乳鼠皮层神经元原代培养与观察.pdf

邵b _ 匾 玄ls t 隆 i c l+ 'f 赌瑙 - 7 卫R ·1 0 3· 乳鼠皮层神经元原代培养与观察 邵延坤， ， 王溪原; ， 工越W ' , 饶明 俐，( 1 . 吉 林大学第一医院神经内 科， 吉林长春1 3 0 0 2 1 ; 2 . 吉林大学第一医院 骨科， 吉林长春1 3 0 0 2 1 乃. 吉林大学基础医学院病理教研室 吉林长春1 3 0 0 2 1 ) ( 摘 要 目 的: 通过原代培养乳鼠 皮层神经元， 为脑血管疾病的研究提供实验模型。 方法: 酶消化法原代培养出 生1 天Wis t a r 乳鼠的皮层神经元， 利用免疫细胞化学和免疫荧光方法进行鉴定。 结果: 培养的细胞贴壁生长， 胞体饱满， 突起较长。 免疫细胞化学 染色显示神经元特异性烯醉化酶阳性细胞达8 5 % 免疫荧光显示胶质细胞酸性蛋白阳性细胞达1 5 % 。 结论: 酶消化法原代培养乳鼠 皮层神经元是一种可靠, 稳定的获得神经元的方法。 关键词 皮层; 神经元; 酶消 化法; 细胞培养 中图分类号: R- 3 2 2文低标识码: A文章编号: 1 0 0 4 - 0 4 1 2 ( 2 0 0 3 ) 0 2 -01 0 3 - 0 2 P r i m a r y c u l t u r e o f c o r t i c a l n e u r o n s o f n e w b o rn r a t S H A D Y a n - k u n ' , W A N G X i - y u n i' , W A N G Y u e - h u ffs , e t a G ( 1 . D e p a r t m e n t o f N e u r o lo g l ， t h e F ir s t H o s p it a l of P i n U n i v e r s i ty , C h a n g c h u n 1 3 0 0 2 1 ; 2 . D e p a r t m e n t o f O rt h o p a e d ic s , t h e F ir s t H o s p it a l of T i l in U n iv e rs ity , C h a n g c h u n 1 3 0 0 2 1 ; 3 . D e p a rt m e n t o f B a s ic M e d ic a l S c i e n c e C o lle g e , 3 ili n U n iv e r s ity , C h a n g c h u r l 1 3 0 0 2 1 , C h i n a ) A b s t r a c t : O b j e c ti v e T o e s t a b l i s h o f n e w b o rn r a t a n d fi n d a g o o d w a y to t h e fu r t h e r in v e s t ig a e o n o f a n e x p e ri m e n t 习 c e r e b rov a s c u l a r m o d e l o f p r i m a ry c u l t u r e o f c o r t i c a l n e u ro n s d is e a s e s . Me t h o d P r i m a ry c u l t u re o f c o r t i c a l n e u ron s o f n e wb o rn r a t wa s p e r f o r m e d b y th e m e t h o d o f e n z y m e d ig e s ti o n .E v a l u a ti o n o f n e u r o n sw a s m a d e b y i n a r r r u n o c y t o c h e m i c a l a n d i m m u n o l l u o r e s - c e n c e t e c h n i q u e s .R e s tr t t s C u l t u re d n e u ro n s w e r es t i c k t o t h e wa ll o f t h e c u l t i v a ti o nbothplate w h e n t h e y w e r e g ro w i n g . T h e n e u ron s s a ti e ty a n d w i t h l o n g a p o p h y s is .l m m u n o c y t o c h e r n ic a l s t a i n in g M e a n wh i l e i n u n u n o fl u o r e s c e n c e t e s t i - i i c a t e d a b o u t 1 5 % GF APshow ed(ghal 8 5 % N S E ( n e u ro - s p e c ifi c e n o l a s e ) p o s it i v e s t a in in g