促红细胞生成素对缺氧乳鼠心肌细胞凋亡及坏死的影响.pdf

中国临床 保健杂志 2 008 年4 月第1 1 卷第2 期 c 枯 n j c u n H e 日 t 玩， A p d l Z oos ， v ol . 1 1 ， N o . 2 ·1 8 1· 基 础研 究 促红细胞生成素对缺氧乳鼠心肌细胞凋亡 及坏死的影响 朱 兵” ， 秦宇 红，“ ， 杨雪 。 ， 赵宝 成 2 ( 1 . 解放军总医院， a 南楼临床部心血管二科， b心内科， 。 南楼临床部保健科， 北京 1 008 53; 2 ， 解放军总政机关门诊部) 摘要1 目的 观察促红细胞生成素( E PO) 对对缺氧心肌细胞的保护效应及量效关系。方法将当日 生乳鼠， 局部碘酒酒精消毒后胸骨正中开胸， 取心尖前1 /2 心室肌进行细胞培养。培养4d 后选择细胞生长 情况良 好的 培养瓶( 1 0 6 个细胞 / 瓶) 分为3 组: A ， 对照组， 正常培养; B ， 缺氧组， 缺氧1 丫复氧12h ; C ， E P O 组， 缺氧 / 复氧加E P O干预。E P O组根据不同E Po 干预浓度又分为C l ， E PO 千预浓度0 . I I U/nil; CZ， E P o浓 度I I U/d; C3， E P O干预浓度10 I U/d。然后以 荧光染色一 流式细胞仪检测缺氧 / 复氧后心肌细胞的凋亡及 坏死情况。结果缺氧组细胞的凋亡、 坏死比率分别为( 20. 78土 2 . 98) %和( 50. 10土 0 . 29) %， 明显高于E P O 各组( P均小于0 . 01) ， 也明显高于对照 组【 ( 2 . 3 土 1 . 00) %和( 1 . 5 土 0 . 4 8)%， 尸 10 6 个细胞 / 瓶) 进行分 组、 干预。干预前所有样本用含 1 %小牛血清 D E M E培养液培养过夜， 使细胞生长期统一至 GO 期， 然后分为3 组: 对照组( A ， 正常培养) 、 缺氧组 ( B ， 缺氧Zh/复氧1 2h ) 、 E P O组( C ， 缺氧Zh/复氧 12h 加E P O干预) ; E Po 组又根据E P O干预浓度不 同分 为 C I( 0 .II U / M L ) 、 C Z( II U / m l ) 、 C 3 ( 10IU/ m l ) 。每组各4 瓶细胞。同时接种24孔培养 板至长满， 也按以上分组干预。缺氧组: 换预先用 C O Z 充气置 换过的 无血清D E M E 培养液， 培养瓶内 也 用C O ， 气体充人置换其中的空气， 密封后37孵育; Z h 后换含 10%小牛血清D E M E培养液正常条件下 ( 95%空气+ 5 %C O : ) 孵育。E P O 组: 缺氧 / 复氧处理 同上， 同时加人 E P O ， 使培养液中药物终浓度达 I I U/耐( 加药容积感总培养液的0 . 5 %) 。对照组不 进行缺氧/ 复氧及用药处理， 滴等量生理盐水。 1 . 2 . 3 细胞凋亡及坏死检测缺氧2丫复氧 12h 末， 以0 .25%胰蛋白酶消化悬浮细胞， 用 A nnexin V 一 Pl染色， 流式细胞仪检测细胞凋亡。每样本计数 至 少ro ， 个细胞。数据采集后传送至A PPl e G3 电 脑， 最终由C e l l Q u e s t 软件( B e c t o nD i c k i n s o n 公司产 品) 处理。 4 ， 6 一 联眯一苯基叫噪( D A PI) 及结晶紫染色: 缺 氧/ 复氧完毕， 先换用含40 n 留ml D A PI的培养基 l h ， 然后倒去培养基， 用 P B S 清洗耳恭听贴壁细胞 6次， 在荧光显微镜下观察; P B S 清洗， 再加入结晶 紫工作液染色10 m in， 在倒置显微镜下观察拍片。 1 . 3 统计学处理实验数据由C HISS 统计软件统 计， 实验结果均以( 牙 士 ， ) 表示， 组间比较采用两因素 定量资料的方差分析， 但由于此资料组间方差不齐， 用秩和检验代替。 2 结果 2 . 1 细胞培养培养的第二代心室肌细胞多呈长 方型或多边型， 大部分细胞呈现有节律地自主性 搏动。D M E M含血清培养基在经过 C O : 预先充气 1 2 h 后， 测氧分压 2 6m m H g ，二氧化碳分压 3 0 5 m mH g ， p H值为56 3 。 2 . 2 各组细胞在缺氧2扮复氧12h 后行流式细胞 仪凋亡检测 见表1 。 表1 各实验组细胞存活、 凋亡、 坏死百分比( 牙 士 : ， % 组别存活细胞 9 2 . 7 8士33 5 1 3 . 3 4土3 . 