多巴胺对缺血再灌注大鼠心肌热休克蛋白表达的影响.pdf

·1 4 6·中国医科大学学报J C h i n M e d U n i v 第3 5 卷第2 期2 0 0 6 年4 月 多巴胺对缺血再灌注大鼠心肌热休克蛋白表达的影响 张明吉 ， 胡健， ， 吴迪2 ( 1 . 中国医 科大学附属第一医院循环内 科， 辽宁 沈阳 1 1 0 0 0 1 ; 2 . 第8 8 期临床医学7 年制) 摘要目 的: 检浏心从细胞缺血再灌注( I R ) 过程中 热 休克蛋白7 0 ( H S P 7 0 )的表达， 探讨多巴胺对H S P 7 0 表达的影响。方 法: 不同时间阻断W i s t a r 大鼠冠状动脉的前降支， 用含多巴 胺或生理益水的灌注液再灌注5 h 后， 取出 心脏前降支支配区的全 层心肌组织; 用W e s t e n B l o t 方法检浏H S P 7 0 的 表达。结果: 心肌细胞的H S P 7 0 表达随缺血时间的延长而增加， 缺血3 0 m i n 时 表达最高， 其后逐渐减少; 灌注液含多巴 胺的实 脸组较相同 缺血时间的灌注生理盐水的对照组H S P 7 0 表达均有明显增加( 尸 0 . 0 5 ) 。结论: 心肛H S P 7 0 表达与心肌缺血相关， 且呈时间 依赖性， 最大缺血耐受时间为3 0 m i n 左右。多巴胺在心从缺血再 灌注过程中 促进H S P 7 0 的表达。 【 关键词缺血再灌泣; 热休克蛋白7 0 ; 多巴 胺 【 中圈分类号R 5 4 文献标识码A 文章编号0 2 5 8 - 4 6 4 6 ( 2 0 0 6 ) 0 2 一 0 1 4 6 一 0 3 E f f e c t o f d o p a m i n e o n h e a t s h o c k p r o t e i n - 7 0 e x p r e s s i o n i n i s c h e m i c - r e p e r a t h e a r t Z H A N G M i n g 一 i t ， H U J i a n t , W U D i 2 ( 1 . D e p a rt m e n t o f C a r d i o l o gy, T h e F i r s t A ff i l i a t e d H o s p i t a l , C h in a M e d i c a l U n i v e r s i t y , S h e n y a n g 1 1 0 0 0 1 ， C h i n a ; 2 . T h e 8 8 t h g r a d e o f s e v e n - y e a r s y s - t e m , D e p a rt m e n t o f C l i n i c a l M e d i c i n e ) A b s t r a c t O b j e c t i v e ; T o i n v e s t i n g a t e t h e e x p r e s s i o n o f h e a t - s h o c k p r o t e i n s 7 0 ( H S P 7 0 ) i n i s c h e m i c - r e p e r f u s e d m y o c a r d i u m a n d t h e e ff e c t o f d o p a m i n e o n H S P 7 0 e x p re s s i o n . Me t h o d s ; T h e a rt e r i e s w e r e r e p e r f u s e d w i t h p e r f u s a t e c o n t a i n i n g d o p a m i n e o r s a li n e f o r 5 h o u r s a f t e r t h e a n t e r i o r d e s c e n d i n g b r a n c h e s o f l e f t c o r o n a ry a rt e r i e s o f W i s t a r r a t s w e r e li g a t e d f o r d if f e r e n t d u r a t i o n s ( 0 , 1 5 ， 3 0 , 4 5 ， 6 0 , a n d 9 0 m i n u t e s ) . E a c h l a y e r o f m y o c a r d i u m m a n i p u l a t e d b y t h e l e f t a n t e r i o r d e s c e n d i n g b r a n c h w a s s a m