c e ll s fi b r i li a ry a c i d i c p ro t e m ) p o s i ti v e s ta in i n g c e l l s c dt o r e P 而U 门 了 c w i t h h i g h Ke y o f c o r t i c a l n e u r o n so # n e w b o rn r a t b y t h e m e t h o d o f e n z y m e d i g e s t i o ni s a r e li a b l e w a y t o o b t a i n 宜n n 曰n d n n n e u ron s a n d s ta b i li t y w o r d s ; C o r t e x ; Ne u mn ; E n z y m e d i g e s t i o n m e t h o d ; C e ll c u l t u r e 神经元是一种高度分化的 细胞， 在动物出生后很少分裂; 而且神经元分化程度高， 神经突起发育成熟， 从成熟神经组织 分离神经元， 会使神经元受到更大的普遍损伤， 因此对神经元 进行分离培养的要求较为特殊。 而建立一种稳定、 可靠的获得 神经元的方法， 可为了解神经元的结构与功能， 阐明其在脑血 管疾病、 神经系统疾病中的作用奠定基础。同时建立一个稳定 的神经元培养体系， 也为诱导干细胞向神经元定向分化提供 可能。 本实验通过酶消化法原代培养乳鼠 皮层神经元， 可获得 纯度较高的神经元， 而为脑血管疾病、 神经系统疾病的研究提 供成功的实验模型。 1 材料与方法 1 . 1 实验动物及主要试剂:出 生1 天的 Wis t a r 乳鼠由吉林大学 实验动物中心提供。胎牛血清购自杭州四季育生物工程材料 研究所。 D M E M( D u lb e c c o “s m o d i fi e d E a g l e ' s m e d iu m ) 培养基 作者简介: 邵延坤( 1 9 7 0 - ) ， 女， 吉林省东丰县人， 主治医师， 吉林 大学第一医院神经内科在读博士研究生， 主要从事肺血管疾病研究。 购自 G i b c o 公司。多聚赖氨酸、胰蛋白酶, T r i m n X - 1 0 0 均购自 S i g m . 公司。兔抗人神经元特异性烯醇化酶 ( n e u ro n a l s p e c ifi c e n o l a s e , N S E )多克隆一抗、兔抗人神经胶质纤维酸性蛋白 ( G li a l fi b r ill a ry a c i d p m t e in , G F A P ) 多克隆一抗， 羊抗兔I g G - F I T C , S P 试剂盒均购自 福州迈新生物技术公司。 1 . 2 神经元培养 参照K o h l ' 建立的方法进行改良。选用出生 2 4 h 以内的 Wis t a r 大鼠的乳鼠 进行原代神经元培养。 将乳鼠断 头取脑， 于无菌条件下取出大脑皮层， 体视显微镜下剥离血管 及软脑膜， 将脑组织剪碎成约。 5 m r n s 的小块， 置于。 .2 5 % 胰蛋 白酶中消化 3 7 0 C 孵育2 0 m i n ， 其间每隔5 m i n 振荡1 次。加人含 2 0 % 胎牛血清的 D M E M终止消化。 1 0 0 0 r / n u n 离心， 弃上清。 用 含2 0 9 o 胎牛血清的D M E M培养液反复吹打组织块使之变成单 细胞悬液。 2 0 0 目尼龙网过滤后计数。 调细胞浓度为5 x 1 U s / m l , 接种于事先铺有多聚赖氨酸的2 4 孔板中。将接种的细胞置于 3 7 0 C , 5 % C O , 的 孵箱中培养。4 8 h 后全量换液， 7 2 h 后将培养液 更换为含1 0 % 胎牛血清的培养液， 并加人终浓度为1 0 l L g / m l 的 阿糖胞昔以抑制非神经元的增殖。再过4 8 h 后半量换液， 使阿 万方数据 1 0 4 吉 林医 学2 0 0 3 年4 月 第2 4 卷第2 期 糖胞昔浓度保持在5 p g / n l 以维持对非神经元的抑制。 此后每2 天换液1 次 1 . 3 神经元形态学观察: 每天用倒置显微镜对培养细胞的生 长过程及形态学变化进行观察和拍照， 在2 0 0 倍镜下观察并计 数存活神经元数。 1 . 4 神经元免疫细胞化学染色:预先在培养板中置人涂有多 聚赖氨酸的盖玻片， 待细胞融合后取出， 用D- H a n k ' s 液冲洗， 4 % 多聚甲 醛固定2 0 n u n , P B S ( O .1 M， p H 7 .2 ) 清洗， 3 x 5 m in ， 加 0 . 3 % T n t o n - 1 0 0 作用1 5 m in , 0 .3 % 过氧化氢甲醇液作用3 7 ' C 2 0 m i n ， 甩去血清， 分别滴加兔抗N S E 抗体( 稀释度1 :2 0 0 ) ， 对照 组加P B S ( O .O 1 M, P H 7 .2 ) , 4 保湿过夜， P B S 洗脱， 3 x 5 m in 。 加 生物素标记羊抗兔I g G , 辣根过氧化物酶标记卵白素( S P 试剂 盒， 迈新公司 , D A B 显色( 迈新公司) ， 胞浆出现棕色颗粒为阳 性。 