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书书书 ·论著· 作者单位： 300070 天津医科大学眼科中心 通讯作者： 孙慧敏， Email： iiitc eyou. com 人角膜上皮干细胞的识别 陈卓 孙慧敏 苑晓勇 【摘要】 目的 探讨人角膜上皮干细胞的分子标记。方法 对人角膜和角膜缘部位行组织学 检查以分析角膜缘解剖结构。对人角膜切片和整个角膜组织行免疫组织化学染色以检测中央角膜和 角膜缘部位未分化标记， 如核蛋白 p63、 乳腺癌抵抗蛋白 （ABCG2， BCRP1） 、 烯醇化酶 、 整合素 6、 9 及 1、 表皮生长因子受体 （EGFR） 、 细胞角蛋白 19 （CK19） 、 14 （CK14） 及转铁蛋白受体 （CD71） 的表 达，经荧光显微镜和激光扫描共焦显微镜观察。对角膜中部和角膜缘上皮细胞的 mRNA 进行半定量 逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 和原位杂交以检测其相关基因的表达。结果 角膜缘部位横向切片 显示角膜缘上皮细胞为乳头放射状排列， 对应于 Vogt 栅栏环境。未分化标记整合素 1、 EGFR、 烯醇 化酶 及 CK19 在角膜缘基底细胞胞质染色较表层细胞更强；p63、 ABCG2、整合素 9 蛋白仅见于角 膜缘基底部上皮细胞。激光扫描共焦显微镜观察和 RT-PCR 结果显示角膜缘表达 p63、 ABCG2、整合 素 9 蛋白及 mRNA。原位杂交显示 p63 仅表达于角膜缘基底层细胞。结论 角膜缘上皮呈乳头放 射状排列， 角膜缘干细胞群具有复合标记：p63 表达于细胞核、 ABCG2 表达于胞质、 整合素 9 表达于 胞膜。采用这些标记复合体， 可将角膜缘干细胞群与其他上皮细胞区分。 （中华眼科杂志，2005， 41： 1014-1019） 【关键词】 上皮， 角膜； 干细胞； 角膜缘； 免疫组织化学； 生物学标记 Identification of human corneal epithelial stem cells CHEN Zhuo，SUN Hui-min，YUAN Xiao-yong. Tianjin Medical University Eye Centre，Tianjin 300070，China Corresponding author：SUN Hui-min，Email：iiitcJ eyou. com 【Abstract】 Objective To investigate the molecular markers of corneal epithelial stem cells. Methods The anatomy structure of corneal limbus was analyzed by histological examination. Fluorescence microscopy and laser scan confocal microscopy（ LSCM） were used to evaluate the expression of undifferentiation markers as p63，ABCG2，6，9 and 1 integrin，-enolase，EGFR，cytokeratin 19 （CK19）and CD71 in cornea-limbus sections and whole mount cornea tissue using immunohistochemistry staining. Semiquantitative RT-PCR and in situ hybridization （ISH）were used to evaluate gene expression of corneal and limbal epithelia.Results The limbal area in horizontal