二硫代氨基甲酸吡咯烷增敏多西他赛对卵巢癌细胞毒性作用的机制研究.pdf

第4 4 卷第3 期 2 0 0 6 年3 月 山 东大学学报( 医学版) J O U R N A L O F S H A N D O N G U N I V E R S r r Y ( H E A L T H S C I E N C E S ) V o l . 4 4 N o . 3 Ma r . 2 0 0 6 文章编号: 1 6 7 1 一 7 5 5 4 ( 2 0 0 6 ) 0 3 一 0 22 4 8 一 0 4 二硫代氨基甲酸毗咯烷增敏多西他赛对 卵巢癌细胞毒性作用的机制研究 刘国红， 王苏荣， 王波 ( 山东大学齐鲁医院妇产科， 山东济南2 5 0 0 1 2 ) 摘要 目 的: 探讨核因 子ic B ( n u c l e a r f a c t o r k a p p a B , N F - rc B ) 活化抑制剂二硫代氛基甲 酸毗咯烷( 珍- ro l i d i n e D i t h io c a r b a m a t e , P D T C ) 对多西他赛( D o c e t a x e l ) 致卵巢癌S K O V - 3 细胞毒性作用的影响。方法: 用不 同浓度 P D T C , D o c e t a x e l 以不同时间间隔作用于卵巢癌 S K O V - 3细胞, M T r 法观察细胞生长抑制， W e s t e rn B l o t 法分析胞浆内N F - K B抑制蛋白a ( i n h i b i t o r o f N F - ic B , I - ic B - a ) , 胞核P 6 5 蛋白表达; 流式细胞术检刚细胞 凋亡。结果: D o c e t a x e l ( , 1 m g / L ) 或P D T C ( : 1 0 l u n o l/ L ) 均明 显 抑制S K O V - 3 细 胞的生长， 引 起细 胞凋亡; 小 剂量P D T C ( 2 . 5 , 5 p rn o l / L ) 和D o c e t a x e l ( O . 0 1 州L ) 联合应用与单用D o c e t a x e l 比 较， 可明显抑制细胞生长， 增加细胞凋亡率; 单用D o c e t a x e l 组与对照组比较， 胞装1 - rcB - a 蛋白减少而胞核P 6 5 蛋白增多， 加用P D T C 可逆转此现象。结抢: 小剂量P D T C可增强卵巢癌细胞劝D o c e t a x e l 的 敏感性， 这一作用与P D T C 抑制P 6 5 蛋白 进入核内有关。 关键词 卵巢肿瘤; 多西他赛; 二硫代氛基甲酸毗咯烷; 核因子一 ic B ; 细胞凋亡 【 中图分类号 R 7 3 7 . 3 1 文献标识码 A 巧r r o l i d i n e d i t h i o c a r b a m a t e e n h a n c e s c h e m o s e n s i t i v i t y o f ovar ia n c a n c e r c e l l s t o d o c e t a x e l a n d i t s ma c h a n i s m L I U G u o - h o n g , W A N G S u - ro n g , W A N G B o ( D e p a r tm e n t o f O b s t e tr i c a n d G y n e c o l o g y , Q i l u H o s p i t a l o f S h a n d o n g U n i v e r s i t y , J in a n 2 5 0 0 1 2 , S h a n d o n g , C h i n a ) A B S T R A C r O b j e c t i v e : T o e v a l u a t e th e e f f e c t o f n u c l e a r f a c t o r k a p p a B ( N F - K B ) in h ib i t o r p y r ro l i d i n e d i - t h io c a r b a m a t e ( P D T C ) o n d o c e t a x e l in d u c e d c y t o t o x i t y i n o v a r ia n c a n c e r c e ll s . M e t h o d s : M T l ' a s s a y , W e s te r n b lo t a s s a y a n d fl o w c y t o m e t ry w e re u s e d t o m e a s u r e t h e s u r v i v a l r a t e , I - K B - a a n d P 6 5 p ro t e i n , a n d t h e a p o p t o s i s o f S K O V - 3 o v a r i a n c a n c e r c e ll , f o ll o w i n g t re a t m e n t o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f d o c e t a x e l a n d P D T C a t v a r i o