丹酚酸B和高氧液对兔肢体缺血再灌注损伤代谢酶的影响.pdf

塑壶处壁堂盘查垫! ! 堡! 旦箜! ! 鲞箜! 塑望兰堕垒型! Q 堕墨塑垒生Q 墅曼垒垦垦! ! ! ! ：垫! Q ：! ! ! ：! ! ：塑! ：! ·1 · ·论著· 丹酚酸B 和高氧液对兔肢体缺血再灌注损伤代谢酶的影响 涂泽松陈志维李选群 广东佛山市中医院骨科佛山 5 2 8 0 0 0 【摘要】目的探讨高氧液和丹酚酸B 对肢体缺血再灌注损伤的影响。方法选用健康新西兰家兔2 4 只，随机分为4 组，在缺血前从耳缘静脉推注等量的生理盐水( A 组) 、高氧液( B 组) 、丹酚酸B ( c 组) 或高氧液加丹酚酸B ( D 组) 。夹阻股动 静脉，建立肢体缺血再灌注损伤模型，在缺血前和再灌注4 h 抽血检测L D H 、C K 。取腓肠肌作L D H 酶组织化学染色。结果再 灌注4 h 。血清肌酸激酶活性较前明显升高，高氧液和丹酚酸B 可以抑制其升高( P 0 0 1 ) 。两者有协同作用( P = 0 0 5 ) ；血清 乳酸脱氢酶活性较前明显升高，高氧液和丹酚酸B 可以抑制其升高( P 0 0 1 ) ，两者有协同作用( P 0 0 1 ) 。L D H 酶组织化 学显色见：相对于对照组其他组组织织L D H 酶活性较低，以联合用药组最低。结论 高氧液和丹酚酸B 对缺血再灌注损伤起 预防作用，而且两者有协同作用。 【关键词】高氧液；丹酚酸B ；缺血再灌注损伤 【中图分类号】 R 一3 3 【文献标识码】 A 【文章编号】1 0 0 7 8 9 9 1 ( 2 0 1 0 ) 0 4 0 0 0 1 0 3 I n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fS a i v i a n o l ia c i dBa n dh y p e r o x i cs o l u t i o no ne x p e r i m e n t a ll s c h e m i ar e p e r f u s i o ni n · j u r yo fe x t r e m i t y T uZ e s o n g ，C h e n gZ h i w e i ，L iZ h i w e i D e p a r t m e n to fO r t h o p a d i c s ，G u a n g d o n gF u s h a nt r a d i t i o n a lh o s p i t a l ， F u s h a n5 2 8 0 0 0C h i n a 【A b s t r a c t 】0 b j e c t i v eA i mt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fS a l v i a n o l ia c i dBa n dh y p e r o x i cs o l u t i o no ne x p e r i m e n t a lI s e h e m i ar e p e r f u s i o ni n j u r yo fe x t r e m i t y M e t h o d st w e n t y f o u rh e a l t h yN e wZ e a l a n dr a b b i t sw e r ed i v i d e di n t of o u rg r o u p sr a n d o m l y E q u i v a l e n t0 9 N a c l ( Ag r o u p ) ，h y p e r o x i cs o l u t i o n ( B ) ，S a l v i a n o l ia c i dB ( C ) ，S a l v i a n o l ia c i dBa n dh y p e r o x i cs o l u t i o n ( D ) w e r ei n j e c t e dt h r o u g he a r e d g ev e i nb e f o r ei s c h e m i a T h ef e m o r a la r t e r ya n dv e i nW a Sb l o c k e da n ds e