2 0 a 早期凋亡细胞 50421816 对照组 缺氧组 E P01 组 E P 0 2 组 E P 0 3 组 . 1 8 士 74 9 . 5 6 士 6 . 3 7 血 2 . 3士1 . 09 2 0 . 7 8 士 4 . 9 8 三 1 3 . 7 8 士 3 ， 7 4 . 8 . 4 1 士 2 . 5 2 耐 . 5 6 士 1 1 . 3 2 掀1 03 7 士 4 . 6 3 曲 坏死细胞 1 . 5士 0 . 4 8 . 1 0士 72 9 a . 5 1 土 5 . 4 9 . . 5 6 士 4 . 5 6 山 8 5 士 63 3 血 如6562 注: 对照组( 正常培养) 、 缺氧组( 缺氧2 拟复氧12h)、 E P O 组( 缺氧Z h/复氧1 2 h 加E PO 干预) ; E P O 组又根据E P O干 预浓度不同分为E P 0 1 ( 0 . 1 1 U/M L ) 、 E P 0 2 ( I I U/耐) 、 E P 0 3 ( 10l u/nil) 。 与 对 照 组比 较， “ 尸 0 . 01; 与 缺 氧 组比 较， b p 0 . 0 1 ; 与E p o l 组比 较， “ 尸 0 . 0 1 ， d 尸 0 ， 05 2 . 3 缺氧2 扮复氧12h 后行D A PI及结晶紫染色 显示 对照组细胞的细胞核保持完整， 绝大部分细 胞整体形态正常; 缺氧组则可见部分细胞胞核呈碎 裂或凝固成小体， 成片细胞整体结构破坏， 胞浆内容 万方数据 中国临床保健杂志 2 (X8 年4 月第1 1 卷第2 期C h j n J C l i nH 翻the ， A p ri 1 2 (X)8 . v ol . 1 1 。 N O . 2 ·1 8 3· 消失， 只剩下细胞骨架结构; E Po 干预组所见情况 介于以上二者之间。 3 讨论 在动物试验中证实了E Po 对体外培养的哺乳 动 物心肌细胞具有抗凋亡为主的 保护效应 ， 。并 且E Po 能抑制心肌细胞凋亡关键效应酶casP as e -3 的活化 4 。 本研究中发现， 不同浓度的E PO 对缺 氧一 复氧的心肌细胞均有保护作用， 在。 ， I IU / ml浓 度下已显著减少了细胞凋亡; 而且随E P O浓度增加 到I I U/rnl 时， 保护作用进一步加大， 但E Po 浓度增 到10 I U/d时， 保护作用不再增加。而且 E PO 不仅 对于凋亡， 对于坏死同样具有保护作用。本研究中 应用C O : 代替氮气进行培养基内空气置换制造缺 氧模型， 不仅模拟了缺氧环境， 还增加了酸中毒的环 境， 更接近于在体的缺氧的条件， 因此大量细胞死 亡， 但E Po 同比例减少了细胞的坏死。 关于E P O心肌保护作用信号转导机制的研究 发现， E P O可以作用于心肌细胞后激活 PI 3 称 A ki 通路， 且该通路与E Po 的抗心肌细胞凋亡作用有 关 ” 。 PI 3 份A kt可 能 通 过 其 下 游 多 种 信 号 机 制 产 生心肌 保护作用。以 往研究 ” 发现， E Po 可能通过 心肌细胞表面特异性 E P O的受体发挥对心肌细胞 的作用， 本研究发现E Po 细胞保护作用存在的浓度 梯度相关性及饱和现象进一步提示了这种可能性。 参考文献 1 。 y e u x 一 F a u reM ， C 司in 一 凡 b u o t D ， R i b u otC . Eryt h r o poi e - t i n an d 卿oc aldi 以vrot e c ti o n : what 。 n e w J . F u n d am C l i nPharm a c o 】 ， 2 0 0 5 ， 1 9( 4 ) : 4 3 9 礴 4 6 . 2 C h a t t e 巧 e e p K . Pl e i otro p i c re nal a c t i on s ofe 叮 th ro Poi e t i n J . l a ” c e t ， 2 005 ， 3 6 5 ( 9 4 7 4 ) : 1 5 9 0 一 1 5 9 2 . 3 黄树其， 邵福源. 促红细胞生成素对血管性痴呆大鼠 认知功能的影响 J . 医学临床研究， 2 以 巧 ， 23( 5 ) : 65 3 石5 5 . 