抗原特异性调节性T细胞体外诱导扩增及其功能测定.pdf

in vitro and amplified. Then the MSCs， rhBMP2 and Fibrinogen were made into a complex and implanted into 5 allo- genic rabbits to bridge 1. 5cm segmental bone defects as experiment group. Fibrinogen was implanted to bridge same size defects in other 5 allogenic rabbits as control group. The CD4 + ， CD8 + ， CD4 + / CD8 + T lymphocytes in blood were detected using flow cytometer at 1， 2， 3， 6 and 8 weeks after the operation. Results T lymphocyte subsets CD4 + ， CD8 + and CD4 + / CD8 + at every time point after the operation in the experiment group and control group had no significant difference as compared to pre-operation. Conclusion Tissue engineered bones constructed with Fibrinogen， and rhBMP 2 and allogenic MSCs showed low immunogenicity within 8 weeks and could be implanted to repair bone defects in rabbits. MeSH tissue engineering； bone transplantation； transplantation， homologous； t-lymphocyte subsets/ blood；rabbits 抗原特异性调节性 T 细胞体外诱导扩增及其功能测定 陈 跃， 许戈良， 王保龙 摘要： 目的 体外诱导扩增抗原特异性 CD4 + CD25 + T 细胞， 测定其免疫抑制功能， 验证其抗原特异性。方法 应用免疫 磁珠 法 （ MACS）分 选 C57BL/6 鼠 CD4 + CD25 + T 细 胞。 CD4 + CD25 + T 细胞在 Balb/ c 鼠抗原刺激条件下， 体外扩增 获得 Balb/ c 鼠抗原特异性的 CD4 + CD25 + T 细胞 （iCD4 + CD25 + T） ， 流式细胞术测定其纯度，RT-PCR 方法测定其 FoxP3mRNA。测定在 Balb/ c 小鼠 （A 组） 或昆明鼠 （B 组） 抗 原刺激条件下， iCD4 + CD25 + T 抑制 T 细胞增殖的效率， 验证 iCD4 + CD25 + T 的抗原特异性。ELISA 法测定 A、 B 组上清液 中 IL-10 和 TGF- 的含量。结果 MACS 分离的 C57BL/6 小鼠 CD4 + CD25 + T 细胞纯度为 99. 6%。扩增 3 周， iCD4 + CD25 + T 纯度达 85%， 扩增数目达 900 倍， 高表达 Foxp3 基 因。当 iCD4 + CD25 + T : CD4 + CD25 - T 为 1 : 1、 1 : 2 时， A 组抑制率明显高于 B 组 （82. 2% ± 3. 29% vs 11. 6% ± 1. 2%， 54. 4% ± 3. 5% vs 5. 4% ± 1. 7% ， P 0. 01） 。A 组 IL-10 和 TGF- 的分泌量均高于 B 组 （P 0. 01） 。结论 在 体外成功诱导扩增了具有免疫抑制功能的抗原特异性的 CD4 + CD25 + 调节性 T 细胞。 主题词 小鼠； T 淋巴细胞亚型； 抗原； 流式细胞术 中图分类号 R 392. 4 文献标识码 A 文章编号 1000 -1492 （2006） 04 -0395 -04 CD4 + T 细胞的一种亚群持续表达 IL-2 受体的 链 （CD25） ， 其在控制自身免疫病中起重要作 用 1 -2， 移植时输注这种细胞可以诱导异基因移植 鼠的免疫耐受 3。这种 CD4+ CD25 + T 细胞被称作 2006 -05 -30 接收 作者单位： 安徽医科大学附属省立医院普外科， 合肥 230001 作者简介： 陈 跃， 男， 32 岁， 硕士研究生， 医师； 许戈良， 男， 50 岁， 主任医师， 硕士生导师， 责任作者， E- mail ：xugelian mail. hf. ah. cn 调节性 T 细胞 （Tr） 。在人和鼠 CD4 + CD25 + T 细胞 占 CD4 + T 细胞的 5% 10%1， 数量少， 单一个体 无法提供治疗剂量的 CD4 + CD25 + T 细胞。此外， CD4 + CD25 + T 的效应功能是抗原非特异性的， 如何 高效诱导抗原特异性的 CD4 + CD25 + T 细胞以用于 特异性的免疫治疗是亟待解决的又一难题。