从大容量随机噬菌体抗体库筛选人源性抗酪氨酸酶相关蛋白1抗体.pdf

·3 8 8中国皮肤性病学杂志2 0 0 5 年7 月第1 9 卷第7 期 C h i n J D e r m V e n e r e o l , J u l . 2 0 0 5 , V o l . 1 9 , N o . 7 从大容量随机噬菌体抗体库筛选人源性抗酪氨酸酶 相关蛋白1 抗体 李 春英 ， 乔 媛媛 2 ， 王刚 ， 陈宇萍 ”， 高 天文 ， 王 攻， 摘要 目的 从大容量随机噬菌体抗体库中筛选人源性杭酪氨酸酶相关蛋白I ( T R P - 1 ) 单链抗体并进行鉴定 及基因刚序分析。方法以原核表达并纯化的T R P - 1 为抗原， 通过“ 吸附一 洗脱一 扩增” 过程从大容量随机噬菌体抗体库中 筛选特异性抗T R P - 1 蛋白的单链抗体， 分别通过E L I S A和基因测序的方法对其杭原结合活性和序列进行分析鉴定。结果 经过4 轮筛选， 获得 1 8 个能与T R P - 1 蛋白结合的阳性克隆， 其中3 个克隆的噬菌体抗体能与T R P - 1 特异性结合; 基因 测序分析表明， 所获抗体分别属于不同的抗体克隆。结论利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出高特异性的 人源性抗 T R P - 1 抗体。 关键词 酪氛酸酶相关蛋白1 ; 杭体， 单克隆 中图分类号I R 3 9 2 . 1 1 ; R 7 8 2 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 1 - 7 0 8 9 ( 2 0 0 5 ) 0 7 - 0 3 8 8 - 0 4 C l o n i n g o f H u m a n a n t i - T R P I A n t i b o d i e s F r o m a P h a g e A n t i b o d y L i b r a r y L I C h u n - y i n g , Q I A O Y u a n - y u a n , W A N G G a n g , e t a l ( D e p a r t m e n t o f D e r m a t o l o g y , X ij i n g H o s p i t a l , F o u t h M i l i t a r y M e d i c a l U n i v e r s i t y , X i ' a n 7 1 0 0 3 2 , C h i n a ) A b s t r a c t ; O b j e c t i v e T o c l o n e h u m a n p h a g e a n t ib o d i e s a g a i n s t T R P - 1 ( t y r o s i n a s e r e l a t e d p r o t e i n 1 ) f r o m a p h a g e a n t i - b o d y l i b r a ry . Me t h o d s P a n n i n g o f t h e p h a g e a n t i b o d y l i b r a ry a g a i n s t T R P - 1 a n t i g e n w a s c o n d u c t e d t o s e l e c t s p e c i f i c s i n g l e - c h a i n a n t i b o d i e s . T h e a n t i g e n b i n d i n g a c t i v i t y a n d t h e s p e c i f i c i t y o f t h e i s o l a t e d b i n d e r s w e r e d e t e r m i n e d w i t h E L I S A . R e s u l t s A f t e r 4 r o u n d s o f “ a d h e n s i o n - a m p l i f i c a t i o n - e l u t i o n “ p a n n i n g , 8 c l o n e s o f s c F v w h i c h c o u l d b i n d s p e c i f i c a l l y t o T R P - 1 w e r e o b t a i n e d . T h e g e n e s o f t h e m t h e n w e r e s e q u e n c e d a n d a n a l y z e d . C o n c l u s i o n I t i s f e a s i b l e t o i s o l a t e h u m a n a n t i - T R P - 1 p h a g e a n t i b o d i e s b y - p a s s i n g i m m u n i z a t i o n u s i n g p h a g e a n t i b o d y l i b r a ry . K e y w o r d s : T y r o s i n a s e r e l a t e d p r o t e i n I ; A n t i b o d y , m o n o c l o n a l 酪氨酸酶相关蛋白1 ( T R P - 1 ) 是第一个克隆成功 的色素基因， 是黑素细胞中含量最为丰富的糖蛋 白 ， 。