4 B ahllnann F H ， Son g R ， B oe h mS M， atal. 1 O w . d o s e th e r- 即y witht h e fo n g 一 ac t i n g e 尔h ro Poi e t i n analo即e d a r be阶 et i n al P h a pe岛 i s t ent l y 即 t l v a l e s e n d o t h el i alA k t a n d atte n - uate s p ro 脚s s i v e orsanfa i lu re J . C i rc ul a ti o n ， 2 0( 抖， 1 1 0 ( 8 ) : 1 仪 拓 一 1 0 1 2 . 5 阮 环 记 esB ， M a io R ， P i n t o R ， e t al . R e c o m b i n ant h u m an e ry t h 印 poi e t i nP r o t e c tsth eli v er fi 勺 mh ePat i ci s c h e m i a - 二 那 rfus ioninj 叮 i nth e rat J . Trans p l l n t ， 2 以 巧， 1 9 ( 1 1 ) : 9 1 9 一 2 6 . 6 x u B ， n o n g G H ， “ u H ， e t al . Rec o 汕i nant h u m ane ryth - “ poie ti np re t re at m e n t atte n u a t e s m y OCa rd i ali 川 ra r c t s i z e : a p 0 s s i b l e m ech ani s mi n vol ves h e ats h ockP ro t e i n 7 0田 l d 川 橄 e n u a t ion ofn u c l e ar俪tor- k 即p a B J . A nn C l i n肠b Sci ， 2 (X)5 ， 3 5 ( 2 ) : 1 6 1 一 1 6 8 . 7 M i k i T ， M i u raT ， Y an o T ， etal A l l e rati oni n e ryth ro 画e - t i n 一 i n duc ed c a 川 1 叩rotect i ve s i gnal i n g场 即s t i lif 七 c t v e n- tri c u l arre m ode l i n g J . J PharmacolE x p The r ， 2 以 拓， 3 1 7 ( 1 ) : 6 8 一 5 . 8 T r amo n tano A F ， M u n i y a p p a R ， B l ac k A D ， e t 公. E 叮 th 价 画et i np r o t e c tsc ar d i ac m y ocyt e sf m h y 户 x i a 一 i n d u c e d a 即 p tos i s th roughanA k t 一 d e 件 n d e n t p a lh w a y 【 J . B i oc h em B I Oph y s Res C ommun ， 2 0 0 3 ， 3 08( 4 ) : 9 9()口 994 . 9 A m m a r 邵 】 e ll atF ， ll ov e raM ， Kel lyPA ， etal . 助wd o s e s of E P 0a c t i v a t eMA Pk i n as韶 b u t n 0 I J A K 2 2 S T A 巧 i nrat vasc u l ars l l l 0 0 t hm u s c l ec e l l s J . B i oc 玩mB i 叩h ”R e s C omm u n ， 2 (X)1 ， 2 84 ( 4 ) : 1 0 3 1 一 1 0 3 8 . 1 0 M oo n C ， K rawc 叮 k M ， 从n D ， 。 t al. E Iyth r 0 p 0 le t i n re - d u c esmyocardi ali n fa r c t i o n and le ftven t ri c u l arfu n c ti o n - ald e c l i n e afte r c o o n a ryarte 叮l igationi n rats J . p roc N a t l A c ad sci U S A ， 2 0 0 3 ， 1 伪 ( 2 0 ) : 1 1 6 1 2 一 1 1 6 1 7 . 