本实验 采用混合淋巴反应技术扩增 C57BL/6 （B6） 小鼠 CD4 + CD25 + T 细胞： 用灭活的 Balb/ c 小鼠抗原提呈 细胞 （APC） 作为刺激抗原， 在含大剂量 mIL-2（100 µg/ L） 、 mIL-10（100 µg/ L） 的 RPMI 1640 培养液中 培养扩增， 3 周后计扩增的 CD4 + CD25 + T 细胞数确 定其扩增效率， 并用 T 细胞增殖抑制实验测定其抑 制功能和抗原特异性。 1 材料与方法 1. 1 实验动物 B6 （H-2b） 、 Balb/ c （H-2d） ， 雄性， 8 10 周龄， 各 8 只 （购自安徽医科大学动物中心， 清 洁级） 。 1. 2 主要试剂及仪器 小鼠 CD4 + CD25 + T 细胞磁 珠分离试剂盒、 小鼠 CD4 - FITC 单抗及小鼠 CD25 - PE 单抗 （Miltenyi Biotec 公司产品） ； mIL-2、 mIL-10、 IL-10 及 TGF-ELISA-Kit （Pepro inc 产品） 流式细胞 仪 （FACSCalibur 型， Becton Dickinson 公司产品） ； H3-TdR （中国同位素公司产品） 。 1. 3 方法 1. 3. 1 脾脏单个核细胞的分离 断颈处死 B6 或 Balb/ c 小鼠， 取脾脏， Ficoll 离心分离获得单个核细 胞。 1. 3. 2 免疫磁珠法 （MACS） 分选 CD4 + T 细胞、 APC ·593·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4） 用含 0. 5%牛血清白蛋白、 pH 7. 2 的 PBS 缓冲液 40 µl 重悬脾细胞， 加入10 µl 混合生物素抗体 （含 anti- mouse CD8a、 CD11b、 CD45R、 CD49b、 Ter-119）4 8放置 15min， 再加 20 µl 抗生物素磁珠、 10 µl CD25-PE 单抗 4 8放置 15 min， LD 柱过滤， 阴性 选择获得 CD4 + T 细胞， 快速挤压出 LD 柱中细胞， 20 Gy 照射后作为 APC。 1.3. 3 MACS 分选 CD4 + CD25 + T 细胞 CD4 + T 细 胞重悬后加抗 PE 磁珠4 8 放置 15 min， 经 2 次 MS 柱过滤， 阳性选择获得 CD4 + CD25 + T 细胞。所 得 CD4 + CD25 + T 细胞加入 CD4-FITC 单抗和 CD25- PE 单抗避光混合 30min， 流式细胞术测定其纯度。 1. 3. 4 体外扩增 Balb/ c 鼠抗原特异性 iCD4 + CD25 + T 3. 5 ×104/100µl， B6 小鼠 CD4 + CD25 + T 细 胞在含 B6 鼠 APC（20Gy 照射） 2 × 105/50 µl 和 Balb/ c 鼠 APC （20 Gy 照射） 2 × 105/50 µl 的 RMPI 1640 培养液 （含 100 µg/ L IL-2，100 µg/ L IL-10， 10% FCS，50 µmol/ L -巯基乙醇）中， 置于 5% CO2孵箱培养扩增， 每 2 天半量更换新鲜培养液。 每 7 天 1 : 1扩孔后重新刺激， 第 21 天收集细胞。 1. 3. 5 细胞表型的鉴定 扩增后细胞经 PBS 洗涤 3 次后， RMPI 1640 培养液重悬至 1 ×106/ ml， 0. 4% 台盼蓝染色（ 细胞悬液与 0. 4%台盼蓝染色按1 : 1 比例 ）， 计未被染色的活细胞绝对总数。CD4-FITC 单抗和 CD25-PE 单抗与细胞悬液避光4 孵育 30 min， 流式细胞术测定扩增后 CD4 + CD25 + T 细胞纯 度。 1. 3. 6 Foxp3 mRNA 的测定 分别取扩增的 CD4 + CD25 + T （iCD4 + CD25 + T） 、 新分离的 CD4 + CD25 + T （f-CD4 + CD25 + T） 、 CD4 + CD25 - T 细胞、 外周血单个 核细胞 （SMC） 、 脾脏单个核细胞 （PBMC） ， 加入 1 ml Trizol 提取总 RNA， 根据逆转录试剂盒提供的方法 将总 RNA 反转录为 cDNA， 以其为模板进行 PCR 扩 增。PCR 反应条件为： 94 预变性 2. 5 min， 然后 94 变性 30 s， 60 退火 30 s， 72 延伸 1. 5 min， 共 35 循环。FoxP3 基因引物序列 P1： 5'-CTCCCG- GCAACTTCTCCTGAC-3'，P2： 5'- TCAAGGGCAGG- GATTGGAGCACT-3'。GAPDH 引 物 序 列 P1： 5 - GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，P2：5'-GAAGAT GGT GAT GGG ATT TC-3'。均由大连 TaKaRa 公司 合成。 1. 3. 7 T 细胞增殖抑制试验 A 组：在 96 孔反应 板中加入 B6 小鼠 CD4 + CD25 - T 细胞 1 × 105/ 孔， B6 小鼠 APC （20 Gy 照射） ， Balb/ c 小鼠 APC （20 Gy 照射） 1 ×105/ 孔， 再按不同比例 （iCD4 + CD25 + T : CD4 + CD25 - T 为1 : 1、 1 : 2、 1 : 4、 1 : 8） 加入扩增后 的 iCD4 + CD25 + T。