u s i n t e r v a l s , re - s p e c t iv e l y . R e s u lt s : B o t h d o c e t a x e l ( :1 m g / L ) a n d P D T C ( )1 0 ti m o l / L ) s i g n i fi c a n t ly i n h i b i te d t h e g ro w t h o f S K O V - 3 c e ll s a n d i n d u c e d t h e a p o p o t o s i s , w h e re a s d o c e t a x e l c o m b i n e d w it h P D T C a t l o w c o n c e n t r a t io n s i n h i b i te d t h e g ro w t h o f c a n c e r c e ll s a n d i n d u c e d t h e a p o p t o s i s m o re s i g n i f i c a n t l y t h a n d o c e t a x e l a l o n e . D o c e t a x e l c a u s e s d r e d u c t i o n i n c y t o - p l a s m i c I - if- a p ro t e i n a n d i n c r e a s e i n n u c l e a r P 6 5 p ro t e i n , w h i l e i t c o m b i n e d w it h P D T C re v e r s e d t h i s e ff e c t . C o n - e l u s i o n : P D T C a t l o w c o n c e n t r i t i o n e n h a n c e s c h e m o s e n s i t i v i ty o f o v a r i a n c a n c e r c e l l s t o d o c e t a x e l ， w h i c h i s re l a t e d t o i t s i n h i b i t i o n o f P 6 5 p ro t e i n ' s n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n . K E YWO R D S O v a r ia n n e o p l a s m s ; D o c e t a x e l ; P y r r o l i d i n e d i t h i o c a r b a m a t e ; N F - k a p p a B ; A p o p t o s i s IR A * 国家自 然科学基金资 刘国红( 1 9 6 8 一) ， 女， ( 3 0 2 7 1 3 1 6 ) 0 士， 副主任医师，主要研究方向: 妇科肿瘤。 刘国红， 等. 二硫代氨基甲酸毗咯烷增敏多西他赛对卵巢癌细胞毒性作用的机制研究2 4 9 化疗是卵巢癌术后主要的治疗手段之一， 化 疗耐药与肿瘤复发是患者生存率降低的主要原 因。多西他赛( D o c e t a x e D 是紫杉醇类抗癌药， 是目 前卵巢癌特别是复发性卵巢癌的有效化疗药物。 N F - K B 是多极性的转录因子， 可转录调控一系列与 细胞生存相关基因的表达而发挥抗凋亡作用。研 究表明， 紫杉醇耐药现象的产生与N F - ic B的活化 有 关 。 本研 究针对N F - rc B 是一种氧敏感转录因 子， 能够直接被活性氧介质激活这一特点LZ l ， 选择 抗氧 化剂二硫代氨基甲 酸毗咯烷( p y r r o l id in e d i - t h i o c a r b a m a t e , P D T C ) ， 研究其抑制 N F - ic B活化的机 制， 并观察它与 D o c e t a x e l 联合应用对卵巢癌细胞 生长的影响。 1 材料与方法 1 . 1 细胞系及培养条件人卵巢癌S K O V - 3 细胞 系( 简称 S K O V - 3 ) 购自美国A T C C ( A m e r i c a n t y p e c u l t u re c o l l e c t i o n ) ， 山东大学齐鲁医院肿瘤防治中 心实验室冷冻保存。细胞在R P M I 1 6 4 0 ( G i b c 。 公 司产) 培养基( 含1 0 %的小牛血清， 2 梦 L 碳酸氢 钠， 青霉素、 链霉素各1 0 0 U / L ) 中传代培养， 2 一 3 d . 传代1 次。培养条件为5 % C O Z 、 饱和湿度、 3 7 。 实验均取指数生长期细胞。 1 . 2 M T T法检测细胞存活率S K O V - 3细胞 0 . 2 5 % 胰蛋白 酶消化后， 调整细胞浓度为2 . 5 x 1 扩 个/ m l ， 接种于%孔板， 2 0 0 川 / 孔， 每孔设4 个复孔。 细胞贴壁后换培养基， 加人 D o c e t a x e l ( 齐鲁制药有 限 公司产， 批号: 0 4 0 4 0 0 4 。终浓度分别为0 . 0 1 , 0 . 1 , 1 , 1 0 , 1 0 0 m g / L ) , P D T C ( S i g m a 公司产， 终浓度 分别为2 . 