三七、川芎注射液对脊髓损伤后神经细胞凋亡及脊髓血流量变化的影响.pdf

中国中医骨伤科杂志 200 8 年4 月第 16 卷第 4 期 · 药物研究 · 三七、 川芍注射液对脊髓损伤后神经细胞凋亡及 脊髓血流量变化的影响 周鹤 张晓艳， 朱超2 楚向东2 摘要1 目的: 本文观察了三七、 川芍( s qcx)注射液对脊髓损伤后神经细胞凋亡及脊髓血流量变化的影响。 方法: 将 60 只 S D大鼠随机分为脊髓损伤后应用三七、 川芍注射液组和单纯脊髓损伤组。用改良的All e n s 方法造模成功后， 分别在术后 1 ， 2 ， 4 ， 8 ， 12， 24 h 用 H och es st荧光染色法对脊髓损伤区进行细胞凋亡的检测， 采用氢清除法测量脊髓血流量( SCB F)变化 。结果: 两组中均发现细胞凋亡， 模型组损伤 sh 后损伤节段灰质中阳性细胞达到高峰， 12h 后灰质中阳性细胞减少， 但白 质中出现凋亡细胞达到高峰。用药组sh 后细胞凋亡数与模型组有明显差异( 尸 0 . 0 5 ) ， 24h后两组比较有显著性差异 ( 尸 0 . o 1 ) 。SCBF 在损伤后 lh明显下降， 4 h 后略有回升， s h后达到最低。24h 两组比较有显著性差异( 尸 。 . 0 1 ) 。结 论: 脊髓损伤后可导致神经细胞凋亡， 三七、 川芍注射液能明显抑制细胞凋亡并提高脊髓血流量。 关键词 脊髓损伤; 细胞凋亡; 脊髓血流量; 三七、 川夸注射液 中图分类号 R 一3 3 R 6 8 3 . 2 R 9 6 5 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 5 一0 2 0 5 ( 2 0 0 8 ) 0 4 一0 0 2 9 一0 3 E f f e c t o f S a n q i a n dC h u a n x i o n gI nje c t i o no nA P o P t o s i s o f N e u r o c y t e a n dS P i n a I C o r dB l o o dF t o wa f t e r S P i n a l C o r d1 nju r y Z H O UP e n g Z H A N GX i a o 少 a n Z HUCha o C HUX a n g d o n g Z ， D e p a r t m e n t o f A n a t o m y ， We nzh o u Me d i c a l Col l e g e ， Z h ej i a n g 3 2 5 o 3 5 ， C h i n a Z D e p a r t m e n t o f o r t h o p e d i c s ， A f f i l i a t e dH o s p i t a l o f S h a n x i Col l e g e o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e Me d i c i n e A bst r act o bj e c t i ve: T oe x p l o r e t h e e f f e c t o f S a n q i a n d C h u a n x i o n g I nj e c t i o n( S Q C X I ) o na p o p t o s i s o f n e u r o c y t e a n ds p i - n a l c o r db l o o d f l o w( SCB F ) a f t e r s P i n a l c o r di nju r yi nr a t s . Me t h ods : S i x t y S P r a g u e- D a w l e yr a t s w e r e r a n d o m l y d i v i d e di n - t ot r e a t m e n t g rou p( t r e a t e dw i t hS Q C X I )a n dm o d e i g r o u P .T h em o d e 1 o f s p i n a l c o r di nju r yw a se s t a b l i s h e db yi m P rov e d A l l e n. s m e t h o d .H o c h e s s t f l uor e s c e n t s t a i n i n g w a s a p p l i e d t o e v a l u a