cut direction showed that limbal epithelial cells were as papilloma-form to correspond to the Palisades of Vogt environment. The expressions of 1 integrin，K19，-enolase and EGFR were much stronger in limbal basal cells than superficial cells. Undifferentiation markers p63，ABCG2，9 integrin were detected only in the basal limbal epithelial cells. LSCM and RT-PCR results showed that the protein and mRNA of p63，ABCG2 and 9 integrin were only detected in limbal epithelia. ISH showed that p63 mRNA only expressed in the limbal basal epithelial layer. Conclusions The corneal limbal epithelial area is papilloma-form. Limbal stem cells have complex markers as p63 expressing in the nuclei，ABCG2 in the cytoplasm and 9 integrin expressing in the membrane. With these markers complex，it is easy to distinguish limbal stem cells from other epithelial cells in cornea. （Chin J Ophthalmol ，2005， 41： 1014-1019 ） 【Key words】 Epithelium， corneal； Stem cells； Limbus corneae； Immunohistochemistry； Biological markers 组织特异性干细胞对保持整个躯体组织包括眼 组织的完整性起着关键的作用。角膜上皮干细胞位 于角膜缘 1的证据是： （1） 角膜缘基底细胞缺乏角 膜上皮细胞分化相关角蛋白组合 CK （cytokeratin） 3 和 CK12 2； （2） 角膜缘基底上皮细胞具有增殖的特 性， 用 DNA 前 体3H胸 苷 或 溴 脱 氧 尿 核 苷 （BrdU） 3示踪标记显示其细胞周期长3； （3） 角膜 缘上皮细胞部分或全部缺损后， 角膜上皮出现异常 的伤口愈合， 如结膜化、 角膜化和慢性炎性反应 4； （4） 角膜缘肿瘤相对较多， 而角膜上皮肿瘤较少 5； （5） 角膜缘细胞已用于角膜缘干细胞缺乏患者引起 ·4101·中华眼科杂志 2005 年 11 月第 41 卷第 11 期 Chin J Ophthalmol， November 2005，Vol 41，No. 11 表 1 引物的序列及其产物长度 基因来源*顺向引物反向引物PCR 产物 （bp） 核蛋白 p63XM-036421CAGACTCAATTTAGTGAGAGCTCATGGTTGGGGCAC440 ABCG2AY017168AGTTCCATGGCACTGGCCATATCAGGTAGGCAATTGTGAGG379 整合素 9NM-002207TGGATCATCGCCATCAGTTTGCCGGTTCTTCTCAGCTTCGAT123 GAPDH 内对照M33197GCCAAGGTCATCCATGACAACGTCCACCACCCTGTTGCTGTA498 注： *来源为该基因在基因库中序号 角膜上皮部分或全部缺损的角膜重建 6。