p l e d , a n d H S P 7 0 e x p re s - s i o n i n t h e m y o c a r d i u m w a s d e t e c t e d b y u s i n g W e s t e rn B l o t . R e s u l t s ; H S P 7 0 e x p re s s io n i n c r e a s e d w i th t h e p r o l o n g a t i o n o f i s c h e m i c d u r a t i o n , r e a c h e d t h e p e a k 3 0 m i n u t e s a f t e r i s c h e m i a , a n d t h e n d e c r e a s e d s l o w l y . H S P 7 0 e x p r e s s i o n i n a rt e r ie s re p e r f u s e d w i t h p e 而- s a t e c o n t a i n i n g d o p a m i n e w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n a rt e r ie s re p e r f u s e d w i t h s a li n e ( P 0 . 0 5 ) . C o n c l u s i o n ; T h e e x p r e s s io n o f H P S 7 0 i s c o r r e l a t e d w i t h m y o c a r d i a l i s c h e m i a i n a t i m e 一 d e p e n d e n t m a n n e r . D o p a m i n e m a y i n c r e a s e H S P 7 0 e x p re s s i o n d u r i n g i s - c h e m i c re p e r f u s i o n . K e y w o r d s i s c h e m i c re p e r f u s i o n ; h e a t s h o c k p r o t e i n 7 0 ; d o p a m i n e 急性缺血再灌注( i s c h e m i a r e p e r f u s i o n , I R ) 损伤 是目前应用静脉溶栓和冠状动脉球囊扩张支架手 术， 治疗急性心肌梗死后发生的一系列病理生理过 程。 热 休克 蛋白7 0 ( h e a t s h o c k p ro t e i n s 7 0 , H S P 7 0 ) 在心肌应激状态中起保护作用。多巴 胺作为治疗心 肌梗死的常用药物可能发挥对抗缺血再灌注损伤保 护心肌的作用。目 前国内外综合研究急性缺血再灌 注损伤时H S P 7 0和多巴胺的的报道鲜见。本研究 利用动物模型和分子生物学方法， 深人探讨心肌 H S P 7 0 表达与急性缺血再灌注损伤的关系， 以及多 巴胺在此过程中的作用。 1 . 1 材料与方法 材料 1 . 1 . 1 实验动物及分组: 成年W i s t a r 大鼠4 8 只， 体 作者简介7张明吉( 1 9 7 7 一 ) ， 男， 医师， 硕士. 现在鞍山市中心医 院工作. 研究方向: 心血管病的临床防治 通讯作者胡健， E - m a i l ; h u j 二 一 m u h o t m a i l . c o in 重( 2 7 0 土 1 5 ) g ， 雌性2 3 只， 雄性2 5只( 中国医科大 学动物中心) 。随机分为2 组， 每组2 4 只。第1 组 为生理盐水灌注组， 结扎冠状动脉时间分别为0 ( 不 结扎) , 1 5 , 3 0 , 4 5 , 6 0 , 9 0 m i n ， 第2 组为多巴胺注射 液5 w g / ( m i n · k g ) 灌注组， 结扎冠状动脉情况和时 间同第1 组。各组的每个结扎时段设4 只大鼠。 1 . 1 . 2 药品与试剂: 盐酸多巴胺注射液( 上海禾丰 制药有限公司) ; H S I 7 0 抗体( 小鼠 单克隆I g G ， 购于 美国S A N T A C R U Z 公司) 。 1 . 1 . 3 主要仪器: T K R - 2 0 0 型呼吸机( 江西特力麻 醉呼吸设备公司) 。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 大鼠在体心肌缺血再灌注模型建立: 大鼠 腹腔麻醉后， 颈静脉穿刺建立静脉输液通路， 气管切 开连接小动物呼吸机给予机械通气( 潮气量6 m l , 6 0 次/ m i n ) ， 连接二导记录仪描记肢导心电图。