以 往的 研究表明， T R P - 1 定位于黑素小体膜， 在黑素合成过程中发挥重要作用。近年来人们对 T R P - 1 的功能有了进一步的认识， 诸多实验结果支持 T R P 1 除了参与黑素代谢外， 还影响黑素细胞的生长 和死亡， 因而可能与白瘫风的发生有关。同时， T R P - 1 作为重要的黑素细胞分化抗原， 有可能成为黑素瘤生 物治疗中新的药物作用靶点。 笔者曾经成功地克隆了T R P - 1 基因， 表达并纯化 了T R P - 1 蛋白 。本研究尝试从该大容量随机噬菌 体抗体库中筛选抗 T R P - 1 人抗体， 不仅可以深化对 T R P - 1 功能意义的认识， 同时还可为白瘫风发病机理 和黑素瘤生物治疗的研究奠定基础。 基金项目 国家自 然科学基金( 3 0 3 0 0 3 0 7 ) 作者单位 1 第四军医大学西京医院皮肤科， 陕西西安 7 1 0 0 3 2 , * 博士后， 原工作单位同2 ; 2 解放军海军总医院中心实验科， 北京 1 0 0 0 3 7 作者简介 李春英( 1 9 7 5一) ， 女， 黑龙江省集贤县人， 讲师， 医学 博士， 主要从事色素性疾病及皮肤肿瘤的研究。 通讯作者 王刚: x j w g a n g f m m u . e d u . c n 1 材料和方法 1 . 1 材料 抗体库及其他主要试剂: 大容量随机噬菌 体抗体库为海军总医院中心实验室提供， 库容 l x l o ll ; 各种内切酶均为P r o m e g a 产品; 大肠杆菌菌株 T G I ， 辅助病毒V C S M 1 3 为本室保存; 纯化的T R P - 1 蛋 白 ( 2 0 0 W m l ) 、 人角 蛋白K 1 7 蛋白 由 本室制 备 3 0 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 抗角蛋白噬菌体抗体的筛选以T R P - 1 蛋白 为抗原， 稀释至5 R 梦m l ， 固相化至抗原管( I m m u n o - t u b e , N u n c ) ， 参照 文献 a 的 方法 对抗体 库进行4 轮“ 吸 附一 洗脱一 扩增” 筛选。每一轮筛选均测定次级库滴度 并计算噬菌体投人/ 产出比( 回收率) ， 作为特异性噬 菌体抗体富集的指标。 1 . 2 . 2 噬菌体抗体的制备及检测在筛选的最后一 轮， 从T Y E 盘中分3 批共挑取5 0 个单集落， 在2 x Y T 中培养， 用辅助病毒 V C S M 1 3 超感染诱导培养过夜后 收集上清为噬菌体抗体。以1 . 2 5 t 岁m l T R P - 1 蛋白 包被E L I S A板， 经 1 % B S A封闭后加人待测噬菌体抗 体上清( 1 : 1 稀释) ， 以H R P 一 羊抗 M 1 3 为二抗， 孵育、 洗涤后 O P D底物显色; 显色阳性的克隆再以人 T R P - 1 中国皮肤性病学杂志2 0 0 5 年7月第1 9 卷第7 期 C h i n J D e r m V e n e r e o l , J u l . 2 0 0 5 , V o l . 1 9 , N o . 7 ·3 8 9 · 蛋白、 人角蛋白K 1 7 , 噬菌体 M 1 3等为抗原同时包被 E L I S A板， 鉴定其抗原抗体反应的特异性。 1 . 2 . 3 抗体可变区基因的P C R扩增与分析 用碱裂 解法提取阳性克隆的质粒， 送公司进行基因序列测定， 测序结果以D N A M A N软件进行分析。 2 结果 2 . 1 抗T R P - 1 噬菌体抗体的筛选 经过4 轮筛选， 得 到噬菌体抗体回收率约1 0 0 0 倍富集。用最后一轮挑 取的5 0个单菌落制备噬菌体抗体， 经 E L I S A检测有 1 8 个显示与T R P - 1 的结合活性， 其中3 个与人角蛋白 K 1 7 、 噬菌体M 1 3 等无关抗原不结合， 具备特异性。表 1 为3 个克隆与各种抗原的E L I S A反应结果。 表1 噬菌体抗体与T R P - 1 蛋白 特异性结合的 E L I S A结果( A 4 9 0 , x 士 s ) 组别 克隆 1 克隆2 克隆3 对照 * TRP- 1 K1 7M1 3 0 . 1 8 2 10 . 0 1 0 0 . 2 4 3 1 0 . 0 0 7 0 . 2 3 4 10 . 0 0 4 0 . 0 2 3士 0 . 0 0 0 0 . 0 2 1 10 . 以碎 0 . 0 1 2士 0 . 0 0 0 0 . 0 0 9士 0 . 0 0 1 0. 0 0 2士0 . 0 0 1 0 . 0 3 0士0 . 0 0 2 0 . 0 0 7士0 . 0 0 0 0 . 0 0 6士 0 . 0 0 1 0 . 5 4 4 10 . 0 0 8 * 对照: 抗M 1 3 噬菌体抗体 2 . 2 可变区D N A序列测定对具有T R P - 1 蛋白特异 性结合活性的3 个克隆进行可变区基因序列测定。结 果表明克隆1 , 3 重链均属于人I g G第三亚群， 克隆2 重链为第一亚群; 轻链为 K 链， 均属第一亚群。