这些证 据有力支持角膜上皮干细胞位于角膜缘部位， 但仍 无直接识别角膜缘干细胞的特异标记物。 目前提出的上皮组织干细胞主要标记可分为 3 组：（1） 细胞黏附成分： 整合素、 表皮生长因子受体 （Epidermal growth factor receptor， EGFR） ；（2） 胞质 内 CK19、 烯醇化酶 、 乳腺癌抵抗蛋白 ABCG2；（3） 核蛋白 p63。 本研究采用离体角膜组织检测上述提出的标记 以确定角膜上皮干细胞，旨在完整地分析角膜干细 胞标记； 应用这些标记， 将干细胞与其他细胞分开。 材料和方法 一、 人角膜和角膜缘组织的制备 正常人角膜和角膜缘组织取自德克萨斯狮子会 眼库。将组织经包埋浸入液氮后行 10 µm 冰冻切 片。沿纵向切穿角膜中心， 或沿横向切过角膜边缘。 对其行苏木素-伊红 （HE） 染色和免疫组织化学染 色。将人角膜缘组织浸入 10% 甲醛磷酸盐缓冲液 中 1 2 d， 转移至 70% 乙醇， 脱水， 石蜡包埋， 制备 5 µm切片。石蜡切片用于免疫组织化学染色及原 位杂交。 二、 角膜上皮细胞 mRNA 的提取与逆转录聚合 酶 链 反 应（ reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR） 采用保存时间短于 36 h 的新鲜角膜。用直径 为 8 mm 的环钻将中间角膜和角膜缘分开， 刮下角 膜和角膜缘上皮细胞并置于 4 mol/ L 呱乙锭中。用 硫氰酸盐呱乙锭-苯酚-氯仿法萃取 mRNA。定量 mRNA 浓度后 -80保存。以三磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 基因为内对照， 用半定量 RT-PCR 法对角 膜和角膜缘上皮 mRNA 的不同分子标记进行分析。 取 0. 5 µg 的 mRNA 经逆转录酶 （ 美国 Applied Biosystems 公司） 转录后， 用不同的引物 （表 1） 进行 PCR 扩增。在 PCR 第 20、24、28、 32、36、40 周期 时取标本检查结果绘制曲线。 三、 免疫荧光染色 人角膜缘冰冻切片行免疫荧光染色， 经解冻、 脱 水， 固定于甲醇或 2% 多聚甲醛 10 min 后漂洗。先 将切片置入 5%正常山羊血清的缓冲液封闭 1 h 以 减少非特异性抗体的结合， 该溶液也用于稀释抗体。 加入单克隆抗体： 整合素 1 （1: 200， 美国 LabVision 公司） 、 整合素 6 （1: 200， 美国 Sigma 公司） 、 核蛋白 p63 （1: 1000， 美国 LabVision 公司） 、 EGFR （1: 20， 美 国 LabVision 公司） 、 CD71 （1: 200， 美国 LabVison 公 司） 、 CK19 （1: 300， 美国 DAKO 公司） 、 CK14 （1: 100， 美国 ICN Pharmaceuticals 公司） ； 多克隆抗体抗大鼠 ABCG2（1: 100， 美国 Calbiochem 公司） 、 山羊烯醇化 酶 （1: 100， 美国 Santa Cruz Biotechnology 公司）及 兔整 合 素 9（ 1 : 200，美 国 George Washington University Medical Center， Stepp M. 教授惠赠） ， 室温 下1 h。缓冲液漂洗后， 加入二抗山羊抗鼠、 抗大鼠、 抗兔 及 猴 抗 山 羊 Alexa Fluor488（1 : 200， 美 国 Molecular Probes 公司） 室温下 1 h 后缓冲液漂洗。 全部切片用 DNA 结合荧光染料 Hochest33342 做对 照染色后盖片于数码显微系统 （model DMX 1200， 日本 Nikon 公司） 观察照相。 四、 免疫组织化学染色 用免疫组织化学法对 p63、 ABCG2 及整合素 9 在角膜缘的表达进行检测。