养阴药物血清对内毒素诱导血管内皮细胞凋亡的影响.pdf
第2 3 卷第1 期 2 005年 1月 B E药学刊 OF T R A DIT I O N A L C H IN E S E V o l . 2 3 N o . 1 J a n. ， 20 05 文章编号: 1 0 0 9 一 5 2 7 6 ( 2 0 0 5 ) 0 1 一 0 0 4 1 一 0 2 养阴药物血清对内毒素诱导血管内皮细胞凋亡的影响 朱平， 龚婕宁， 许冬青， 杨进 ( 南京中医 药大学， 江苏 南京 2 1 0 0 2 9 ) 摘要: 目 的: 研究养阴药物血清对内毒素诱导的血管内皮细胞凋亡的影响。方法: 用低浓度 US诱导 E C V 3 o 4 凋 亡， 用中药 血清与 之作用， 米用 流式细 胞仅检浏细胞凋 亡。结果: 养阴药 物血清可以明显抑制血管内 皮的凋 亡。同模型组比较有统计学意义。结论: 养阴药物血清可明显拮杭内毒素诱导的血管内皮细胞的凋亡。 关键词: 血清药理学; 内 毒素; E C V 3 o 4 ; 细胞凋 亡 中图分类号: R一 3 3文献标识码: A 血管内皮细胞是血管壁和血液之间的分界细胞。近 年来研究发现: 血管内皮细胞的凋亡和血管病变的发生 有密切的关系。 研究表明: 动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s , A S ) 是动脉 壁对各种损害的炎症一增殖性反应。血管内皮细胞 ( v a s c u l a r e n d o t h e li a l c e ll , V E C ) 激活是血管炎症的始动阶 段， 在A S 发病中可能起着重要作用。大肠杆菌内毒素 ( L P S ) 是经典的炎症刺激物， 能导致 V E C的损伤， 此种 损伤以细胞凋亡的形式出现 i l 。用L P S 来诱导血管内 皮细胞的凋亡， 同时用中药血清与之作用， 运用流式细胞 术来观察细胞的凋亡， 以探讨养阴药物及其不同配伍治 疗血栓性疾病的作用机理。 1 含药血清的制备 1 . 1 药物及组方 药物购自 南京市药材公司， 经本校中 药鉴定教研室鉴定为正品， 符合实验要求。 药物按照以下方案组方， 养阴方: 生地 1 2 g ， 玄参 1 5 g ， 麦冬1 2 g 。 养阴活血方: 上方加丹参1 2 g ; 养阴益气 方: 养阴方加生晒参1 2 g ; 全方: 养阴方加丹参1 2 g ， 生晒 参 1 2 g . 以上药物依照常法煎煮， 在 6 0 恒温条件下， 浓缩 成每毫升药液含生药l g 的浓缩液， 以0 . 1 M P a 的压力， 高温灭菌后， 置于4 冰箱备用。 1 . 2 动物 S D大鼠， 雌雄不拘， 体重( 2 5 0 1 2 0 ) g ( 南京 中医药大学动物实验中心提供) ， 动物许可证号二 S C X K ( 苏) 2 0 0 2 一 0 0 1 2 。一、 1 . 3 动物 血清的 制备 5 ( 即人每日临床用量x 按 界 人 每 日 鳞用 最 0 .0 18 x . 动物蜂效面积系数 x 恤清稀释 中医药 度) 的 标 准 浓 度给 大鼠 灌胃 ( 清 热 解 毒 组8 . 8 9 7 zn L / K g 分 2 次进行) 。连续灌胃3 夭， 正常对照组灌温开水。于末 次灌胃 后1 h 后( 灌药前禁食不禁水 1 2 h ) 无菌条件下顶 动脉取血， 1 7 0 0 以 m i n , 1 5 m i n 离心分离血清， 然后 5 6 U 3 0 m i n 水浴灭活， 在超净台上用0 . 4 5 p M的微孔滤膜过 滤除菌， 置于一 2 0 冰箱保存。 4 1 学刊 收稿8期: 2 0 0 4 一 0 6 一 2 3 基金项目: 国家自 然科学基金资助项目 ( 3 0 2 7 1 5 7 7 ) 作者筒介: 朱平( 1 9 7 6 一 ) ， 男， 陕西汉中人， 2 0 0 2 级博士研究生， 主要从事温病治法机理方面的研究。 2 实验材料 试剂及仅琴 人脐静脉血管内皮细胞( E C V 3 0 4 . 购自 中国 科学院典型培养物保藏委员会) ， R P M I 一 1 6 4 0 培养 基( G I B C O , U S A ) , 胰蛋白酶( T y p r i n , 1 : 2 5 0 , A m e r s o , U S A ) ， 小牛血清( 杭州四季青) , 6 孔细胞培养板( C o s t a r , D e n m a r k ) , 5 % C q 培养箱( N A P C O , U S A ) ， 倒置相差显 微 镜( O l y m p u s , J a p a n ) ， 大肠杆菌内毒素( L P S , 0 1 2 7 B s , S ig m a , U S A , L o t : 2 8 1 1 4 0 4 2 ) ， 无水乙 醇( 分析纯， 上海振兴 化学试剂厂， 批号: 2 0 0 2 1 2 0 0 3 6 5 ) , P I ( S ig m a 产品) ， 流式 细胞仪( F A C S C a l ib u r , B D , U S A ) . 