 0. 1 O l: . : 0 . 3 第一次感作 . 4 1 8h 致敏红细胞 0 . 20 . 2 0 . 20 20 . 20 . 20 . 20 . 20. 2 第二次感作 s 7 C水浴 s o mi n 从水浴中取出试验管， 水平转子离心机 Z0 0 0r / min离心 3m in， 比照标准比色管， 记录结果。 判定 确定每份被检血清效价 比照标准比色管判读 ， 达到 50%抑制溶血时血清的最高稀释度为该血清的效价。 结果判定 各对照的结果如下时， 则可以判定被检血清。否则， 补体的效价应重新测定， 并重新做 3 . 2的本 S N/ T 1 0 8 9 -2 0 0 2 试验 。 1 个单位补体对照: 5 0 写溶血。 2和 3 个单位补体对照: 1 0 0 %溶血。 抗原对照: 1 0 0 YQ溶血。 红细胞对照: 不溶血。 阳性血清对照: 结果与已知效价符合度士1 个滴度。 阴性血清对照: 1 0 0 %溶血。 血清抗补体对照: 如果抗补体管与试验管的抑制溶血程度相同说明该血清为抗补体。 通常， 被检血清稀释 1: 2 0 达到 5 0 %抑制溶血时判为阳性。 需要采用国际补体结合单位表示试验结果时， 可按照附录D中的换算公式换算成国际补体结合 单位 。 S N / T 1 0 8 9 -2 0 0 2 附录A ( 标准的附录) 补体效价的计算 基础计算 : 用于 CF T 的补体用量为 3个单位补体 。 X, K 3X Y,x Yz (A1) 式中: X, 配制 3 个单位补体所需补体原液的稀释倍数; K 滴定前补体稀释 倍数; Y测出的 1 个单位补体用量; Y 2 正式试验时每管补体用量。 校正计算: 在试验中发现补体在感作中损失一部分活性， 根据经验需使用基础计算补体用量的 1 . 倍， 即直接配 4 . 5 个单位的补体。但习惯上仍称为 3 个单位。其计算公式见式( A 2 ) : X2 K 4. 5又 Y X 夕:(A2) 式中: X2 -配制 3 个单位补体所需补体原液的稀释倍数; K滴定前补体稀释倍数; Y , -1 个单位补体用量; Y z 正式试验时每管补体用量。 举例: 如找出1 个单位补体用量为 0 . 0 3 5 ， 代人式( A 2 ) 中， 得 2 0 4. 5 X 0. 03 5 X 0.1= 12 即正式试验时补体稀 释倍数为 1 2倍 。 附录B ( 标 准的附录) 溶血素测定结果 表 B 1 溶血素测定结果 S x/ T 1 0 8 9 -2 0 0 2 表 B1 ( 完) 溶血素稀释度 . 补体用皿c 1 / z 0 稀释) 0 . 0 70 . 0 60 . 0 50 . 0 4 0 . 0 3 0 . 0 2 0 . 0 1 1 , 2 8 0 0 1 :3 0 0 0 1.40 0 0 1 :5 0 0 0 9 8 9 8 9 0 9 0 9 8 8 5 6 0 50 9 0 85 S 0 4 5 7 0 SO 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 注: 一表示 1 0 0 %溶血; 。 表示不溶血. 附录C ( 标准的附录) 抗原效价测定表 表 C1 抗原效价测定表 阳性血清 稀释度 抗原稀释度 (f R1 / 1 0 1 / 51/1 01 / 2 01 /1 01 / 8 0 1 / 1 6 01 / 3 2 0 1 / 6 4 0 1 / 5 1 /1 0 1/2 0 1 / 40 1 / 80 1 / 1 6 0 1 / 3 2 0 1 / 6 4 0 0 0 0 0 5 7 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 3 0 9 0 0 0 0 0 0 1 5 9 0 0 0 0 0 0 1 0 6 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 5 0 7 0 3 0一 1 0 1 0 6 0 8 0 9 0 0 0 0 0 0 5 0 阴性血清1 / 5 注: 数据表示溶血度; 。表示不溶血; 一表示 1 0 0 1 个单位补体对照( C l ) : 5 0 %溶血; 2 个单位补体对照( C 2 ) 和 3 个单位补体对照( C D: 1 0 0 %溶血; 红细胞对照: 不溶血。 本表测定结果显示， 抗原作 1 / 1 6 。 稀释时阳性血清的效价最高， 因此， 以1 / 1 6 。 稀释的抗原做为试 验用工作单位。 附录D ( 标准的附录) 国际补体结合单位 国际补体结合单位与血清效价的换算公式见式( DD: b =互 卫 0 0生 a ao (D1) 式中: b -国际补体结合单位， 工 U/ m 工 _ ; a被检血清效价; a -国际标准血清的效价。 注:国际标准血清是由WT O生物制品标准化专家委员会制定 并规定每安瓶含有 1 0 0 0 个 I U补体结合抗体公 S N / T 1 0 8 9 -2 0 0 2 式中， 国际标准血清的效价是用所使用的补体结合方法及试剂测定。 例如按所使用的方法测定国际标准血清， 其最终效价为 1 / 8 0 0 ( 5 0 %抑制溶血) ， 而同时测定某一被 检血清的最终补体结合效价为 1 / 4 0 ， 代人式( DD: 1 00 0X 40 80 0 则该被检血清的效价用国际单位表示为5 0 I U/ mL , 5 0 ( I U / mL ) 用本标准的试剂和方法测定出的国际标准血清效价正好为1 / 1 0 0 0 , 因此被检血清的国际单位数与 血清稀释倍数相同。