L S 神经元免疫荧光染色:预先在培养板中置人涂有多聚赖 氨酸的盖玻片， 待细胞融合后取出， 用D - H a n k s 液冲洗, 4 % 多 聚甲醛固定2 0 n u n , P B S 清洗, 3 x 5 m i n ，加。 . 3 % T r i t o n - 1 0 0 作用 1 5 - in , 1 % 过氧化氢溶液阻断1 5 m i n , P B S 清洗， 3 x 5 m i n ， 正常血 清封闭0 2 0 m i n , 滴加兔抗G F A P ( 稀释度1 : 5 0 ) , 4 0 C 保湿过夜。 滴加羊抗兔I g G - F I T C ( 稀释度1 :6 4 ) ,避光2 h , P B S 清洗, 3 x 5 n u n , 荧光显微镜下观察， 镜下出 现绿色荧光为阳性。 2 结果 2 . 1 形态学观察: 培养的神经元在接种2 4 h 后即可贴壁生长， 细胞铺展， 长出细小的突起。 神经元在培养1 0 d 时， 神经元胞体 饱满， 胞体周围有明显的折光性， 立体感强， 神经突起较长且 相互连接成网。胞浆较透亮， 胞核大， 核仁大而明显。 2 . 2 免疫细胞化学染色: N S E 免疫细胞化学鉴定原代培养皮 层神经元， 8 5 % 为阳性细胞。表现胞浆内出现棕黄色颗粒 2 . 3 免疫荧光染色: G F A P 免疫荧光染色可见培养细胞中， 1 5 % 出 现绿色荧光， 此为神经胶质细胞。 3 讨论 根据形态培养的神经元可分为两大类tz t : 一类是胞体大， 突起较长， 细胞呈锥形或多角形; 另一类是胞体小， 呈梭形， 突 起多为多极或较短。用神经元特异性烯醇化酶染色证明大部 分细胞呈阳性， 即大部分细胞为神经元细胞。用正常兔血清代 替一抗， 未见神经细胞阳性染色。说明神经元特异性烯醉化酶 抗体敏感、 可靠， 具 有特异性。 也证实我们所获得的 细 胞为神 经元细胞。在神经元培养过程中， 最容易混人的是胶质细胞， 去除胶质细胞主要用化学抑制剂。G F A P 是胶质细胞特异的中 间丝蛋白， 利用G F A P 鉴定发现， 在培养的神经元中G F A P 荧光 染色阳性的细胞占1 5 %， 这也进一步证实培养所获得的神经元 的纯度达到8 5 % 由于神经元较其他细胞在体外难以存活和生长，因而在 体外培养神经元时， 在盖玻片上豁包被多聚赖氨酸， 可以促进 神经元的翻附。 这是培养中的一个关键。 实验证实酶学方法分 离对神经元的损伤较小，而机械吹打可使神经元普遍受到损 伤。因此， 经反复摸索， 我们发现， 酶消化法培养乳鼠皮层神经 元是一种稳定、 可靠的获得神经元的方法， 为进一步研究脑血 管疾病、 神经系统疾病提供实验模型。 4奋 洛 寸 针 1 1 K o h J Y , C h o i D W. Q u a n t i ta t iv e d e t e r m i n a ti o n o f g lu - ta m a t e - m e d ia t e d c o r t ic a l n e u ro n a l i n j u ry i n c e ll c u l tu r e b y la c ta t e d e h 州ro g e n a s e e91- a s s a y J 1 . J N e u m s c i Me th o d s , 1 9 8 7 ;2 0 ( 1 ) : 8 2 . 2 薛庆善， 冯武鸣. 神经组织的 体外培养方法U 1 .解剖学进 展, 1 9 9 6 : 2 ( 4 ) : 3 4 9 . 领面部X光片误诊 1 例分析 马竞雪， 齐桂杰， 王幼力( 吉林市中心医院口 腔科， 吉林吉 林1 3 2 0 1 1 ) 中图分类号: R 8 1 4 . 4文献标识码; B文章编号 1 病历摘要 患者女， 5 6 岁， 农民， 左面部肿胀伴畸形， 来诊。 无自发痛， 咀 嚼 及 进 食 无 明 显 受 限 。 检 查 : 5 6 7 区 颊 沟 膨 隆 ， 压 之 无 乒 乓 球 感及波动感， 骨壁较硬。穿刺抽出血性液体， 涂片检查未见胆 固醇结晶及癌细胞。X 片示: 病变区有溶骨性破坏， 边缘不整 齐, X 线印象为左上领恶性肿瘤。 鉴于涂片检查未检出癌细胞， 不能盲目 作扩大根治术。术前讨论决定先行探查术， 作冰冻切 片检查证实为恶性肿瘤后， 再行截骨术。术中发现领骨破坏， 去骨后见囊膜组织 包膜完整， 轻易从骨腔内剥离， 病理诊断 为根端囊肿。术后创口1 期愈合。 2讨 i O : 1 0 0 4 - 0 4 1 2 ( 2 0 0 3 ) 0 2 - 0 1 0 4 - 0 1 临床诊断X 线片报告是主要手段之一， 但并非绝对的。 有 的读片是良性但实际是恶性; 有的读片为恶性的， 例如本文所 述: 溶骨性破坏， 边缘不整齐， 穿刺为血性液体， 皆提示为恶性 肿瘤， 但是在行扩大根治术前， 还需要病理检查作最后诊断， 否 则， 将给病人带来莫大的痛苦。目 前X 线摄片技术不断发展和 改进， C T 及核磁共振片检查， 将提高诊断水平。临床医生可以 在结合病史， 检查后考虑辅助一些高水平的诊疗手段， 以提高 诊断准确率。 收 稿日 期: 2 0 0 2 - 0 9 - 2 6 编辑杨宇) 万方数据