各克 隆的轻、 重链可变区基因序列见图t o 克隆 1: VH C A GG T G C AG C T G G T GC A G T C T GG GG GAG GC C T GG T C - A A G C C T G G G G G G T C C C T G A G A C T C T C C T G T G C A G C C - T C T G G A TT C A C C TT C A G T A G C T A T A G C A T G G A C T G G G - T C C G C C AGGC T C C AGG G AAGG GGC T GG AG T G GG T C T - C A T C C A TT A GT AG T AG T GG T AC TT AC A T A T AC T AC GC - AG AC T C AG T GAA GGG C C G A TT C AC C A T C T C C AG AG A- C A A C G C C A AG A AC T C A C T G T A T C T G C A A A T G A A C AG- C C T G C G AG C C G AGG AC AC G GC T G T G T A TT AC T G T GC - G A G A G C G G G C C G T A A A G G A A G C T C G G C C G G A A G A T - TT G AC T AC T G GGG C C AGG GA AC C C T G G T C VK A T G T A T AC T GG T AC C AG C AG C T C C C AG G AAC GG C C C - C C A AAC T C C T C A T C T AT AGG AA T A AT C AG C G GC C C T C - AGG GG T C C C T G AC C G A TT C T C T GGC T C C AAG T C T GG C - AC C T C AGC C T C C C T G GC C AT C AG T GG GC T C C GG T C C G- AG G A T GA GGC T G ATT A TT AC T G T G C AGC AT G GG A T G- AC AG C C T AAA T GG TT A T G T C TT C GG A AC T G GG AC C A- AG C T G AC C G T C C T AG G T 克隆2: VH G AGG T GC AG C T G TT GG AG T C T GGG GC T G AG G T G AAG- AA GC C T GG GG C C T C AG T G AAG G T C T C C T GC G AG GC TT - C T G G A T AC A C C TT C A C C G G C T A C T A T A T G C A C T G G G G - T GC G AC AGG C C C C T G G AC AAG GG C TT G AG T GG G AT G- GG A T G GA T C AA C C C T A A C AG T G G T G GC AC AAA C T A T - G C A C A G A AG TT T C A G G G C A G G G T C AC C A T G A C C A G G - G AC AC G T C C A T C A GC AC AGC C T AC A T GG AG C T G AGC - AG GC T G AGA T C T GAC GA C A C G GC C G T G T A TT A C T GT - GC G AG AG GC C G GA GGA T AGC AG C AGC T G G T A C GG G- T I ' I TG A C T AC T G G G G C C A G G G A A C C C T G G T C A C T G T - C T C TT C AG C T AG C G VK A T GC C C AG T C T G C C C T G AC T C AGC C AC C C T C AG C GT C - T GG G AC C C C C G G GC AG AGG G T C AC C A T C T C TT G T T C T - GG AA GC AG C T C C A AC A T C GG A AG T C A TT A T G T AT AC T - GG T AC C AG C AG C T C C C AG GA AC GG C C C C C AA AC T C C - T C A T C T A T A G G A A T A A T C A G C G G C C C T C AG G G G T C C C - T G AC C G A TT C T C T GG C T C C AAG TT GG C C AC C T C AG C C - T C C C T G GC C A T C AG T G GG C T C C G G T C C GA GG A T G AG- G C T G A TT A TT A C T G T G C A G C A T G G G A T G A C AG C C T G A- G TT GG TT G GG T G TT C GG