川U p s i c E ， v and e r M e e r P ， H e nni n g R H ， e t al . T i m i n g of e ry t h 印 poi e t i n t re a t m e nifo r c ardi o P rote c t i o n i n i s c h e m i a/ re Perfusi o n 【 J . J C ardi ov as c Pharmacol ， 2 以 抖， 科 ( 4 ) : 4 7 3 礴7 9 . 1 2 x u B ， D on g G H ， L iu H ， e t al . R e com bi n an t h u m ane ryth - 功 脚i e ti n P 此 t r e at m e n t at t e n u ates m y oca ld l ali l 血r c t s i ze: a pos s i b lem ech ani s mi n vOlv esh e a t s h ock P r o tein 7 0 a n d at te n u a t ionofn u c l e arfaCto r- k a p P a B J . A n nC l i n l 刀 面 Sci ， 2 的5 ， 3 5( 2 ) : 1 6 1 一 1 6 8 . 1 3 C al v i l l o L ， 细1 址R ， K aj s t u r a J ， etal . Rec o 几 由 i ll a n t h 山 n 曲 e ryth r o poi et in P n 成 e c t sth emyoca r d i u m f 勺 m i sc he而a- re pe而s i on i nj u ry a n dp romo t es be1 1 e fi ci al re m 记 el i ng 【 J. R 佣N a d A c adsci U sA， 2 003 ， 1 00( 8): 4 8 0 2 4 8 肠. 1 4 T ra m on t ano A F ， M u n i y a p p a R ， B l a c k D ， etal . E ryth ro- poi e t i nP ro te c tsc a r d i ac m y ocyt e sfr o mh y p O x l a 一 i ndu o ed a 即p t os i s t h ro u gh an A k t 一 d e p e n den t 稗t h w 叮 J . B i o- c h e mB i o P l l y s R e s C omm u n ， 2 0 0 3 ， 3 0 8 ( 4 ) : 卯0 一 94. 1 5 S h 哪le s 曰， Thie merma 皿 C ， Y a q oo bM M . N o v el叩 - p l i c at io n 。 ofre c o m b i n ant e 口 th m poie t i n J . C urr o p i n Pharm a c ol， 2 0( 拓， 6 ( 2 ) : 1 8 4 一 1 8 9 . 1 6 B o g o y e v lte hM A . n u 冈ate o nth ec ardi ace ffec tsof e ryth o p o i e t i n c ardi o p ro t e c t i on 妙 e ryth ro poi e t i nan dth e l e s s o n 。 l e amt fl 习 mstud ie s i n n e u r o p rote c t io n J . c ald- i o v as c R e 。 ， 2 (X 抖， 6 3( 2 ) : 2 0 8 一 1 6 . 1 7 w 行 gh t 以， H an lon p ， A m i n K ， etal . E ryth ro p 0 le t in 份 c e P t o r e x P re s s i on i n adult rat c a 记 1 0 衅oc ytes i s as soci a t - ed 雨 than ac u t e c a rd i o nrot ec t i ve e ffec t for reco m b i n ant e ryth r o po i e t ind u 鸣 i s c h emi a · re 件rfus i o ni nj u 叮 J l · FAS E BJ ， 2 (X 抖， 1 8 ( 9 ) : 1 0 3 1 一 1 033 . ( 收稿 日 期: 2 0 0 7 习 2 一 1 8) 万方数据