B 组：在 96 孔反应板中加入 B6 小鼠 CD4 + CD25 - T 细胞 1 ×105/ 孔， B6 小昆鼠 APC （20 Gy 照射） ， 昆明小鼠 APC （第三方对照刺激细 胞， 20 Gy 照射） 1 × 105/ 孔， 再按不同比例 （iCD4 + CD25 + T : CD4 + CD25 - T 为1 : 1、 1 : 2、 1 : 4、 1 : 8） 加入扩增后的 iCD4 + CD25 + T。 每组均设阳性对照（即该组反应体系中不加 iCD4 + CD25 + T） ， 每组 5 只小鼠， 每个反应重复孔， 在含10% FCS、 50 µmol/ L -巯基乙醇的 RMPI 1640 培养液中， 37 、 5% CO2环境中培养 96 h。终止培 养前 16 h 加入18. 5 Bq 的 H3-TdR， 多头细胞吸收器 收集细胞， -液闪仪 （BeckmanLS6500） 测定 cpm 值。 计算各组抑制率。 抑制率% = （1 - 测定组 cpm/ 阳性组 cpm）×100% 1. 3. 8 TGF-、 IL-10 的测定 分别于 T 细胞增殖 抑制试验细胞培养的 12、 24、 48、 72 h 收集上清液， -80 保存。测定严格按说明书要求进行。 1.4 统计学处理 数据以%x ± s 表示， 用 SPSS 11. 0 软件进行配对 t 检验分析。 2 结果 2.1 CD4 + CD25 + T 细胞纯度分析 MACS 分选的 CD4 + CD25 + T 细胞纯度达到 99. 6%， 扩增 3 周后 CD4 + CD25 + T 细胞纯度为 85%。见图 1。 图 1 CD4 +CD25+T 细胞纯度分析 A： CD4 + CD25 + T 细胞纯度达 99. 6%； B： 扩增 3 周后 CD4 + CD25 +T 细胞占总细胞数的 85% 2. 2 CD4 + CD25 + T 细胞扩增效率分析 收集扩 增后的细胞， 重悬细胞后台盼蓝染色， 计活细胞绝对 总数为 10. 8 ×107， 相对培养前的 1. 05 ×105（3 孔总 数） ，CD4 + CD25 + T 细胞扩增效率约为 900 倍 （10. 8 ×107×0. 85/1. 05 ×105） 。 2. 3 各组细胞 Foxp3 的表达 f-CD4 + CD25 + T、 ·693·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4） iCD4 + CD25 + T 均高表达 Foxp3 基因， 而新分离的 CD4 + CD25 - T 细胞不表达该基因。PBMC、 SMC 表 达少量 Foxp3 是因为含有少量 CD4 + CD25 + T 细胞。 见图 2 。 图 2 RT-PCR 方法检测各组细胞 Foxp3 的表达 A：f-CD4 +CD25+ T B： PBMC C： SMC D： CD4 + CD25 + T E： iCD4 +CD25+T 2. 4 iCD4 + CD25 + T 的抗原特异性分析 A 组与 B 组抑制率差异有显著性 （P 0. 01） ， 见表 1。表明 Balb/ c 鼠抗原能特异性地诱导 iCD4 + CD25 + T 细胞 发挥免疫抑制功能。 表 1 各组 CD4 +CD25-T 细胞增殖抑制率 （n =10， % x ± s） iCD4 +CD25+T : CD4 +CD25-T 抑制率 （%） A 组B 组 1 : 182.2 ±3.2911.6 ±1.2& 1 : 254.4 ±3.55.4 ±1.7& 1 : 434.2 ±3.53.4 ±1.2& 1 : 810.0 ±2.02.0 ±1.05& 与 A 组比较： &P 0. 01 2. 5 不同实验组培养上清液细胞因子含量 见表 2、 3。A、 B 组分泌 IL-10 和 TGF- 水平均于 48 h 达 最高峰。两组分泌 IL-10 和 TGF- 水平差异有显著 性 （P 0. 01） 。IL-10、 TGF- 分泌水平与抑制率相 关， 提示 IL-10、 TGF- 可能与 CD4 + CD25 + T 细胞的 免疫抑制功能相关。 表 2 当 iCD4 +CD25+T : CD4+CD25-T 为 1 : 1 时 各组分泌细胞因子 IL-10 水平 （n =10， ng/ L，%x ± s） 组别12 h 24 h 48 h 72 h A570 ±76.2 1 218 ±110.5& 1 408 ±180.3&& 710 ±98.6& B280 ±34.9#436 ±78.2&#500 ±87.3&#372 ±43.2&# 与12 h 比较： &P 0. 05，&&P 0.01； 与 A 组比较：#P 0. 01 表 3 当 iCD4 +CD25+T : CD4+CD25-T 为1 : 1时 各组分泌细胞因子 TGF-水平 （n =10， ng/ L，%x ± s） 组别12 h 24 h 48 h 72 h A627 ±92.3 879 ±102.1&1 110 ±131.4&& 653 ±87.6 B298 ±38.2#432 ±63.5&#511 ±89.6&#382 ±43.8&# 与12 h 比较： &P 0. 05，&&P 0. 01； 与 A 组比较：#P 0. 01 3 讨论 3. 1 调节性 T 细胞的体外扩增 体外实验证明， CD4 + CD25 + T 对效应性 T 细胞的抑制具有抗原特 异性； CD4 + CD25 + T 抗原特异性表型的形成需要相 应抗原的预先致敏和外周致敏抗原的持续存在。 目前体外扩增 CD4 + CD25 + T 的方法主要有： 用 Anti-CD3 或联合应用 Anti-CD28 加大剂量 IL-2 扩增 CD4 + CD25 + T 细胞 6； 在体外用同种异型 DC 细胞 培养扩增 CD4 + CD25 + T 细胞 7。