C G G AG GG AC C A AGC T G AC C - G T C C T AG G T 克隆3 : VH GA GG C C C AG C T GG T AC AG T C T GG GG GA GGC TT GG T A- C A G C C T G G G G G G T C C C T G AG AC T C T C C T G T G C A G C C T - C T G G A TT C A C C T TT A G C A G C T A T G C C A T G A G C T G G G T - C C G C C AGGC T C C AG GG AAGG GGC T G G AG T GG G T C T C - AG C T A TT AG T GG T AG T G G T G G T AG C AC A T AC T AC GC A- G A C T C C G T G A A G G G C C G G TT C A C C A T C T C C A G A G A C - A A TT C C A A G A A C AC G C T G T A T C T G C A A A T G A A C A G C - C T GA GA GC C G AG GA C AC G GC C A T AT A TT AC T G T G C G- AA AG C AC G T A T AGC AGC AGC T GG T AC C G A T G C T T TT G- AT A T C T GG GGC C AAG GG AC A AT G G T C AC T G T C T C TT C VK A T G A T G T AC AG T GG T AC C AGC AGC TT C C AGG A AC AC - G T C C C AA AC T C C T C A T C T A T G C T A AC AAC A A T C G G C C - C T C AGG GG T C C C T G AC C G A TT C T C T GG C T C C AAG T C T - GG C AC C T C AGC C T C C C T G GC C A T C AC T GG GC T C C AG G- C T G A G G A T G A G G C T G A TT A TT A C T G C C A G T C C T A T G A- C AGC AGC C T G AG T G C TT A T G T C TT C G G A AC T GG G AC C - A AGC T G AC C G TT C T AG G T 图1 人抗T R P - 1 噬菌体抗体的轻、 重链序列 ( 下划线部分为 C D R区) ·3 9 0 ·中国皮肤性病学杂志2 0 0 5 年7 月第 1 9 卷第7 期 C h i n J D e r m V e n e r e o l , J u l . 2 0 0 5 , V o l . 1 9 , N o . 7 3 讨论 T R P 一 1 是第一个克隆成功的色素基因， 由于该蛋 白与酪氨酸酶有同源性， 因而被称为酪氨酸酶相关蛋 白1 。多年来人们对T R P - 1 的功能一直有争议， 诸多 的研究发现T R P - 1 除了参与色素代谢以外， 还参与黑 素形成过程中系统毒性物质的清除， 与黑素细胞的变 性和 死亡相关4 1 。 此外， 在白 瘫风和黑素瘤患者体内 均存在抗 T R P - 1的免疫反应， 因此制备 T R P - 1 人抗 体， 深人研究T R P - 1 的功能对于明确白瘫风的发病机 理及探讨黑素瘤的治疗有重要意义。 传统的杂交瘤技术是制备单克隆抗体的常规手 段， 但由于所制备的单抗都是鼠源性的， 因而限制了其 作为治疗性抗体在人体的使用， 而对于一些免疫原性 较低的物质则很难制备单克隆抗体。抗体库技术通过 将全套抗体基因展示在噬菌体表面， 利用其表面呈现 的特点可以方便地利用不同抗原分别筛选相应的人源 性抗体， 是一种制备人源性单抗的快捷有效手段， 尤其 是大容量、 具有良好多样性的抗体库， 在得到高亲和力 抗体以及进行抗体性能改造方面具有较强的优势 。 笔者已经利用抗体库技术成功筛选了多株抗角蛋白等 抗原的 抗体， 证明该技术具有很好的可行性 6 1 。为了 制备人源性抗T R P - 1 抗体， 笔者利用先前克隆表达的 T R P - 1 抗原对大容量随机噬菌体抗体库进行了筛选， 经4 轮“ 吸附一 洗脱一 扩增” 筛选和一系列鉴定， 得到 了3 个克隆能与T R P - 1 蛋白特异性结合的噬菌体抗 体。可变区基因序列分析表明， 3 个抗体的重链分别 属于人I g G第1 , 3 亚群， 轻链为K 链， 均属第1 亚群。 该抗体的成功制备为进一步探讨T R P - 1 分子的 功能意义、 揭示黑素细胞及黑素代谢的生理机制提供 了方便， 同时也为白瘫风发病机理和黑素瘤的生物治 疗等研究奠定了基础。 参考文献 1 V ij a y a s a r a d h i S , D o s k o c h P M , H o u g h t o n A N . B i o s y n t h e s i s a n d in t r a c e l - l u l a r m o v e m e n t o f t h e m e l a n o s o m a l m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n g p 7 5 ， t h e h u m a n b( b r o w n ) l o c u s p r o d u c t J . E x p C e l l R e s , 1 9 9 1 , 1 9 6 ( 2 ) : 2 3 3 一2 4 0 . 