沿 左侧胸骨旁线切开大鼠 皮肤， 剪开心包， 按压胸壁将 心脏挤出胸腔， 在左心耳下方连同大静脉一并结扎 第2 期张明吉等. 多巴胺对缺血再灌注大鼠 心肌热休克蛋白表达的影响 ·1 4 7 · 左冠状动脉前降支( 不结扎组只穿线不结扎) ， 闭合1 . 3 统计学分析各组结果以z士! 表示， R u - 胸腔， 令其恢复自主呼吸。根据分组在不同的时间o c h i m V 2 . 0 软件采集灰度值， 采用S P S S 1 1 . 0 统计 点， 剪断结扎线恢复心肌血液供应进行再灌注， 同时软件进行t 检验。 经颈静脉插管输再灌注液5 h o灌注结束后立即取 山。 _ 。 *，。*士士。二、 ， _ 。，、。， 。 。 相如2 结果 出心脏， 剪取前降支支配区左心室的全层心肌组织 c a fi ( 1 . 5 c m x 1 . 5 c m ) ， 一 7 0 冰箱保存。2 . 1 不同缺血时间H S P 7 0 表达 1 . 2 . 2 W e s t e rn b l o t 检测: 心肌组织匀浆后加人生理盐水灌注组大鼠， 缺血0 - 3 0 m in内， 心肌 3 0 0闪裂解液( 1 x P B S , 1 % N P , , 0 . 5 %脱氧胆酸H S P 7 0 表达量随缺血时间的延长而增加， 缺血3 0 钠、 0 . 1 %S D S ) , 4 冰浴超声振荡， 1 2 0 0 0 r / m i n 离m i n 时表达最高， 自4 5 m i n 起H S P 7 0 表达量逐渐减 心3 0 m i n ， 取上清， 加人3 0 0闪样品缓冲液( 0 . 3 1 2少。 多巴 胺注射液 再灌注液组与生理盐水再灌注液 m o l/ L T r i s H C l p H 6 . 8 , 1 0 % S D S , 2 5 %p 一 琉基乙组大鼠H S P 7 0 表达量随缺血时间变化规律相似。 醇, 0 . 2 5 %澳酚蓝、 5 0 %甘油) ， 沸水煮5 m i n 。按总2 . 2 多巴 胺对H S P 7 0 表达的影响 蛋白3 0 w g 上样。1 0 %分离胶4 %浓缩胶 S D S 一多巴胺注射液再灌注组与生理盐水再灌注组相 P A S E电泳 1 . 5 h , 硝酸纤维素膜转印2h ( 电压比， 不结扎冠状动脉的大鼠( 缺血0 m i n ) H S P 7 0 表 5 0 V ) , 5 %脱脂奶粉封闭5 h ， 一抗( 1 4 0 0 ) 孵育过夜，达无显著性差异; 而对于各缺血时段的大鼠， 给予多 H B P 柄 林 己 山 羊抗鼠I g G ( 1 : 5 0 0 0 ) 孵育2 h ， 碱性磷酸酶巴 胺灌注液的心肌H S P 7 0 表达较对照均明显增加 检测。( 表1 ) 0 表1 多巴 胺注射液组与生理盐水组的再灌注心肌H S P 7 0 表达比 较( i t s ) T a b . 1 H S P 7 0 e x p r e s s io n i n t h e m y o c a r d i u m o f d o p a m i n e - r e p e r f u s e d g r o u p a n d s a li n e - re p e r f u s e d g r o u p ( z 士 s ) 缺血时间( m i n ) 夕 了 习 In一- 一一一 0 1 5 3 0 4 5 6 0 9 0 分组 生理盐水组 多巴胺组 2 4 2 4 3 1 . 2 t 1 . 4 7 3 1 11 . 4 4 3 5 . 2土1 . 1 7 5 0 . 1 士 2 . 7 5 ' ) 6 0 7 0 . 2土 2 . 7 5 . 5 t 1 . 8 3 ' 1 4 0 . 211 . 1 3 4 7 . 6 士 1 . 2 9 ' 1 3 3 . 7 1 2 . 2 9 4 1 . 4 1 1 . 1 5 ' 1 3 1 . 8士2 . 2 1 3 7 . 7 t 2 . 1 9 ' ) 注; 1 ) 与生理盐水组比 较P 0 . 0 5 3 讨论 急性缺血再灌注损伤是脏器移植、 体外循环及 冠状动脉再通术( 冠状动脉溶栓术溶栓、 经皮冠状 动脉成形术或冠状动脉搭桥术) 等的一个重要并发 症和致死原因， 此外， 没有自 觉症状的缺血再灌注损 伤可能常发生于心血管疾病人群中。心肌再灌注损 伤主要包括4 种类型: 再灌注心律失常、 心肌顿抑、 微血管损伤、 坏死和凋亡等不可逆改变 1 ， 其临床 发病机制尚未完全阐明。H S P 是一类在进化上高度 保守， 广泛存在于原核和真核生物细胞内的一种蛋 白 质 。 一些应激原刺激下产生的H S P 具有保护 组织细胞免受其他不同应激原损害的现象被称为交 叉耐受 。已 有大量研究表明， H S P 7 。 