tu pt h em o d e lo fi s c h e m i ar e p e d u s i o ni n j u r yo fe x t r e m i t y B e f o r ei s c h e m i aa n da f t e r4h o u r s r e p e r f u s i o n ，t h eb l o o ds a m p l e sw e r et a k e nt om e a s u r et h el e v e l so fb l o o dC r e a t i n eK i n a s e ( C K ) ，L a c · t a eD e h y d r o g e n a s e ( L D H ) T h eG a s t r o c n e m i u sm u s c l e sw e r eo b s e r v e db yt e s to fL D Hh i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g R e s u l t ss e n l mE n z y - m a t i ca c t i v i t yo fc r e a t i n ek i n a s e ( C K ) r a i s eo b v i o u s l y S a l v i a n o l ia c i dBa n dh y p e r o x i cs o l u t i o nc a np r e v e n tt h er a i s eo fi t ( P 0 0 1 ) T h e yp r e s e n ti n t e r a c t i o n ( P = 0 0 5 ) S e r u me n z y m a t i ca c t i v i t yo fl a e t a ed e h y d r o g e n a s e ( L D H ) r a i s eo b v i o u s l y S a l v i a n o l ia c i dB a n dh y p e r o x i cs o l u t i o nc a np r e v e n tt h er a i s eo fi t ( P 0 0 1 ) T h e yp r e s e n ti n t e r a c t i o n ( P 0 。0 1 ) T h et e s to fL D Hh i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g s h o wt h at h eo t h e rg r o u p sa r el o w e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u pa te n z y m a t i ca c t i v i t y T h eDg r o u pi st h el o w e s to ft h e m C o n c l u s i o nS a l v i - a n o l ia c i dBa n dh y p e r o x i cs o l u t i o nc a np r e v e n tt h el i p i dp e r o x i d a t i o ni ni s c h e m i ar e p e r f u s i o ni n j u r y T h e yp r e s e n ti n t e r a c t i o n 【K e yw o r d s 】H y p e r o x i cs o l u t i o n ；S a l v i a n o l ia c i dB ；I s c h e m i aR e p e r f u s i o nI n j u r y 再灌注损伤是指组织器官在缺血一段时间后恢复血液灌 流，缺血组织的损伤不仅没有减轻，反而有所加重。肢体再灌注 损伤在骨科临床上甚为常见，如肢体手术中止血带超时应用、断 肢( 指) 再植、栓塞后的再通等。