2 H o u g h t o n A N . C a n c e r a n t i g e n s : i m m u n e r e c o g n i t i o n o f s e l f a n d a l t e r e d s e lf J . J E x p M e d , 1 9 9 4 , 1 8 0 : 1 一 4 . 3 李春英， 高天文， 刘玉峰. 酪氨酸酶相关蛋白1 的克隆表达及纯化 J . 中国皮肤性病学杂志， 2 0 0 1 , 1 5 ( 6 ) : 3 6 8 - 3 7 0 . 4 J i m b o w K , C h e n H , P a r k J S , e t a l . I n c r e a s e d s e n s i t i v i t y o f m e l a n o c y t e s t o o x i d a t i v e s t r e s s a n d a b n o r m a l e x p r e s s i o n o f t y r o s i n a s e - r e l a t e d p ro t e i n i n v it il i g o J . B r J D e r m a t o l , 2 0 0 1 , 1 4 4 : 5 5 一 6 5 . 5 W i l l a t s W G . P h a g e d i s p l a y : p r a c t i c a l it ie s a n d p r o s p e c t s J . P l a n t M o l B i o l , 2 0 0 2 , 5 0 ( 6 ) : 8 3 7一 8 5 4 . 6 王刚， 刘玉峰， 王淡， 等. 高亲和力抗角蛋白人抗体的基因工程制备 J . 中华皮肤科杂志， 2 0 0 3 , 3 6 ( 1 0 ) : 5 5 9 一 5 6 1 . f 收稿日期 2 0 0 5 -01 - 1 8 修回日期 2 0 0 5 - 0 4 - 1 5 · 短篇 · 维生素B 1 2 治疗顽固性神经性皮炎 3 6 例疗效观察 石海兰 ， 吕中法 “ 1 临床资料 1 . 1 人选标准年龄2 4 - 6 6 岁; 性别不限; 神经性皮炎病程 超过1 年; 有多处皮损呈慢性苔鲜样变; 无严重心、 肺、 肾、 胃等 器官及系统疾病; 无心绞痛史， 无碘过敏史。 1 . 2 一般资料2 0 0 2 年4 月一 2 0 0 3 年1 2 月本科门诊， 共入选 7 6 例患者。治疗组: 男1 2 例， 女2 4 例， 平均( 3 6 . 8 士 0 . 5 ) 岁; 病 程( 3 8 . 9 1 1 1 . 2 ) 月; 对照组: 男 1 4 例， 女2 6 例， 平均( 3 7 . 2 1 0 . 4 岁) ， 病程( 3 6 . 4 士 5 . 6 ) 月。两组经统计学分析无差异。 1 . 3 治疗方法 治疗组肌注维生素B iz 注射液0 . 5 m g / d ; 对照 组口服西替利嗓片1 0 m 岁d ， 外用艾洛松乳膏 1 次/ d 。两组均 连续用药巧天。 1 . 4 疗效判定标准痊愈为痛痒、 皮损全部消退; 显效为轻度 痒感， 皮损消退6 0 %以上; 进步为疹痒、 皮损消退3 0 %以上; 无 效为痉痒减轻不明显、 皮损消退不足3 0 %。对痊愈者随访半 年， 观察其复发情况。 2 结果见表 t o 表 1 两组临床疗效比较例( %) 组别例数痊愈显效进步无效复发 有效率 % 复发率 % 1.16 目12 5l2 9口0八 l27 60 飞J4 治疗组 对照组 8 3 . 3 6 2. 5 8 . 3 8 5. 7 两 组 有效 率 经统 计学 处 理( X 2 = 0 . 4 1 , P 0 . 0 5 ) ， 差异 无显 著 性; 两 组复 发率比 较差异有显著性( X ， 二 4 . 8 8 , P 0 . 0 1 ) 0 不良 反应: 治疗组仅有1 例发生皮肤痰痒， 伴有抓后皮肤潮红， 停药后2 一 3 天消失。对照组均有程度不同的嗜睡、 头晕， 但不 影响治疗。 3 讨论 本组应用维生素B 12 治疗神经性皮炎获得较好的疗 效和较低的复发率， 说明神经营养不足可能引起神经末梢敏感 性增高( 即接受刺激的IA值降低) ， 从而导致持久性潜在疹痒和 “ 痒觉兴奋过度” 。 维生素B 12 通过营养神经， 降低其敏感性， 抑 制疹痒的产生， 间接抑制了表皮细胞的增生性反应， 使苔鲜样 变渐消失。值得临床应用。 【 中图分类号 R 7 5 8 . 3 2 文献标识码I B 文章编号 1 0 0 1 一 7 0 8 9 ( 2 0 0 5 ) 0 7 一 0 3 9 0 一 1 A 收稿日期 2 0 0 5 -0 3 - 1 0 修回日 期 2 0 0 5 -0 4 - 2 8 作者单位 1浙江中医学院附属新华医院皮肤科 3 1 0 0 0 5 ; 2浙江大学第二附属医院皮肤科， 浙江杭州 ， 浙江 杭州 3 1 0 0 0 9