在心肌的 缺 血 再 灌注 过 程中 起 保护 作用， 因 而 如何 增加应激 状态下心肌细胞H S P 7 0的表达是目 前国内外学者 关注的热点问题之一。 多巴 胺类药常用于治疗缺血性心肌损伤导致的 心功能低下状态。 多巴 胺注射液以5 W g / ( k g · m i n ) 的速度静脉点滴时， 其作用于多巴胺的D A , , D A Z 受 体以及0 受体， 扩张冠状动脉， 增加心输出量， 从而 改善心功能。关于多巴 胺在缺血再灌注损伤中 作用 的报道不一， 有人通过离体大鼠心脏研究发现， 多巴 胺可能通过激活a l 一 肾上腺素受体在缺血中发挥 心 脏 保护作用5 l 。 本实 验通过在体结扎左冠状动 脉前降支， 成功模拟了心肌缺血再灌注的病理状态， 发现多巴胺在心肌缺血再灌注过程中可以增加 H S P 7 0的表达， 推测多巴胺可能通过这一途径对抗 缺血再灌注损伤， 改善心功能。在缺血过程中， 心肌 代 谢抑制 可以 诱导H S P 7 。 的 合成 增加 6 1 ， 而 再灌注 时 形成的 活性氧( 0 2和H Z 0 : 等) 也可诱导H S P 7 0 的表达。 N I S H I Z A W A等发现， 0 2和H 2 0 2 可以 使热 休克因子( h e a t s h o c k f a c t o r , H S F ) 与热休克元件 ( h e a t s h o c k e l e m e n t , H S E ) 结合力增强， H S P 7 0 m R N A 表 达明 显上 调t; 。 由 于 多巴 胺具有 扩张 冠 状 动脉的作用， 可通过增加缺血心肌的血流量， 为 H S P 7 0 的合成提供足够的必需物质。另外， B L A C K 等学者给予大鼠多巴胺受体激动剂后发现大鼠主动 脉 组 织内 的H S P 7 0 m R N A 显 著 增 加( 8 ) ， 因 而多巴 胺 还可能通过作用于心肌组织内多巴胺受体， 直接诱 导心肌细胞 H S P 7 0 表达的增加。本实验显示没有 缺血时多巴胺不能增加 H S P 7 0的表达， 具体机制有 ·1 4 8·中国医科大学学报第 3 5 卷 必要作进一步的深人研究。 此外， 本实验还发现心肌再灌注 3 0 m i n后 H S I 7 0 的表达最高。由于缺血心肌细胞造成的损伤 超过一定时间是不可恢复的， 因而推测心肌细胞的 最大缺血耐受时间为3 0 m i n 。与K A J S T U R A等在 心 肌梗死中 细 胞凋 亡研究中的 发现相似19 1 ， 即 超过 3 0 m i n 的缺血将造成心肌组织的顿抑或坏死， 并且 随缺血时间的延长而加重。这一发现对于急性心肌 梗死的治疗具有一定的指导意义。 参考文献: 1 V E R M A S , F E D A K P W, W E I S E L R D , e t a l . F u n d a m e n t a l s o f re p e r f u s i o n i n j u ry f o r t h e c l i n i c a l c a r d i o l o g i s t J . C i r c u l a t i o n . 2 0 0 2 , 1 0 5 ( 2 0 ) ; 2 3 3 2 一 2 3 3 6 . 2 R I T O S S A F . D i s c o v e ry o f t h e h e a t s h o c k re s p o n s e J . C e l l S t r e s s C h a p e r o n e s . 1 9 9 6 , 1 ( 2 ) ; 9 7 一 9 8 . 3 H E A D S R J , L A T C H M A N D S , Y E L L O N D M . S t a b l e h i g h l e v e l e x - p r e s s i o n o f a t r a n s f e c t e d h u m a n H S P 7 0 g e n e p ro t e c t s a h e a rt一 d e - r i v e d m u s c le c e ll l i n e a g a i n s t t h e r m a l s t r e s s J . J M o l C e l l C a r d i - 0 l . 1 9 9 4 , 2 6 ( 6 ) ; 6 9 5 一 6 9 9 . 