抑胶素对大鼠脑胶质瘤细胞血管内皮生长因子作用的体内试验.pdf

中风与神经疾病杂志2 0 0 6 年8 月第2 3 卷第4 期 41 3 文章编号: 1 0 0 3 - 2 7 5 4 ( 2 0 0 6 ) 0 4 - 0 4 1 3 - 0 3 抑胶素对大鼠脑胶质瘤细胞血管内皮生长因子 作用的体内试验 崔俐林卫红 ， 孙艳梅“ ， 徐丹“ 摘要: 目的研究抑胶素对大鼠脑胶质瘤血管内皮生长因子( V E G F ) 的影响。方法采用脑立体定向术， 在Wi s t a r 大鼠脑尾状核接种C 6 细胞， 应用免疫组织化学方法检测应用抑胶素前后对鼠脑胶质瘤血管内皮生长因 子的影响。结果经抑胶素治疗后可见肿瘤内血管内皮生长因子阳性细胞密度下降， 随浓度增加阳性率呈下降趋 势。 实验组I ( 抑胶素浓度3 2 p g / k g ) 较对照组表达降低( P 0 . 0 5 ) . C o n c l u s i o n I t s u g g e s t s t h a t t h e i n h i b i t i v e e f f e c t o f a n t i g l i o m a t i n o n t h e g r o w t h o f r a t b r a i n g l i o m a i s p r o b a b l y v i a d o w n - r e g u l a t i n g t h e V E G F e x p r e s s i o n . T h i s k i n d o f r e g u l a t i o n i s p o s i t i v e l y c o r r e l a t e d w i t h t h e d r u g c o n c e n t r a t i o n . K e y w o r d s : A n t i g l i o m a t i n ; B r a i n g l i o m a ; V E G F 神经胶质瘤是颅内肿瘤中最常见的一种， 因其 侵袭性生长的特性， 手术难以完全切除， 术后极易复 发 l 。 抑胶素作为一种特异性氯离子通道阻滞剂， 是 一种蝎毒素多肤， 其有效成分氯毒素能与神经胶质 瘤细胞表面异常表达的氯离子通道特异性结合， 对 胶质瘤细胞有显著的抑制作用 2 1 。近年国外对氯毒 素的研究较多， 国内未见氯毒素类物质对C 6 胶质瘤 作用的研究报道。我们在体内试验中观察了抑胶素 对胶质瘤细胞血管内皮生长因子的影响， 结果如下。 1 材料与方法 1 . 1 细胞株和动物分组大鼠C 6 脑胶质瘤细 胞株是由雄性大鼠经静脉注射硝甲基脉而诱发产生 的恶性胶质瘤细胞株 3 。本实验所用的瘤株是由吉 林大学病理毒理学教研室提供。抑胶素是由吉林大 学基础医学院生理教研室提供; 顺铂( C D D P ) , 1 0 m g / 每支， 购自山东齐鲁制药厂。动物选用雄性、 健康Wi s t a r 大鼠6 0 只， 鼠龄6 -8 周， 体重2 0 0 g 2 5 0 g ， 由吉林省高新技术开发区动物中心提供。 1 . 2 实验动物分组将全部Wi s t a r 大鼠随机 分为6 组， 每组1 0 只。 于细胞接种后第7 天开始给予 药物治疗。具体如下: ( 1 ) 空白对照组: 0 . 9 0 o N a C l ; 收稿日 期: 2 0 0 6 - 0 2 - 1 6 ; 修订日 期: 2 0 0 6 - 0 7 - 0 5 基金项目: 2 0 0 3 年吉林省卫生厅医学科研基金( 2 0 0 3 - 0 3 2 3 ) 作者单位: ( 1 . 