石蜡切片脱蜡、 脱水后， 5%正常山羊血清的缓冲液封闭 1 h， 加入单克隆抗 体 p63 （1: 1000） 、 多克隆抗体 ABCG2（1: 100）及整 合素 9 （1: 100） ， 4过夜。缓冲液漂洗后， 生物素 化抗鼠 IgG 抗体与辣根过氧化物酶结合，3， 3-二氨 基联苯胺 DAB 显色， 产生棕色沉淀为阳性。 五、 角膜全组织免疫荧光染色与激光扫描共焦 显微镜观察 新鲜角膜全组织经 2% 多聚甲醛固定 10 min 后， 缓冲液漂洗多次， 含 20% 正常山羊血清的缓冲 液封闭 2 h， 加入鼠单克隆抗体 p63 （1: 1000） ， 多克 隆抗体 ABCG2（1: 100） 、山羊烯醇化酶 （1: 50） 或整合素9 （1: 100） ， 4过夜。 缓冲液漂洗后， 分 ·5101·中华眼科杂志 2005 年 11 月第 41 卷第 11 期 Chin J Ophthalmol， November 2005，Vol 41，No. 11 表 2 角膜和角膜缘上皮细胞的标记情况 标记p63ABCG2整合素 9整合素 1EGFRCK19烯醇化酶 CD71整合素 6 角膜表层-+ + + + + + + 角膜基底-+ + + + + + + + + + + 角膜缘表层±±±+ + + + + + 角膜缘基底+ + + + + + + + + + + + + + + + +- 别加入二抗山羊抗鼠、 抗大鼠、 抗兔及猴抗山羊 Alexa Fluor488 （1: 200， 美国 Molecular Probes 公司） 室温下 1 h 后缓冲液漂洗。 全部切片用碘化丙啶 （propidium iodide， PI）做 对照染色后盖片于激光扫描共焦显微镜 （LSM 510， Zeissw/ Krypton-argonandHe-Nelaser，美 国 Thornwood 公司） 下观察照相。激光发射波长分别 为 488 nm 和 543 nm，滤光片分别为 LP505 和 LP560。图像放大 400 倍后记录， 经 Zeiss 激光扫描 共焦显微镜和 Adobe Photoshop 6. 0 软件处理。 六、 原位杂交 p63-PBSK 质粒经限制性内切酶 SmaI 消化， 线 性化后经 Sp6 RNA 聚合酶 （美国 Promega 公司） 合 成反义探针， 限制性内切酶 XbaI 消化与 T7RNA 聚 合酶 （美国 Promega 公司） 生成正义探针。线状质粒 胶分离， 用作模板以制备正义和反义 35S UTP 标记 的核酸探针 （美国 Amersham Parmacia 公司） ， 转录 混合物在 37进行至少 2 h 转录， 消化、 纯化、 沉淀 后以 50 µl 二乙焦炭酸盐 （DEPC） 水重悬。 5 µm 石蜡切片脱蜡再水化， 10% 甲醛-磷酸盐 缓冲液固定和蛋白酶消化后， 切片于杂交混合物中 60预杂交 1 h。探针 100变性 5 min， 然后加入 到杂交复合物中， 60 杂交过夜。漂洗切片多次。 RNA 酶 A 消化后再次漂洗； 干燥后， 切片置于照相 乳剂 14 d， 显微镜下暗视野观察， 杂交信号为暗 影像。 结果 一、 角膜缘解剖结构 通过角膜中央区的角膜-角膜缘纵向切片， 可见 角膜缘上皮细胞有 10 层， 而角膜上皮有 5 6 层， 细 胞结构为三角形， 底部为眼球表面， 基底细胞较表层 细胞密集 （图 1A） 。同时采用沿角膜边缘水平方向 切片， 不通过角膜中央区， 角膜缘呈乳头状， 对应于 Vogt 环境的栅栏， 沿基底膜为一单层基底细胞， 乳 头间隙有血管和结缔组织 （图 1B） 。 图 1 （A） 角膜正中切片显示角膜上皮细胞有 5 层， 而角膜 缘上皮细胞有 8 10 层；（B） 角膜缘切线切片显示乳头状样 上皮细胞， 乳头间的为结缔组织 HE 染色 ×200 二、 角膜和角膜缘干细胞相关标记的表达与 定位 未分化标记， 如 p63、 ABCG2 及整合素 9 仅表 达于角膜缘基底细胞核、 胞质及胞膜， 在角膜和角膜 缘的表达形式基本一致 （图 2， 3） 。 