4 J A Y A K U M A R J , S U Z U K I K , K H A N M , e t a l . G e n e t h e r a p y f o r m y o- c a r d i a l p ro t e c t i o n ; t r a n s f e c t i o n o f d o n o r h e a r t s w i t h h e a t s h o c k p ro - t e i n 7 0 g e n e p ro t e c t s c a r d i a c f u n c t i o n a g a i n s t i s c h e m i a 一 re p e r f u s io n i n j u ry J . C irc u l a t i o n , 2 0 0 0 , 1 0 2 ( 1 9 S u p p 1 3 ) : 1 1 13 0 2 一 3 0 6 . 5 S T A M M C , F R I E H S 1 , C O W A N D B , e t a l . D o p a m in e t r e a t m e n t o f p o s t i s c h e m i c c o n t r a c t i l e d y s f u n c t i o n r a p i d l y i n d u c e s c a l c i u m - d e - p e n d e n t p ro - a p o p t o t ic s ig n a l i n g J . C ir c u l a t i o n , 2 0 0 2 , 1 0 6 ( 1 2 S u p p l 1 ) ; 1 2 9 0 一 2 9 8 . 6 K I A N G J G , T S O K O S G C . H e a t s h o c k p ro t e i n 7 0 k D a ; m o le c u l a r b io l o g y , b i o c h e m i s t ry , a n d p h y s i o l o g y J . P h a r m a c o l T h e r , 1 9 9 8 , 8 0 ( 2 ) ; 1 8 3 一 2 0 1 . 7 N I S H IZ A W A J , N A K A I A , M A T S U D A K , e t a l . R e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s p 城 a n i m p o r t a n t ro l e i n t h e a c t iv a t i o n o f h e a t s h o c k f a c to r 1 i n i s c h e m ic 一 re p e r f u s e d h e a rt J . C i r c u l a t i o n , 1 9 9 9 , 9 9 ( 7 ) 0 9 3 4 一9 4 1 . 8 B L A K E N J , B U C K L E Y D J , B U C K L E Y A R . D o p a m i n e r g i c re g u l a - t i o n o f h e a t s h o c k p ro t e in 一 7 0 e x p re s s i o n i n a d re n a l g l a n d a n d a o r t a J . E n d o c r i n o l o g y , 1 9 9 3 , 1 3 2 ( 3 ) : 1 0 6 3 一 7 0 . 9 K A J S T U R A J , C H E N G W, R E I S S K , e t a l . A p o p t o t i c a n d n e c ro t i c m y o c y t e c e ll d e a t h s ， i n d e p e n d e n t c o n t r i b u t i n g v a r i a b l e s o f i n f a r c t t a t s J . L a b I n v e s t , 1 9 9 6 , 7 4 ( l ) : 8 6 一 1 0 7 收稿日期2 0 0 4一0 9一1 2 ( 上接第 1 4 5 页) 厚的初始原因之一。 最早注 意到血管重塑的 是G L A G O V i 3 J 等， 他们 观察发现: 随着动脉粥样硬化病变的进展、 内膜的增 厚， 冠脉腔可扩大， 以代偿由于病变进展和内膜增厚 所致的管腔缩小。但P T C A后血管重塑多表现为晚 期的血管收缩， 可伴有或不伴有新生内膜的增厚。 在 P T C A和定向冠脉旋切术( D C A ) 随诊中也证实血 管收缩是导致血管重塑的原因之一。那么是什么原 因引起血管收缩而促使 P T C A后血管发生重塑呢? 