但上述方法均存 无抗原特异性或效率不高的缺陷。 本实验运用异体细胞刺激以及高剂量的 IL-2， 在体外扩增获得异体抗原特异性 iCD4 + CD25 + T 细 胞。结果显示： 扩增 3 周后， iCD4 + CD25 + T 纯度为 85%， 扩 增 效 率 达 900 倍 。RT-PCR 实 验 证 实 iCD4 + CD25 + T 细胞特异性高表达调节性 T 细胞的 标志物 Foxp3 基因。功能试验 （淋巴细胞增殖抑制 试验） 显示，iCD4 + CD25 + T 对 Balb/ c 鼠 APC 激活 的 T 细胞增殖的抑制率显著高于对第三方对照 APC 刺激的抑制率 （P 0. 01） ， 表明 CD4 + CD25 + T 细胞能特异性地被 Balb/ c 鼠抗原活化， 从而发挥较 强的抑制功能。上述结果表明： 本方法对 CD4 + CD25 + T 的扩增具有较高的效率， 用本方法可诱导 扩增抗原特异性的调节性 T 细胞。戴振鹏等 7用 Anti-CD3 加大剂量的 IL-2 对分离的人 CD4 + CD25 + T 细胞进行活化扩增， 于体外成功建立了可长期培 养的具有免疫调节功能的人调节性 T 细胞， 但无抗 原特异性。Helmut et al 8在体外有效地用同种 DC 细胞培养扩增了 CD4 + CD25 + T， 但效率不高。 3. 2 细胞因子在免疫抑制中的作用 在体内， CD4 + CD25 + T 细胞可分泌细胞因子 IL-10 和 TGF- 参与抑制免疫反应 9， 但在体外， CD4+ CD25 + T 细 胞主要通过细胞接触抑制的方式抑制 T 细胞的活 化和增殖 10。本实验 T 细胞增殖抑制实验里， A 组 抑制率显著高于 B 组， 证实了 A 组有较多 CD4 + CD25 + T 细胞活化， IL-10 和 TGF- 分泌增加； 但 IL- 10 和 TGF- 分泌水平与抑制效率不成正比， 因为 CD4 + CD25 - T 细胞被激活后也可分泌 IL-10 和 TGF- 6。 3.3 抗原特异性调节性 T 细胞在器官移植中的应 用 在器官移植时， 抗原特异性调节性 T 细胞的免 疫抑制作用具有同种异体抗原特异性， 即仅对特定 的抗原产生耐受， 而保留和不干预机体的其他免疫 功能， 既达到治疗目的， 又降低对宿主免疫功能的影 ·793·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4） 响到最低限度。相对非特异性免疫抑制剂易导致感 染和导致肿瘤的发生概率升高， 调节性 T 细胞有着 明显的优势， 在移植免疫领域有着光明的前景。 参考文献 1 Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al. Immunologic self-tol- erance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor al- pha-chains（CD25） . Breakdown of a single mechanism of self-tol- erance causes various autoimmune diseases J . J Immunol， 1995， 155（3） ： 1151 -64. 2 姚凤球，凌 斌，周 颖， 等. 妊娠期肝内胆汁淤积症患者蜕 膜 T、 B 细胞含量的研究 J . 安徽医科大学报， 2005， 40（6） ： 553 -5. 3 Graca L， Cobbold S P， Waldmann H， et al. Identification of regu- latory T cells in tolerated allograft J . J Exp Med，2002， 195 （12） ： 1641 -6. 4 Fowell D，Manon D. Evidence that the T cell repertoire of normal rats contains cells with the potential to cause diabetes. Character- ization of the CD4 + T cell subset that inhibits this autoimmune po- tential J . J Exp Med， 1993； 177 （3） ： 627 -36. 5 Seddon B，Mason D. Regulatory T cells in the control of autoim- munity：the essential role of transforming growth factor beta and in- terleukin 4 in the preventing of autoimmune thyroiditis in rats by peripheral CD4 + CD25 + RC cells and CD4 + CD8 + thymocytes J . J Exp Med， 1999； 189（2） ： 279 -88. 6 Qizhi Z，Tang F，Jeffrey A，et al. In vitro-expanded antigen-spe- cific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes J . J Exp Med， 2004， 199（11） ： 1455 -65. 