整合素 6、 1、 EGFR 及 CD71 在角膜缘基底细 胞膜表达强于表层细胞， 在角膜组织也检测到其表 达， 只是仅见于角膜基底细胞。细胞-基质连接标记 整合素 1 在角膜缘基底部表达较该部位表层更 强， 整合素 6 同时强烈地着色于角膜和角膜缘基 底细胞膜。CK19 和烯醇化酶 主要表达于角膜缘 基底细胞的胞质， 角膜缘表层和角膜也有染色。在 所有角膜和角膜缘切片中 EGFR 均为阳性， 角膜缘 基底 细 胞 表 达 最 强， 同 样 的 发 现 也 见 于 CK19 （表 2） 。 免疫组织化学染色 （图 4） 更清楚地显示 p63、 ABCG2 及整合素 9 仅表达在角膜缘基底细胞。激 光扫描显微镜 （图 3） 显示在角膜缘基底细胞 p63、 ABCG2、 整合素 9 及烯醇化酶 的阳性细胞明显 多于角膜基底细胞。 三、 角膜和角膜缘分子标记的基因表达 以三磷酸甘油脱氢酶 （GAPDH） 作为内对照， 半 定量RT-PCR检测角膜缘干细胞相关标记的基因 ·6101·中华眼科杂志 2005 年 11 月第 41 卷第 11 期 Chin J Ophthalmol， November 2005，Vol 41，No. 11 图 4 免疫组化染色显示 （A） p63、（B） ABCG2 及 （C） 整合素 9 在角膜缘上皮细胞的表达 （箭头） 免疫组织化学染色 ×400 图 2 免疫荧光染色显示干细胞相关标志 p63、 ABCG2、 整 合素 9、 整合素 1、 EGFR、 CK19、 烯醇化酶 、 整合素 6 及 CD71，在 角 膜（ 左）和 角 膜 缘（ 右 ）中 的 表 达， Hochest33342 作为细胞核对照染色 免疫荧光染色 ×200 表达。结果显示 p63、 ABCG2 及整合素 9 在角膜 缘上皮细胞的表达明显高于角膜上皮细胞。有 1 份 角膜组织有少量的 p63 和整合素 9 表达， 可能是 由于在分离角膜和角膜缘时有部分角膜上皮和角膜 缘上皮相混合所致。整合素 6、 EGFR、 CK19 及烯 醇化酶 在角膜和角膜缘上皮中表达几乎无差别 （图 5） 。 四、 原位杂交技术显示角膜缘干细胞核内 p63 mRNA 的表达 为确定 p63 在角膜缘和角膜区域的表达方式， 对角膜和角膜缘组织行 p63 原位杂交， 对照为 p63 图3 激光扫描共焦显微镜显示角膜全组织中 p63、 ABCG2、 整合素 9 及烯醇化酶 在角膜和角膜缘的表达， PI 作为细 胞核对照染色 免疫荧光染色 ×400 正义探针， 无杂交信号， 而反义核酸探针显示 p63 mRNA 清楚位于角膜缘基底上皮细胞核内， 而角膜 缘表层上皮和角膜无信号。结果提示 p63 mRNA 仅高表达于角膜缘基底上皮细胞（图 6） 。 ·7101·中华眼科杂志 2005 年 11 月第 41 卷第 11 期 Chin J Ophthalmol， November 2005，Vol 41，No. 11 图 6 原位杂交显示 35S 标记 p63 探针在角膜和角膜缘中的表达，（A） p63 顺义探针不显信号 ×400，（B） p63 反义探针显示仅在角膜缘 上皮基底细胞中表达 ×400 图 5 半定量 RT-PCR 检测干细胞相关标记 p63、 ABCG2 及整 合素 9 的 mRNA 分别在角膜 （C1 C3） 和角膜缘 （L1 L3） 中的表达， GAPDH 作为内对照 五、 角膜上皮干细胞示意图 基于上述研究结果， 提出角膜缘基底细胞层角 膜上皮干细胞标记示意图 （图 7） 。p63 表达于干细 胞细胞核、 ABCG2 表达于胞质、 整合素 9 表达于 胞膜。 讨论 一、 角膜缘解剖结构及角膜上皮干细胞小龛 从解剖角度看， 角膜缘是角膜和结膜上皮的连 接或过渡区域， 本研究中， 在角膜边缘沿水平方向行 角膜缘切片。该方向的切片能清楚地说明角膜缘基 底部上皮细胞和其上层细胞不同的排布方式所构成 的角膜上皮干细胞小龛。角膜上皮干细胞小龛是指 角膜干细胞所生存的环境， 包括邻近的细胞、 血管神 经及胶原等。