丹酚酸B 是丹参的水溶性主要 成分，既往试验研究表明其有保护心肌和脊髓再灌注损伤的作 用，但其对肢体再灌注损伤的作用不明：静脉供氧是把氧疗和静 脉输液相结合的一种全新的给氧治疗方法，对各种缺血缺氧性 疾病的治疗，均取得一定疗效，所以本研究旨在探讨联合丹酚酸 B 和高氧液对兔肢体再灌注损伤过程中代谢酶的影响。 1 材料与方法 1 1 动物及分组选取新西兰家兔2 4 只，用随机数字表 基金项目：佛山市科技攻关项目( 2 0 0 7 0 8 0 6 5 ) 法将家兔随机分为A 组( 对照组) 、B 组( 高氧液组) 、c 组 ( 丹酚酸B 组) 、D 组( 高氧液和丹酚酸B 联合组) ，各组6 只。 1 2 主要试剂丹参单体丹酚酸B 购自上海沪云医药开发 公司；烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、氯化硝基四氮唑蓝、P B S 缓冲 液、乳酸钠均购自S i g m a 公司；L D H 和C K 液体试剂盒购自德 赛诊断系统有限公司。 1 3 高氧液制备应用西安高氧医疗设备有限公司研制的 高氧医用液体治疗仪制备高氧液。严格按照无菌操作规程进 行，基液选择2 5 0 m L0 9 氯化钠，氧气流量3 L m i n ，溶氧 2 0 r a i n ，使液体氧分压迅速上升至8 0 1 2 0 k P a ，所有液体于实 验当日进行充氧。 万方数据 ·2 · 塑直丛型堂盘查! ! ! Q 堡! 旦蔓! ! 鲞笙! 塑坚曼型垒塑! Q 堕垦盟垒生Q ! ! 型曼堡兰墨兰! ! ：! Q ! ! ：! ! ! ：! ! ：型! ：1 1 4 动物的处理 于缺血前半小时一次将2 0 m L k g 的0 9 氯化钠( A 组) ，2 0 m L k g 高氧液( B 组) ，溶有1 0 r a g k g 丹酚酸 的2 0 m L k g 的0 9 氯化钠( c 组) ，溶有1 0 m g k g 丹酚酸B 的2 0 m L k g 高氧液( 组) 从耳缘静脉推注入血，2 0 r a i n 匀速泵 完。 1 5 缺血再灌注模型制作模型按照W a n g 的方法，试 验前兔禁食1 2 h ，让其自由饮水，用2 戊巴比妥钠( 首次 4 0 r a g k g 。维持量2 0 k g k g 一·2 h 1 ) 耳缘静脉注射麻醉后，将 家兔仰卧位固定，颈部去毛，常规消毒，行颈外动脉插管，抽 取3 m l 血液，冰箱保存。在左侧腹股沟行3 c m 的切口，分离 股动静脉，在约大腿中下段平面用血管夹夹住阻断血流，同 时在其他组织用弹性止血带扎于大腿根部，张力以完全阻断 动脉血流为度。缺血4 h 后，放松止血带和血管夹，再灌注4 h 后取材。 2 指标检测 2 1 血清肌酸激酶( C K ) 和乳酸脱氢酶( L D H )取待测样 本血清各0 5 m L ，应用O l y m p u s a u6 0 0 全自动生化分析仪，采 用德赛诊断系统有限公司的液体试剂盒。 2 2 骨骼肌L D H 酶组织化学显色( 1 ) 新鲜骨骼肌取材 后；即行冰冻切片；( 2 ) 配反应液( 烟酰胺腺嘌呤双核苷酸 1 0 r a g ，氯化硝基四氮唑蓝5 m g ，0 0 5 M P H7 6 8 0 P B S 缓冲 液1 0 m l ，乳酸钠0 2 9 ) ；( 3 ) 将切片置于反应液中，3 7 0 C ，孵育 1 5 m i n ；( 4 ) 水洗，晾干；水性胶封片，镜检。 3 数据统计 所有血清检测数据采用析因分析设计的方差分析，统一 用S P S S1 3 0 进行统计分析绘图。 4 结果 4 1 缺血前和灌注后血清C K 见表l 、2 。 表l 各组缺血前和再灌注4 h 前后血清C K 活性( i4 - s ) 组别n 缺血前( U L ) 再灌注4 h ( U L ) 前后差值( U L ) A64 9 0 6 7 ±1 6 9 65 1 7 8 3 3 ±1 5 8 5 34 6 8 7 6 7 ±1 3 0 6 6 B64 8 0 1 7 ±3 5 9 9 4 8 8 0 1 7 ±1 6 4 7 l4 4 0 0 0 0 ±1 8 7 1 9 '' C64 8 8 3 3 ±4 3 1 14 9 2 3 6 7 ±2 6 9 2 94 4 3 5 3 3 ±2 7 4 4 9 D64 9 6 1 7 ±3 6 0 84 3 0 0 8 3 ±2 0 3 8 13 8 0 4 6 7 ±1 8 8 4 4 注：高氧效应F ：3 1 i ，P 0 0 I ；丹酚酸效应F = 2 6 4 ，P 0 0 l ；协同效应F = 4 3 ，P = 0 0 5 表2 各组缺血前和再灌注4 h 前后血清L D H 活性( ；±s ) 注：高氧效应F = 2 1 6 9 ，P 0 叭；丹酚酸效应F = 4 1 6 5 ，P 0 O l ；协同效应F = 2 4 3 ，P 0 ，O l 缺血再灌注4 h 各组血清中的L D H 活性显著升高，相对 于对照组( A 组) 。