7 戴振鹏 ， 赵金存，张 岩，等. 人 CD4 +CD25+调节性 T 细胞 系的建立与功能分析 J . 中国免疫学杂志， 2003， 19 （1） ： 5 - 8. 8 Helmut J， Edgar S， Michael S， et al. Identification and functional characterization of human CD4 + CD25 + T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood J . J Exp Med，2001， 193 （11） ： 1285 -94. 9 Trenado A，Charlotte F，Fisson S，et al. . Recipient-type specific CD4 +CD25+ regulatory T cells favor immune reconstitution and control graft-versus-host disease while maintaining graft-versus-leu- kemia J . J Clin Invest， 2003， 112 （11） ： 1688 -96. 10Mxloy KJ，Salaun L，Cahill R，et al. CD4 + CD25 + T （R）cells suppress innate immune pathology through cytokine dependent mechanisms J . J Exp Med， 2003， 197 （1） ： 111. Induction and expansion of antigen specific regulatory T cells in vitro Chen Yue，Xu Geliang，Wang Baolong （Dept of General Surgery， The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001） Abstract Objective To set up a system of inducing and expanding antigen specific CD4 + CD25 + regulatory T cells（iCD4 + CD25 + T） ，and to determine their properties of suppressing T cell proliferation. Methods CD4 + CD25 + regulatory T cells were purified from C57BL/6 mouse and using MACS. Balb/ c antigen specific CD4 + CD25 + T（iCD4 + CD25 + T）were induced and expanded in the presence of Balb/ c APC， and their antigen specific suppressive function was determined by suppressing proliferation of T cells in the presence of Balb/ c APC（Group A）or kunming APC（Group B）. The contents of IL-10 and TGF- in supernatant in Group A or Group B were de- termined using ELISA. Results CD4 + CD25 + T sorted by MACS yield a purity of 99. 6%. After 3 weeks of culture in our system，the number of CD4 + CD25 + T which expressed high number of Foxp3 mRNA increased by 900- folds. when the ratio of iCD4 + CD25 + T and B6 CD4 + CD25 - T cells was 1 : 1 and 1 : 2，suppress rate was higher in group A than in group B （82. 2% ±3. 29% vs 11. 6% ±1. 2% ， 54. 4% ±3. 5% vs 5. 4% ±1. 7% ， P 0. 01） . The contents of IL-10 and TGF- in supernatant in Group A was higher than in Group B（P =0. 00） . Conclusion The system of inducing and expanding antigen specific CD4 + CD25 + T cells is set up successfully. MeSH mouse；T-lymphocyte subsets；antigens；flow cytometry ·893·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4）