角膜缘的柱状结构对干细胞有许多优 点： 可为自我更新所需的大量干细胞提供更大的面 积， 这样对不同深度的角膜上皮损伤产生更有效的 反应； 角膜缘基底上皮细胞邻近血管丰富的网状结 图 7 角膜缘基底细胞层角膜上皮干细胞标记示意图 构， 有助于提供充足的营养和其他支持因子。 二、 角膜缘基底上皮细胞独特地表达 p63、 ABCG2 及整合素 9 核转录因子 p63 强烈表达于人类许多上皮组织 的基底细胞 7。据报道 p63 基因敲除小鼠暴露的 表皮组织缺乏复层上皮并有丛集的终末分化角质细 胞 7， 8， 在人类角质细胞 p63 的表达与其增殖潜能 有关 9， 我们的研究与这些既往报道相一致。经免 疫组化、 RT-PCR 和原位杂交证实 p63 仅强烈地表 达于角膜缘某些基底细胞， 而非角膜缘表层上皮细 胞和角膜上皮细胞。 ABCG2 为乳腺癌抵抗蛋白 1（BCRP1） ， 已被认 为是骨髓干细胞的决定性分子标记，也被认为是干 细胞的通用标记 10。我们的结果表明 ABCG2 表达 于人眼表上皮细胞， 而其蛋白和 mRNA 表达仅限于 角膜缘基底细胞。角膜缘干细胞 ABCG2 阳性可能 表示干细胞有阻止其自身受药物和毒物损伤的特 征。 整合素为异二聚体跨膜受体， 在分化组织， 半黏 附于连接部位， 将细胞外基质与肌动蛋白细胞骨架 连接。据报道在自出生至成年发育小鼠的眼表， 整 合素 9 位于表皮、 结膜及角膜缘基底细胞 11。本 研究结果表明整合素 9 仅表达于角膜缘某些基底 部上皮细胞， 而非表达于角膜和角膜缘基底层以上 ·8101·中华眼科杂志 2005 年 11 月第 41 卷第 11 期 Chin J Ophthalmol， November 2005，Vol 41，No. 11 的上皮。整合素 9 的高表达可能提示角膜缘基底 细胞与细胞外基质的强连接， 故角膜缘对剪切力具 高抵抗性。 三、 角膜缘基底上皮细胞表达高水平的整合素 1、 EGFR、 角蛋白 19 及烯醇化酶 富含整合素 1 的人类表皮基底细胞比未分级 细胞具备更高的集落形成能力 11。鼠富含高水平 整合素 6 而低表达转铁蛋白受体 （CD71） 的表皮 角质细胞， 被称为 6briCD71dim细胞， 有报道称其具 有干细胞的特征 12。本研究表明较之角膜缘基底 层以上的细胞， 整合素 1 更强烈表达于基底细胞， 同时也表达于全部角膜上皮细胞。 有报道角膜缘基底上皮细胞表达 EGFR 水平较 表层细胞更高， 而分化成熟的细胞表达水平相对较 低 13。本研究支持此概念， 推断高水平的 EGFR 能 使这些细胞在发育和损伤后迅速地得到生长因子的 刺激而发生分裂。 中间丝细胞角蛋白家族成员 CK19， 曾被建议为 皮肤毛囊表皮干细胞的标记 14。本研究发现在角 膜缘基底上皮细胞 CK19 的表达强于基底上层细 胞， 同时也表达于全部角膜上皮细胞。胞质酵解酶 烯醇化酶 也被建议为角膜上皮细胞干细胞的标 记 15。本研究发现烯醇化酶 位于角膜缘基底上 皮和角膜基底上皮的胞质中。 四、 人角膜缘上皮细胞干细胞表型的应用 本研究表明角膜缘上皮细胞干细胞是有活性的 小原始细胞， p63、 ABCG2 及整合素 9 阳性， 且整合 素 1、 EGFR、 CK19 及烯醇化酶 相对高表达。该 表达方式可能代表了角膜缘基底层干细胞的独特表 型， 可以用于区分角膜缘基底层上皮细胞、 角膜缘及 角膜上皮细胞。其基因表达的解剖定位有助于研究 角膜上皮干细胞小龛和角膜缘局部环境因子， 如不 同类型的胶原、 细胞外基质蛋白或生长因子， 调节基 因表达。根据干细胞表型， 可通过黏附到型胶原 或其他高表达的整合素 （如 9 和 1） 的细胞外基 质上部分性实现分离或扩增角膜缘干细胞， 或经流 式细胞仪检测其他细胞表面标记如 ABCG2、 EGFR 等进行荧光活化细胞分类 （FACS） 。 参考文献 1Chen ZL，Murube J. 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