5 , 5 , 1 0 , 2 0 , 4 0 p m o l / L ) 。 另设置只 加培养 基的调零孔和不加药物的对照组， 共同孵育2 4 , 4 8 h 。 联合作用组则先加人 P D T C终浓度分别为 2 . 5 , 5 , 2 0 u m o l / L ， 作用 1 h 后再加人 D o c e t a x e l 0 . 0 1 m g / L ， 共同孵育4 8 h 。然后加人5 g / L M T T 2 0 V I / 孔( 调零孔除外) ， 继续培养4 h ， 吸去培养液 加入二甲 基亚矾( D M S O ) 2 0 0 川 ， 振荡1 5 m i n , 酶标 仪4 9 0 n m波长， 以调零孔调零校正后比色测定O D 值。 按下列公式计算肿瘤细胞存活率， 肿瘤细胞 存活率= ( 实验组O D 值/ 对照组O D 值) x 1 0 0 %. 1 . 3 W e s te rn B l o t 法检测细胞核中P 6 5 蛋白和细 胞浆中I - K B - a 蛋白表达S K O V - 3 细胞5 x 1 了个 / m l 接种于培养瓶中， 贴壁后分别加人D o c e t a x e l ( 终 浓度0 . 0 1 m g / L ) 和P D T C ( 终浓度5 l u n o l / L ) ， 联合作 用 组则先加人P D T C 5 p i n o U L ， 作用1 h 后再加人 D o c e t a x e 1 0 . 0 1 m g / L ， 共同孵育1 , 3 , 2 4 h 后分别收 获细胞。按文献 1 方法分别提取胞浆及胞核蛋 白， B r a n d f o r d 法进行蛋白 定量， 调整浓度， 2 5 p g 蛋 白 上样， S D S 聚丙烯酸胺凝胶电泳分别对核蛋白和 胞浆蛋白 进行分离( 美国E C 2 5 0 - 9 0 电泳仪) ， 转印 到硝酸纤维素膜上( B i o r e d 公司， 电转膜槽) , 5 %脱 脂奶粉封闭后分别加人1 : 1 0 0 0 的P 6 5 , I - K B 一 a 兔 抗( S a n t a C n iz 产) 4 过夜。辣根过氧化物酶标记 羊抗兔 二抗( S a n t a C r u z 产) 孵育 1 h , T B S洗涤后 D A B 显色。利用 K o d a k D i g it a l S c i e n c e 1 D I m a g e A n a l y s i s S o f t w a re( E a s t m a n K o d a k C o m p a n y . U S A ) 对 W e s t e r n b l o t 结果进行图象分析， 计算条带的积分 吸光度= 平均吸光度x面积。结果以实验组积分 吸 光 度与 相 应件 a c t i n 条带的 积分吸 光度的比 值即 相对积分吸光度表示。 1 . 4 流式细胞术检测 S K O V - 3 细胞凋亡P D T C ( 终浓度5 , 2 0 p m o l / L ) , D o c e t a x e l ( 终浓度0 . 0 1 , 1 m g / L ) , P D T C 5 u n o l / L 作用 1 h 后加 D o c e t a x e l 0 . 0 1 呵L 作 用4 8 h ， 收获细胞， 制成单细胞悬液， P B S 洗涤后， 取1 0 6 个细胞与P I 染色液( 3 3 m g / rn l P I , 0 . 1 3 m g / m l R n a s e A , 1 0 m m o l / 1 E D T A , 0 . 5 % T r i t o n X - 1 0 0 ) 室温孵育2 0 m i n 。流式细胞仪( 美国 B D 公司) 检测D N A - P I 荧光强度。结果分析采用 M o d F i t 软件。 1 . 5 统计学处理采用S P S S 1 3 . 0 统计分析软件 对所有测定值进行均值、 标准差计算和相应统计 分 析， 结果 用* 士 s 表 示， 组间比 较 采 用 zX检 验。 2 结果 2 . 1 D o c e t a x e l , P D T C对S K O V - 3 细胞生长的影响 D o c e ta x e l : 1 m g / L 及P D T C :, 1 0 fa n o l / L 均明 显抑 制S K O V - 3 细胞的生长， 且随作用时间增加， 抑制 作用加强， 见表 1 ; 低浓度 D o c e t a x e l 或 P D T C 对细 胞生长抑制不明显， 但两者联合应用则可明显抑 制细胞生长( P 0 . 0 5 ) ， 见图t o 2 5 0 山东大学学报( 医学版)科卷 3 期 表 1 不同浓度 】) o c e t a x e l , P D “I 作用不同时间对S K O V - 3 细胞存活率的影响. 士 : ， %) 一一 一一 组别 D o c e ta x e l ( p / m g “ L - ' )P D T C ( c / p m o l “ L - ' ) 2 4 h 4 8 h 9 0 . 3 11 . 2 7 8 . 9 士1 . 8 1 . 6 11 . 8 5 2 . 5 土1 . 4 5 2 7 3 3 7 士2 212 . 0 ' 3 7 . . 2 ' 'A 1 8 . 9 士1 5士1 . 5 “ 1 0 . 6 11 . 8 . 6 “ ' 5 . 