3 实验方法 3 . 1 造模方法 将生长良 好的E C V 3,用0 . 2 5 % 的 胰蛋 白酶消化， 轻轻吹打， 制成细胞悬液， 调整细胞浓度为5 x 1 0 6 / m L ， 接种于6 孔板中。待细胞长满后( 约2 4 h ) ， 弃 去上清液。 将呈对数生长期的血管内皮细胞分为8 组， 即: ( 1 ) 正常组， 加含巧%小牛血清的培养基; ( 2 ) 正常鼠血清 组， 加含 1 5 %正常大鼠血清的培养基; ( 3 ) 模型A组， 加 L P S ( 终浓度为5 K g / m L ， 下同) 、 含1 5 % 小牛血清的培养 基; ( 4 ) 模型B 组， L P S 、 含 1 5 %正常大鼠血清的培养基; ( 5 ) 养阴组， L P S 、 含1 5 %养阴药物血清的培养基; ( 6 ) 养 阴活血组， L P S 、 含1 5 %养阴活血药物血清的培养基; ( 7 ) 养阴益气组， L P S 、 含 1 5 %养阴益气药物血清的培养基; ( 8 ) 全 方 组 ， L P S 、 含1 5 % 全 方 药 物 血 清 的 培 养 基; 每 组3 孔。 操 作完 成后， 置于3 7 r- , 5 % -C 0 2 饱 和湿度的培养箱 中 培养2 4 4h , 每隔6 h 用倒置相差显徽镜观察。 3 . 2 细胞的收集及处理待细胞造模2 4 h 后， 弃上清 液。在倒置显徽镜下用0 . 2 5 %的胰蛋白酶消化， 看到大 多数细胞变画时， 迅速吸出胰酶， 加入适量P B S 轻轻吹 打， 使之分散成单细胞悬液， 收集于洁净的离心管中， 以 1 0 0 0 r / m i n 离心 1 0 m i n 后， 迅速弃去上清液。再加入适 量P B S ， 吹打， 用3 0 0目的尼龙网过滤， 收集滤液， 仍以 1 0 0 0 r / m i n 离心1 0 m i n 后， 弃上清液。加入适量 P B S ， 吹 打。 将一 2 0 保存的7 5 %乙醇溶液缓缓滴入细胞悬液 中， 边滴入， 边振荡。细胞固定好后， 置于一 2 0 冰箱中 保存待测。 万方数据 中医药学刊2 0 0 5 年第2 3 卷 3 . 3 流式细胞仪的检测将冷藏的细胞液取出， 以 1 0 0 0 r / m i n 离心 1 0 m i n ， 用 P B S洗涤 2次， 再 3 0 0目的尼 龙网过滤， 加入R N A酶， 适量P I 染液， 避光染色3 0 m i n , 流式细胞仪检测。 4 结果 见表 1 。采用S P S S 软件分析。 表 1 养阴药物血清对 L P S 诱导的血管 内皮细胞凋亡的影响( %) 凋亡率G O / G l S G 2 / M 正常组 正常鼠血清组 模型 A 组 模型 B 组 养阴组 养 阴 活 血 组 养 阴 益 气 组 全方组 . 2 8 . 4 8 ' . 3 8 ' . 0 4 ' . 9 5 ' “ . 0 4 二 . 3 5 二 . 4 9 二 5 4 . 1 2 5 2. 9 9 5 3. 8 9 4 5 . 6 7 6 2. 5 5 5 1 . 6 6 4 8. 5 3 41. 71 用。如 本草纲目 认为玄参可以治疗“ 瘤痰痕疡， 通小便 血滞” 。生地能“ 消疲血” 。( 神农本草经 记载沙参“ 主血 积、 惊气、 除寒热” 。( 本草经疏) 则说“ 麦冬之功， 在提胃 家阴精， 润泽心肺， 以通脉道。 ” 在本实验中， 笔者选用了 中医养阴的代表方增液汤， 并配伍益气、 活血等药物来研 究其抗E C V 3 04 凋亡的机理。 笔者认为， 养阴药物抗E C V 3 o4 的凋亡的作用可能与 ( 1 ) 中和由L P S 诱导产生的自由基， 防止后者对其损 伤 3 1 ; ( 2 ) 诱导产生超氧化物歧化酶， 从而清除细胞内活 性氧和脂质过氧化物， 通过减少细胞内氧自由基和脂质 的蓄积， 防止氧自由基对不饱和脂肪酸的攻击， 使细胞损 伤减轻 3 1 ; ( 3 ) 阻止 C a 2 + 内流， 阻断某些凋亡信号的转 导通路， 抑制细 胞凋 亡 4 1 ; ( 4 ) 激活细 胞增 殖物质如b c l - 2 和b c l 一 X L 等， 促进细胞增殖。