t e a p o p t o s i s i n n e u r o c y t e a t 1 ， 2 ， 6 ， 8 ， 1 2 a nd 2 4 h o u r s r e s p e c t i v e l y a f t e r t h e o p e ra t i o n .Me a n w h i l e ， SCB Fw a s m e a s u r e db yh y d r o g e nc l e a r a n c e .R es u l ts : A p o p t o s i s o f n e u r o c y t e a p p e a r e di nb o t hg r o u p s .P o s i t i v e l yl a b e l e dn e u r o c y t e s i nm o d e l g r o u pr e a c h e dt h ep e a ki nt h eg r a ym a t t e r a t 8h o u r s a n d d e c r e a s e da t l 2 h o u r s m e a n w h i l e a P o p t o s i s i n t h e w h i t e m a t t e r r e a c h e dt h e p e a k . T h e r e w e r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i na p o p - t o t i c n e u roc y t e s b e t w e e n t r e a t m e n t g ro u p a n dm o d e l g rou pa t 8h o u r s a nd 2 4h o u r s ( P 0 . 0 5 ， P 0 . 0 1 ， r e s P e c t i v e l y ) . S C B Fd e c r e a s e da t l h o u r ， i n c r e a s e dm o d e r a t e l y a t 4h o u r s ， t h e n d e c r e a s e dt ot h e l o w e s t l e v e l a t 8h o u r s a n d a p P a r e n t s t a - t i s t i c a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s w a s o b t a i n e d a t 2 4 h o u r s ( P 0 . 0 1 ) . C onc l usi on: N e u r o c y t e a p o p t o s i s e 对 s t e d i n s p i n a 1 c o r di nj u r y w h i l e S Q C X I c o u l d r e m a r k a b l y i n h i b i t a p o p t o s i s a n di n c r e a s e t h e SCB Fa f t e r s p i n a l c o r d i nj u r y . K 灯 w o r d s S P i nal cord i nju r y ; A poP t o s i ， ; SPi n a l c o r db l o o df l o w; San q i a n dc h u a n 元 o n gi nject i o n 脊髓损伤( SCD后， 继发性损伤是导致不可逆转病理改变 的主要原因， 如何防止或减轻继发改变是医务科学工作者研究 的主要问题， 而神经细胞凋亡和微循环障碍是继发改变的主要 组成部分， 1一3 ， 目 前临床应用大剂量甲基强的松龙治疗脊髓损 伤， 有报道大剂量甲基强的松龙能抑制细胞凋亡， 川但大量激 素应用对患者产生很多负作用。 sj近年来， 中医药治疗脊髓损 ， 温州厌学院解剖学教研室( 浙江 温州， 3 2 5 o 3 5) 2 陕西中医学院附属医院骨科 通讯作者: 周鹏， E-m a i l : : x n p 8 8 8 8 y a hoo . com . c n Te l : 0 5 7 7 一8 6 6 8 9 9 6 5 伤取得了可喜成果， 有报导用川芍注射液、 三七注射液治疗脊 髓损伤， 疗效较好。笔者在大鼠脊髓损伤模型早期联合应用三 七、 川芍注射液， 采用原位末端脱氧核糖核昔酸转移酶介导 d U T P 标记法( T U N E L)， 观察三七、 川芍注射液对损伤脊髓神 经细胞凋亡和对脊髓血流量变化的影响， 为中医药治疗脊髓损 伤提供依据。 