7 士 1 . 5 ' A, 9 7 . 】 士1 如 . 5士1 0 8 8 . 3 士1 5韶. 7 11 4 6 2 . 6 士 2 7 4 4 . 2士1 0 “ 3 7 . 4 士1 8 * 'A 2 2 . 1 1 2 8 * 1 2 . 9 11 . 5 ' 1 ' 'A' 6 . 4 土 1 . 9 ' 'A P 0 . 0 5 ) ， 但两者联合应用使细胞凋亡率明显升高 ( P di n t e d i n h i b i t i o n o f N F - i c B c o n f e r s c h e m o s e n s i t ; a r i o n a n d a p o p to s i s i n p r o s t a t e c a n c e r c e ll s J . I n t J O n c o l , 2 0 0 3 , 2 3 ( 2 ) : 3 1 7 - 3 2 3 . 仁 2 R a n g a n G K , W a n g Y , T a y Y C , e t a l . I n h ib i t io n o f N F k a p - p a B a c t i v a t i o n w i t h a n t i o x i d a n t s i s c o r r e l a t e d w i t h r e d u c e d c y t o k i n e t r a n s c r ip t io n i n P M J . A m J P h y s io l , 1 9 9 9 , 2 7 7 - ( 5 2 ) : 7 7 9 - 7 8 9 . 3 B e g A A , S h a W C , B r o n s o n R T , e t a l . E m b ry o n ic l e t h a li t y a n d liv e r d e g e n e r a t io n in m ic e l a c k i n g t h e R e I A c o m p o n e n t o f N F - ic B J . N a t u re , 1 9 9 5 , 3 7 6 : 1 6 7 - 1 7 0 . 4 W a n g C Y , M a y o M W , K o m e lu k R G , e t a l . N F - k B a n t i - a p o p t o s i s : i n d u c t i o n o f T R A F I ，T R A F 2 , c - I A P 1 a n d c - I A P 2 t o s u p p r e s s c a s p a s e - 8 a c tiv a t io n J . S c ie n c e , 1 9 9 8 , 2 8 1 ( 5 3 8 3 ) : 1 6 8 0 - 1 6 8 3 仁 5 P a t e l N M , N o z a k i S , S h o rt l e N H , e t a l . P a c l it a x e l s e n s it iv - i t y o f b r e a s t c a n c e c e l l s w it h c o n s t r u c t i v e l y a c t i v e N F - ic B i s e n h a n c e d b y k B a s u p e r - r e p r e s s o r a n d p a r th e n o l id e J . O n c o g e n e , 2 0 0 0 , 1 9 ( 3 6 ) : 4 1 5 9 - 4 1 6 9 . 6 W a n g C Y , C u s a c k J C , L iu R , e t a l . C o n t ro l o f i n d u c ib l e c h e m o r e s i s ta n c e : e n h a n c e d a n t i - t u m o r t h e r a p y t h r o u g h i n - c re a s e d a p o p t o s is 场i n h i b it i o n o f N F - a B 【 J . N a t M e d , 1 9 9 9 , 5 ( 4 ) : 4 1 2 - 4 1 7 . 7 G u n a w a r d e n K , M u r r a y D K , S w o p e R E , e t a l . I n h ib i t i o n o f n u c l e a r f a c t o r k B i n d u c e s a p o p t o s i s f o ll o w i n g t r e a t m e n t w it h t u m o r n e c r o s is f a c t o r - a a n d a n t io x id a n t i n h u m a n p o s ta - t o c a n c e c e ll s J l . C a n c e r D e te c t P r e v , 2 0 0 2 , 2 6 ( 3 ) : 2 2 9 - 2 3 7. 收稿日 期2 0 0 5 - 0 4 - 2 0 ( 编样: 刘霞)