研究发现， 球囊扩张损伤血管后， 外膜的成纤维细胞 先于中膜平滑肌细胞 发生增生， 随后纤维细胞也发 生表现型改变， 转变成肌纤维细胞， 并分泌一些胶原 基质成分， 沉积在血管壁而形成硬的“ 瘫痕” ， 阻止 内 膜 增 厚引 起的 血管 腔 代 偿 性 扩 大川。 我们的实验结果显示， 各组动物高脂饮食后4 , 8 , 1 2 周的T C , T G , L D L 均明显高于基础值， 符合动 脉粥样硬化的模型; 经导管局部应用 c - m y c 反义核 昔酸可以抑制血管重塑的发生。反义治疗组血管重 塑指数明显大于其他3 组， 说明c - m y c 反义核昔酸 不仅可以致血管损伤后的新生内膜增厚， 而且可以 防止血管重塑的发生， 但其作用机制不明。分析可 能与c - m y 原癌基因的特异性抑制有关。体外研究 发现1 5 1 ， 培养的 成纤维细胞在促有丝分裂原的刺激 下可表达c - m y c 原癌基因， 同时发生成纤维细胞增 生。血管成型术时， 在损伤内膜、 中膜的同时， 不可 避免的损伤血管的外膜。血管成型术本身对原癌基 因的表达是一个强有力的刺激， 因此也可能引起外 膜成纤维细胞表达c - m y c 原癌基因， 经导管血管转 运的。 - m y c 反义核昔酸同样可以达到外膜， 抑制成 纤维细胞增生， 从而阻止血管重塑的发生。 参考文献: 川 B A U T E R S C , M E U R I C E T , H A M O N M , e t a l . P r o t 。 一 o n c o g e n e e x p re s s i o n i n r a b b i t a o r ta a f t e r w a ll i n j u ry . F i r s t m a r k e r o f t h e c e l l u - l a T p r o c e s s l e a d i n g t o r e s t e n o s i s a f t e r a n g io p l a s t y J . E u r H e a rt , 1 9 9 2 , 1 3 ( 4 ) : 5 5 6 一 5 5 9 . 2 M I A N O J M , T O T A R R , V L A S I C N , e t a l · E a r l y p ro t o 一 o n c o- g e n e e x p re s s i o n i n r a b b i t a o r t a s m o o t h m u s c l e c e l l f o ll o w i n g e n d o- t h e l i a l r e m o v a l J . A m P a t h o l , 1 9 9 0 , 1 3 7 ( 4 ) : 7 6 1 一 7 6 5 . 3 G L A G O V S ， W E I S E N B E R G E , Z A R I N S C K , e t a l . C o m p e n s a t o ry e n l a r g e m e n t o f h u m a n a t h e ro s c l e ro t i c c o ro n a ry a rt e r i e s J . N E n g l M e d , 1 9 8 7 , 3 1 6 ( 2 2 ) : 1 3 7 1 一 1 3 7 5 . 4 S H I Y , P I E N I E K M , F A R D A , e t a l . A d v e n t i t i a l r e m o d e l in g a f t e r c o ro n a ry a rt e r ia l i n j u ry J . C i r c u l a t i o n， 1 9 9 6 , 9 3 ( 2 ) : 3 4 0 一 3 4 8 . 5 K A R I M M A , M I L L E R D D , F A R R A R M A , e t a l . H is to n o r p h o m e t- r i c a n d b i o c h e m i c a l c o r r e l a t e s o f a rt e r i a l p r o c o ll a g e n g e n e e x p r e s s i o n d u r in g v a s c u l a r r e p a ir a f t e r e x p e r i m e n t a l a n g i o p l a s t y J .C i r c u l a - t i o n , 1 9 9 5 , 9 1 ( 7 ) ; 2 0 4 9 一 2 0 5 7 . 收稿日 期2 0 0 4 - 0 6 - 0 2