高氧液处理组( B 组) 和丹酚酸B 处理组 ( c 组) 上述指标明显下降( P 0 叭) ，两者的联合应用组( D 组) 表现更加明显( P 0 0 1 ) ，证实丹酚酸B 和高氧液两者 存在协同作用。 4 2 骨骼肌乳酸脱氢酶组织化学显色骨骼肌在再灌注后 表现为L D H 酶呈弥散分布，酶活性加强，空白对照组L D H 活 性呈最强阳性，而高氧液和丹酚酸B 组L D H 活性稍弱于对 照组，两者用药组L D H 活性呈最弱表现。与血清检测L D H 结果相符。( 图1 4 ) 图像视其着色深浅分为4 级悼1 。I 级：胞质1 2 以下区 域出现反应颗粒，为弱阳性( ±) 。级：胞质1 2 3 4 区域 出现较深的着色颗粒为阳性( + ) 。级：胞质出现深色反应 颗粒及少量团块，为中等阳性( + + ) 。l V 级：胞质内充满深 色团块反应物，为强阳性( + + + ) 。 图l ：A 组( 空白对照组) 乳酸脱氢酶活性升高，较其他3 组高，胞质内充满深色紫蓝色颗粒，并呈团状，酶活性呈强阳 性 缺血再灌注4 h 血清中C K 活性显著升高，相对于对照 组( A 组) 。高氧液处理组( B 组) 和丹酚酸B 处理组( c 组) 上述指标下降( P 0 0 1 ) ，两者的联合应用组( D 组) 表现更加明显( 尸= 0 0 5 ) ，丹酚酸B 和高氧液两者存在协图2 ：B 组( 高氧液组) 乳酸脱氢酶活性升高。较对照组 同作用。 低，胞质内可见较多紫蓝色颗粒，部分呈团状，酶活性里中等 阳性 万方数据 翌塑签登堂壅鲞! Q ! ! 笙! 旦笙! ! 鲞蔓! 塑曼曼塑垒丛! Q 望墨型叁圣Q ! 曼墅堡堡蔓塑! 型：! Q ! Q ：! 垡：! ! ! 蔓! ：兰 图3 ：C 组( 丹酚酸B 组) 乳酸脱氢酶活性升高，较对照 组低，胞质内可见较多紫蓝色颗粒，部分呈团状，酶活性呈中 等阳性 圈4 ：D 组( 联合组) 乳酸脱氢酶活性升高，较其他3 组 低，胞质内紫蓝色颗粒着色较浅，酶活性呈阳性 5 讨论 缺血再灌注损伤( i s e h e m i ar e p e r f u s i o ni n j u r y ，I R I ) 是指组 织缺血后的再灌注并不能缓解组织的损伤，而是加重组织细 胞的代谢障碍和结构破坏¨ 。近年来对其研究非常广泛涵 盖了心血管、神经专科、器官移植、骨外科等领域，而中医药 对缺血再灌注损伤的预防作用的研究更是方兴未艾，其中丹 参更是研究的热点。 ， 丹参为唇形科多年生草本植物的根和根茎昧苦，性微寒， 有活血调经、凉血消痈的作用。有活血祛瘀之功，瘀去则血脉通 畅，从个人达到破除瘕积的作用。它在肢体缺血再灌注损伤中 作用的研究已有了突出进展H 。1 。丹参作为一种临床常用的活 血化瘀药物，在治疗心、脑、肾等器官及肢体的缺血再灌注损伤 的临床实践中已取得较大疗效。丹酚酸B 是丹参药理作用的主 要成分之一，有研究表明它具有强大抗氧化作用和保护血管内 皮细胞哺1 ，还可增加受累组织的血流灌注和供氧量n 。 静脉供氧是把氧疗和静脉输液相结合的一种全新的给 氧治疗方法，对各种缺血缺氧性疾病的治疗，均取得一定的 疗效，具有很大实用价值”】。它以临床常用液体为基液，利 用光量子溶氧技术进行溶氧、活化，活化过程既有物理溶氧， 又有激光增氧使常规液体内的氧分压由2 1 k P a 提高到8 0 一 1 0 0 k P a 氧含量可高达1 4 6 ，其氧的弥散半径是正常动脉 血的两倍，与高压氧舱( 2 个纯氧大气压) 下的弥散半径大致 相等；并不改变基液的有效成分、热源、红细胞脆性和L D 。 符合人体输注的各项指标；直接输入静脉，迅速提高血浆中 的氧分压和氧饱和度。有实验表明，高氧液预处理能够调动 ·3 · 机体内源性保护机制，增强机体对缺血、缺氧的耐受性一j 。 骨骼肌对缺血损伤非常敏感。