1 材料与方法 1 . 1 动物模型 6 0 只sD 大鼠， 体重2 0 0 士509 ， 随机分为模型组、 用药组。 将大鼠用 10%水合抓醛 3 00 m g / k g腹腔注射麻醉， 暴露 C g 一 T l ， 用改良的 Alle n打击法. 致伤脊髓， 并给予大鼠青霉素钠 80 万方数据 C h i n e s e J T r a d M e d T r a u m 与模型组 24h比较， P 0 . 01。 3 . 2 两组细胞凋亡数 伤后两组中均发现细胞凋亡， 用药组 s h后细胞凋亡率与 模型组有明显差异( 尸0 . 05) ， 24h后两组比较有显著性差异 ( P 0 . 0 1 ) ( 表 2 ) 。 表 2 各组大鼠受伤后脊髓中凋亡细胞情况 损伤后时间模型组 出 了0乙，上氏 匕JO户八Jb l h 2 h 4 h 8 h 1 2 h 2 4 h 2 . 1 4 士1 ， 8 2 7 . 5 3 士5 . 4 8 1 5 . 8 9 士5 . 6 8 2 3 . 6 4 士7 ， 5 8 1 4 . 5 9 士4 . 8 6 9 . 4 9 土8 . 6 2 用药组 3 . 4 2 士1 . 6 . 8 7 士4 . 1 4 . 3 8 士8 . 1 8 . 1 4 士8 . 1 2 . 8 1 士5 . 6 3 4 . 2 6 士2 . 3 9 么 注: 与模型组比较， 尸 0 . 05; 尸 。 . 01. 3 . 3 脊髓血流量变化与凋亡细胞之间的相关性( 图 1) 铸 口刁 吕 细胞调亡 圈 1 资肠血流，变化与凋亡细胞之间的相关性 明S C I 后 SCB F变化与细胞凋亡率有明显的相关性。 4 讨论 有关脊髓损伤继发改变机理的研究有微循环化学调节紊 乱、 自由基和血管机制、 细胞凋亡。最近有关细胞凋亡的报道 很多， 中枢神经系统损伤后广泛存在着神经细胞凋亡， 0傅强 等用T U N EIJ 法观察到细胞凋亡在受伤后4 h 达到高峰， 24h 明 显减少。体外实验证明神经生长因子撤除、 钙离子、 自由基等 均可导致细胞凋亡川， 凋亡在脊髓胚胎生长、 缺血、 创伤和神经 退行性变同样存在。有关细胞凋亡机理 目前还不清楚， 较流行 的观点是脊髓缺血导致细胞失营养或者生存信号缺失川。有 学者认为细胞凋亡是脊髓损伤后细胞死亡的主要原因， 因此如 何防止或减轻细胞凋亡是脊髓损伤治疗的关键。目前用甲基 强的松治疗脊髓损伤在临床上是公认的一种方法。用大剂量 甲基强的松龙治疗大鼠脊髓损伤， 发现大剂量甲基强的松龙能 明显减少细胞凋亡图。有人也同样观察到大剂量甲基强的松 对凋亡细胞起到抑制作用L 0 。但大剂量甲基强的松应用后对 肌体产生明显的付作用， 如何找到更有效更安全的治疗方法是 脊髓损伤后的关键。 本实验也观察到了大鼠脊髓损伤后细胞凋亡在 4 h 大量出 现， s h 达到高峰， 用药组细胞凋亡率在s h与模型组比较有所下 降， 24h 明显下降。可见三七川芍注射液能明显抑制细胞凋亡。 SCB F伤后明显下降， 4 h 后略有回升， s h 降到最低， 之后逐渐回 升， 24h两组 SCB F比较有明显上升， 三七川芍注射液能明显提 高脊髓血流量。章亚东等观察到脊髓血流量与脊髓功能恢复 显性相关， 提供了脊髓缺血与功能损害有密切关系的直接证 相关分析以0 . 05 为显著性相关。结果显示， S C B F与相应 时间点细胞凋亡率之间的相关系数为一。 . 2 4 6 8 ， 呈负相关。表( 下转第3 3页) 万方数据 中国中医骨伤科杂志2 0 08年4 月第16卷第4 期 血液循环供应系统破坏引起， 血管的减少， 使股骨头血液供应 不足， 股骨头的缺血状态直接导致了骨细胞坏死。股骨头缺血 性坏死与修复是同时存在的两个过程， 坏死后的修复首先是在 活骨一侧骨小梁间出现原始间充质细胞和毛细血管增生， 替代 了原有的骨髓组织， 以后增生的间充质细胞和毛细血管侵人死 骨间的骨髓， 这一过程在股骨头内逐渐扩展直达软骨下。有文 献认为股骨头塌陷的原因， 主要是坏死区再血管化不充分aj， 不能使坏死区产生足够血供， 其修复产生新骨的能力不足。因 此， 保护和改善股骨头局部微循环， 增加股骨头局部微血管的 生长， 可有效促进股骨头缺血性坏死的修复。 3 . 2 桃红四物汤促进微血管的再生 股骨头缺血性坏死在修复过程中微循环状态的改善起着 至关重要的作用， 微循环状态的改养包括微血管的再生和血液 粘稠度的降低。通过对模兔股骨头局部微血管密度( MV D ) 的 检测， 观察股骨头局部微血管再生以及新生血管向坏死区长人 的情况， 可作为改善股骨头局部微循环的指标之一。 