养阴 药物抗细胞凋 亡的机制是复杂的， 有待于进一步探讨。养阴方药血清 能对抗E C V 3 o4 的凋亡， 减少 L P S 对E C V 3 0 4 的损伤， 这也 同中医学认为养阴药能保护络脉， 濡润脉道， 消散痪血的 认识是一致的。 笔者发现， 养阴方的不同配伍对F- C V 3 0 4 凋亡的保护 作用也有一定的差异。养阴方配合益气、 活血后抗凋亡 的作用明显优于养阴方， 提示中医药的优势在于药物合 理配伍组成的复方。 参考文献: 0000000000000000 八U0000000 8几，16147U nOO月.1凡、4飞40 气764781上R 44411曰飞411公哎矽 nllJ.10，1，1，1份 j.二舀.二 曹仁贤. 血管内皮细胞调亡研究进展 1 1 . 国外医学· 生理 病理科学与临床分册， 1 9 9 7 , 1 7 ( 1 ) : 3 4 叶静. 陈宁， 汤特， 等. 研究脂多搪在建立内毒素感染细胞 模型中的应用【 1 1 . 天津医科大学学报， 2 0 0 2 , 8 ( 4 ) : 4 4 5 张旭， 龚婕宁， 卞慧敏， 等. 麦冬药物血清抗血管内皮细胞 凋亡的 分子机制【 1 1 . 南京中医药大学学报， 2 0 0 1 , 1 7 ( 5 ) : 2 8 9 姚忠祥， 蔡文琴， 人脐静脉内皮细胞的生物学特性及细胞 内信号转导机理【 1 1 . 第三军医 大学学报， 1 9 9 7 , 1 9 ( 4 ) : 3 7 3 如J钾esesjfesesJ工J ，几2月、4 呼口L，.LrL工L 注: . 同正常组比较P 0 . 0 5 , . 同模型组比较P 0 . 0 5 . 5 讨论 本实验的结果表明: 低浓度的L P S 即可诱导E C V 3 0 4 的凋亡。模型组同正常组比较有统计学意义。养阴组及 其不同的配伍对血管内皮细胞( 以下简称E C V 3 0 4 ) 有一 定的保护作用， 同模型组比较有显著性差异。 目 前的研究表明: 细胞凋亡是在凋亡诱导因素的作 用下通过等C a s p a s e s , P K C A介导的死亡信息传递， 在死 亡相关基因调控中， 导致内源性 D N A内切酶被激活而 出现的核D N A有规律的降解及细胞骨架解体的过程。 养阴药物是中医学中使用频率较高的一类药物。现 代药理表明此类药物具有抗炎、 退热、 改善微循环、 纠正 水电解质代谢紊乱等作用。笔者通过对古代文献的整理 和实验研究发现， 某些养阴药物具有良好的活血化痕作 A b s t r a c t : O b j e c t i v e : T o s t u d y t h e e f f e c t s i s t e n c y L P S t o i n d u c e t h e a p o p t o s i s o f E C V o f s e ru m o n E C V 3 0 4 i n j u r i e d b y l i p o p o i y s a c c h a r i d e ( L P S ) . Me t h o d s : U s e l o w c o n - 3 0 4 a n d s e r u m o f C h i n e s e me d i c i n e t o a f f e c t o n i t . F l o w c y t o m e t e r i s u s e d t o e v a l u - a t e t h e a p o p t o s i s o f c e l l s . R e s u l t : N o u r i s h i n g y i n m e d i c i n e s e rum c a n d i s t i n c t l y a n t i- a p o p t o s i s o f E C V 3 0 4 . K e y w o r d s : H e r b m e d i c i n e ; L i p o p o i y s a c c h a r i d e ; E C V 3 0 4 ; C e ll A p o p t o s is 聚焦中医药研究热点展示中医药研究成果 中医药 筋发代号: 8 - 1 8 2 月刊 1 9 2页 ( 中医肴母刊 与中医肴成展同步 每册8 . 8元 不仃足你喃错禾再仃走我的错 学刊 2 0 0 5 年峰刊个斯改版欢迎总捉止宝贵索龙 伦读者: 衡的惊毒!晰钓校获!薪钓满惫! 万方数据