吉林大学第一医院神经内科， 吉林 长春 1 3 0 0 2 1 ; 2 . 沈 阳军区8 1 疗养院， 辽宁 沈阳 1 2 5 1 0 5 ; 3 . 长春大学医院. 吉林 长春 1 3 0 0 0 0 ) J A p o p l e x y a n d N e r v o u s D i s e a s e s , A u g u s t 2 0 0 6 , V o l 2 3 , N o . 4 明显。 2 . 2 V E G F免疫组化结果分析V E G F阳性 细胞的胞核呈黄色或棕黄色， 镜下计数肿瘤内5 个 视野的阳性细胞。对照组肿瘤细胞中V E G F阳性表 达率( V E G F指数) 平均为7 6 - 0 7 % 0 ， 表现为阳性细胞 密度高， 胞核呈强阳性， 数量多。经抑胶素治疗后即 可见肿瘤内V E G F阳性细胞密度下降， 核V E G F阳 性强度减弱， 随浓度增加阳性率呈下降趋势。 实验组 1Q 较对照组表达降低( P 0 . 0 5 )见表1 ) o 表1 抑胶素治疗组、 顺铂组与对照组大鼠脑 V E G F指数的变化( x 士、 ) 浓度例数V E G F指数( %) T值 亡JJ”1 110 76.72. ( 2 ) 抑胶素不同浓度组: ( I : 8 t .g / k g ; II : 1 6 u g / k g ; III : 3 2 f .c g / k g ; N : 6 4 K g / k g ) ; ( 3 ) 顺铂组: 5 0 t .g / k g ， 一 周两次， 腹腔注射用药。 1 . 3 细胞培养将C 6 大鼠脑胶质瘤细胞株复 苏成功后， 接种于2 5 c m“ 培养瓶中。 将复苏后的C 6 胶 质瘤细胞加人含1 0 %灭活小牛血清的I MD M培养液 中， 置于含5 0 o C 0 2 , 3 7 C 恒温密闭式孵箱中培养， 每 周传代两次。 当细胞增殖进人对数阶段， 用0 . 2 5 %胰 酶溶于磷酸盐缓冲液中消化细胞， 在显微镜下观察 到细胞开始皱缩时加人营养液中和， 反复吹打， 使之 脱壁， 1 0 0 0 r / m i n离心 5 m i n ， 弃上清， 制成细胞悬 液 4 。 体外培养的C 6 胶质瘤细胞爬片常规应用免疫 组化( S A B C法) 检测G F A P蛋白的表达， 阳性细胞 呈现胞浆棕黄色着染。 1 . 4 接种方法收集对数生长期生长状态良 好的C 6 细胞， 细胞浓度为2 . 0 X 1 0 6 / 1 0 川， 均采用立 体定向方法进行接种。根据B a r k e r 法确定切口和钻 孔位置阁， 在大鼠脑立体定位仪上选取大鼠脑右侧 尾状核区为靶点， 经1 0 %水合氯醛腹腔注射麻醉后， 在颅骨上钻孔， 孔径1 . 2 m m， 用微量注射器在立体定 向引导下接种于硬膜下5 . O m m靶点处， 将1 0 闪细胞 悬液以1 川 / m i n 缓慢注人靶区， 留针5 m i n ， 使细胞充 分沉积， 缝合头皮。每只大白鼠每天给予青霉素1 0 万单位腹腔注射， 共5 d以预防感染。 1 . 5 免疫组化法检测血管内皮生长因子采 用 S A B C法， 石蜡切片脱蜡， 3 %双氧水阻断1 O m i n , 微波修复抗原l O m i n e 1 0 %山羊血清封闭非特异性抗 原室温下6 0 m i n 。 弃去血清， 加1: 1 0 0 稀释的V E G F , 置湿盒内4 C过夜。P B S冲洗5 m i n X 3 次， 滴加生物 素化二抗工作液， 加盖湿盒内室温下6 0 m i n a P B S 振 洗5 mi n X 3 次。