正常肌细胞内含丰富的 L D H 、C K ，细胞损伤早期，肌膜通透性增高，细胞内的酶释放 入血，血清中的酶即发生相应改变，随着肢体损伤程度的加 重，释放入血的酶进一步增加。因而血清中这些酶的含量可 作为肌细胞损伤的敏感指标，其含量的高低可反映细胞损伤 的程度。当组织缺血时，有氧代谢途径受阻而变为无氧代 谢，乳酸、乳酸盐大量增加，对细胞造成损害，细胞膜完整性 破坏，钾离子、细胞内酶及蛋白质外漏，血中肌酸磷酸激酶、 乳酸脱氢酶等升高明显，是检查骨骼肌损伤的重要指标，而 骨骼肌是对缺血最为敏感的组织之一。 本实验结果显示，再灌注4 h 血浆中C K 、L D H 显著增高， 表明组织细胞膜完整性遭到破环，细胞内酶外漏，骨骼肌的 大量损伤。丽在预先应用高氧液和丹酚酸B 后，相对于对照 组可以明显降低C K 和L D H ，证实两者可保护细胞膜的完 整，减少细胞内酶及蛋白质等释放入血，减轻细胞内外的微 环境的失衡状态。减轻组织细胞的损伤。这与病理结果中所 见相对于对照组其它组骨骼肌损伤程度较轻的情况一致，而 且高氧液和丹酚酸B 存在协同作用。 ： 参考文献 1 W a n gH G ，L iZ Y ，L i uX L A d d i t i o no ft a n s h i n o n eI I At oU W s o l u t i o nd e c r e a s e ss k e l e t a lm u s c l ei s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u - r y J A c t aP h a r m a c o lS i n ，2 0 0 6 ，2 7 ( 8 ) ：9 9 1 9 9 9 【2 杨景山医学细胞化学与细胞生物技术 M 北京：北京 医科大学中国协和医科大学联合出版社，1 9 9 0 ：4 3 4 4 ；5 8 3 B l e b e aJ ，K e r rJ C ，P a d b e r gF rJ r ，e t a l T r i p h e n y lt e t r a z o l i u m c h l o r i d ea 8ah i s t o c h e m i c a lm a r k e ro fs k e l e t a lm u s c l ei s e h e m i a a n dr e p e r f u s i o ni n j u r y J 】C U l Ts u r g ，1 9 8 7 ，4 4 ( 2 ) ：1 3 4 1 3 6 4 陈建常。史振满，王乐农，等肢体缺血再灌注致远处器 官损伤及丹参、甘露醇的保护作用 J 】临床军医杂志， 2 0 0 1 ，2 9 ( 2 ) ：1 7 1 8 【5 刘世清，顾家珍，陶海鹰，等丹参对肢体缺血再灌注脂 质过氧化反应影响的f 艋床观察 J 中华骨科杂志， 1 9 9 7 ，1 7 ( 1 ) ：6 3 6 5 6 】杜嵘，张伯礼，高秀梅，等丹酚酸B 对缺氧损伤心脏微 血管内皮细胞细胞间粘附分子表达的影响 J 】中国新 药与临床杂志，2 0 0 4 。2 3 ( 9 ) ：6 1 6 6 1 8 7 鲁力，张俐骨骼肌缺血再灌注损伤机制研究进展 J 中国中医骨伤科杂志，2 0 0 5 ，1 3 ( 6 ) ：7 6 8 0 ， 8 徐礼鲜，邢军。曹强，等高氧液静脉液体给氧在缺血缺 氧疾病治疗中的应用 J 第四军医大学学报，2 0 0 3 ，2 4 ( 1 3 ) ：6 8 9 V e r r a z z oG ，C o p p o l aL ，L u o n g oc ，e ta 1 H y p e r b a r i co x y · g e n ，o x y g e n o z o n et h e r a p ya n dr h e o l o g i cp a r a m e t e r so f b l o o di n p a t i e n t sw i t hp e r i p h e r a lo c c l u s i v ea r t e r i a ld i s e a s e J U n d e rS e aH y p e r bMe d ，1 9 9 5 ，2 2 ( 1 ) ：1 7 ( 收稿2 0 1 0 一0 5 一1 2 ) 万方数据