高冬等闭 研究活血化寮中药对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响， 选用常 用的活血化寮中药赤芍、 当归、 红花、 川芍等， 结果表明所选中 药均能促进血管再生。本实验结果显示经过桃红四物汤治疗 1 周后， 治疗组股骨头局部有少量新生血管出现， 坏死股骨头局 部骨质未见明显改善， 与对照组未见明显差异。治疗 2 周后， 治疗组股骨头局部见大量微生血管再生， 股骨头软骨层增厚， 出现较多的成骨细胞， 细胞结构较清晰， 股骨头局部骨质改善， 空骨陷窝数减少; 对照组股骨头局部仍未见明显微血管再生， 股骨头软骨层较薄， 软骨下骨小梁变细， 间距增大， 结构紊乱， 有断裂现象， 骨小梁中大部分骨细胞坏死， 骨陷窝空虚多， 软骨 下区骨髓几乎完全为脂肪组织代替， 脂肪细胞增多， 体积增大， 有的融合成泡状， 生血细胞数量减少。治疗 4 周后， 治疗组见 大量新生血管形成， 聚集成团， 并向坏死区长人， 股骨头局部骨 质明显改善， 软骨层增厚， 软骨下骨小梁排列较规则整齐， 致密 饱满， 骨细胞清晰可见， 多位于中央， 偶见骨陷窝空虚， 髓腔内 可见增生活跃的骨髓组织， 造血细胞丰富。对照组可见少许新 生血管， 几乎没有新生血管延伸到坏死区， 股骨头局部骨质也 未见明显改善。结果表明桃红四物汤能促进股骨头局部微血 管的再生， 改善股骨头局部血运， 促进坏死股骨头的修复。 参考文献 1 齐振熙， 曹阳. 不同治法防治激素性股骨头缺血性坏死的实验研究 J .中国骨伤， 2 0 0 2 ， 1 5 ( 2 ) : 7 7 一 7 8 2 贺西京， 毛履真， 王坤正， 等. 肾上腺糖皮质激素引起股骨头缺血性 坏死的机制实验研究 J . 中华骨科杂志， 1 9 92， 1 2 ( 6 ) : 4 4 0 一 4 4 2. 3 j C A F F E YJ ， P A P E RA . A v a s c u l a r n e c ros i 。 : e a r l yMRim a g i n g a n d h i s t o l o g i c f i n d in g s i n a c a n i n e m o d e l J . AJR . 1 9 9 1 ， 1 5 7 : 3 4 1 一 3 4 5 . 4 高冬， 宋军， 胡娟， 等.活血化疲中药对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成 的影响 J . 中国中西医结合杂志， 2 0 0 5 ， 2 5 ( 1 0 ) : 9 1 2 一9 1 5 . ( 收稿 日期: 2 0 0 7 一0 9 一1 1 ) ( 上接第30 页) 据。有关脊髓缺血与细胞凋亡之间关系的报道还很少， 我们用 原位末端标记法和氢清除法分别测定细胞凋亡与SCB F ， 发现 在受伤后细胞凋亡与 S C B F在相同时间段呈负相关， 提供了脊 髓缺血与细胞凋亡之间有密切关系的直接证据。在一些脊髓 缺血性实验中， 研究者也发现了神经元凋亡细胞l 。本实验能 提高受伤后脊髓血流量并能抑制细胞凋亡， 其原因可能是川芍 嗦明显对血小板聚集有抑制作用， 能防止血管痉挛造成的局部 血栓。川芍还能抑制平滑肌 C a ， 十 内流， 还能改善微循环， 增加 血流量， 三七中含有三七总皂贰具有改善微循环， 增加血流量， 扩张痉挛血管， 阻断内流， 抑制血小板聚积及抗脂质过氧化等 作用， 通过提高血流量来减少细胞凋亡。 对于脊髓损伤后治疗目前研究的很多， 有激素治疗、 神经 营养素、 组织和细胞移植、 基因治疗等， 但大多数还处在实验阶 段， 因此用中医药治疗脊髓损伤可能是一种潜在的有效方法。 参考文献 1 S E K S O N LH，F E H I J I N G SM C .E p i d e m io l o g yd e m o g r a p h i c s a n dp a t h o p h y s i o l o g y o f a c u t e s p i n a l c o r di nj u r y J . S p i n e ， 2 0 0 1 : 2 6 一 2 4 . 2 H E N D E R S O NCE .P r o g r a m m e dc e l l d e a t hi nt h ed e v e l o p i n g n e r v o u s s y s t e m J . N e u r o n， 1 9 9 7 ， 1 7 ; 5 7 9 一 5 8 5 . 3 C A S H AS ， Y UWR ， f E H L I N G S MG . O l ig o d e n d e o g l ia l a p o p t o - s i s o c c u r s a l o n g d e g e n e t a t i ng a x o n s a n d i s a s o c i a t e dw i t h F a s a n d p 7 5 e x p e w s s io nf o l 1 o w i n gs p i n a l c o e di nj u e y J . N e u r o s c i e n c e， 2 0 0 1 ， 1 0 3 : 2 0 3 一 2 1 8 . 4 B R S C H EM B ， S H E P A R D ， MJ ， H O L P O R DTR ， e t a l . Me t h - y l P e e d n i s o l o n e o e u n l a z e d m e s y I a t c a d m in i s t e a t i o na f t e r a c u t e s P i- m a l c o e di nj u r y : l y e a r f o l l o wu p r e s u l t s o f t h e t h i e d n a t i o n a l a c u t e s p i n a l c o e di 川 u e yr a n d o m i z e dc o n t r o l l e dt r a i l J . JN e u ros u r g， 1 9 9 8 ， 8 9 : 6 9 9 一 7 0 6 . 5 关弊. 脊柱脊髓损伤的综合治疗及存在的问题【 月. 中国脊柱脊髓 杂志， 2 0 0 4 ， 5 : 2 6 1 一 2 6 2 . 6 L I UX Z ， X UXM， HUR ， e t a l .N e u r o n a l a n d g l i a l a P o P t o s i s a f - t e r t r a u m a t i 。s p i n a l c o r di nj u r y J . JN e u r o s c i ， 1 9 9 7 ， 1 7 : 5 3 9 5 - 5 4 0 6 . 7 Z H O N G LT， S A R A F I A NT K U N EDJ ，e t a l .B c l 一 Z in h a b i t s d w a t ho f 。 e n t r a l n e u ral c e l l i n d u c e db ym u t i p l ya g e n t s J . P r o e N a t l A c a ds c i U S A， 1 9 9 3 ， 9 0 : 4 5 3 3 一 4 5 4 1 . 8 V A N D E Nw， J A C O B SONMD . B U ME J F ， e t a l . A p o p t o s i s a n d B c l- Zp r o t e i ninc e l l ，侧t h o u tm i t o c h o n d r i a lD N A J .A m J P a t h o l ， 1 9 9 4 ， 1 4 5 : 2 9 4 一 3 0 5 ， g j 张强， 廖维宏. 大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤后神经细胞凋亡的 影响 J. 中华创伤杂志， 2 o 01， 2 : 8 9 一 91. 【 1 0赵斌， 孙正义. 大剂量甲基强的松龙对大鼠慢性压迫性脊髓损伤 后神经细胞凋亡的影响的实验研究 J . 中国脊柱脊髓杂志， 2 0 0 3 ， 2 : 9 5 一 9 7 . 1 1 Y O U N GC ， A M( ) L DpM， Z O N B I N EMN， e t a l . A p o p t o s i s i n c e l I u I a r c o m P a r t m e n t o f r a t s P i n a l c o r da f t e r s e v e r e c o n t u s i o ni n - j u r y J ， J N e u r o t e a u m a ， 1 9 9 8 ， 1 5 : 4 5 9 一 4 7 2 . ( 收稿 日期 : 2 0 0 7 一0 9 一3 0 ) 万方数据