加人S A B C复合物， 室温下6 0 m i n , P B S 振洗5 m i n X 4 次。 D A B显色液显色。 苏木素衬 染3 m i n 。 自 来水冲洗， 酒精水化， 二甲苯透明， 中性树 胶封片。 正常脑组织为正常对照， 结果以胞核或( 和) 胞质中出现棕黄色颗粒为阳性。 1 . 6 统计分析方法采用S P S S统计分析软 件， 各组观察指标均用X 士: 表示， 然后进行t 或t ' 检 验。 2 结果 2 . 1 鼠脑胶质瘤的形态学观察对照组均可 见到较大的胶质瘤， 肿瘤呈不规则形， 边界较清晰， 瘤内可见出血和坏死。实验组 I 肿瘤与对照组大小 差别不明显; 实验组 亚 的肿瘤略有变小， 少数有出血 和坏死; 实验组 班和w的肿瘤明显变小， 边界不清， 仅有少量出血和坏死; 顺铂组的肿瘤体积缩小亦较 对照组 实验组 I 实验组 a 实验组 1 实验组N 顺铂组 8 t L g / k g 1 6 p g / k g 3 2 p g / k g 6 4 p g / k g 5 0 p g / k g 8 / 1 0 8 / 1 0 9 / 1 0 1 0 1 0 9 / 1 0 0 7 士1 1 . 8 1 士1 2 . 7 4 士 1 0 . 0 1 士 1 1 1 6 士 9 . 9 6 士 6 . 7 5' 6 4.怪 0 . 3 8 0 . 7 6 3 . 5 1 7 . 6 3 6 . 9 4 : 从n ，JA 实验组 11与对照组比较 ， P 0 . 0 5 ; 实验组N、 顺铂组与对照组 比较 二* P 0 . 0 1 3 讨论 抑胶素作为一种特异性氯离子通道阻滞剂是拟 开发抗肿瘤新药。本实验观察了在一定时间内应用 不同浓度的抑胶素以及顺铂时， 胶质瘤细胞形态变 化。 在正常情况下， 胶质瘤细胞仅有轻度的凋亡及坏 死， 而给予抑胶素及顺铂治疗后， 瘤细胞增殖明显受 到抑制， 表现为细胞缩小， 染色质浓缩靠近核膜， 细 胞核固缩， 大片坏死灶， 从而证实了抑胶素对胶质瘤 的抑制作用。 血管生长在肿瘤的演化过程中非常重要， 肿瘤 的生长与转移依赖于肿瘤血管的形成。在众多的血 管生长因子中， 血管内皮生长因子是内皮细胞特异 的有丝分裂原， 在原发肿瘤的生长、 转移肿瘤的形成 及血管生长中都起着重要作用。血管内皮生长因子 是一种多功能细胞因子， 由不同肿瘤细胞分泌， 也可 在发育中的正常细胞及组织中表达， 它是一种有效 的血管通透性诱导因子。肿瘤的生长和转移依赖于 新生血管的形成， 血管形成包括血管内皮细胞的增 殖， 迁移及细胞外基质降解等多个步骤， 为一复杂的 中风与神经疾病杂志2 0 0 6 年8 月第2 3 卷第4 期 过程。目前， 已知有多种细胞因子、 生长因子其受体 参与了血管形成的调控， 其中V E G F可能是最关键 的刺激因子。 V E G F与V E G F受体结合， 通过受体的 磷酸化， 引起一系列的信号传导， 释放各种生长因子 与细胞因子， 增加血管渗透性， 促进内皮细胞的增殖 与迁移， 最终引起血管增殖。 V E G F信号传导通路在 肿瘤的血管生长调控中非常重要， 国内外许多研究 都希望通过干扰这一通路来调控肿瘤的血管生 长 6 , 7 1 。 胶质瘤中常富含血管， 新生血管形成和( 或) 血 管内皮的增生是恶性胶质瘤一个非常典型的病变特 征 8 1 ， 胶质瘤的血管内皮增生随恶性程度增加而明 显增加， 在低级别( I 、 II ) 与高级别( 皿, N) 以及术 后不同生存情况的患者， V E G F的表达差异具有统 计学意义 9 1 。 脑胶质瘤V E G F的异常表达， 是判断脑 胶质瘤恶性程度、 血管密度以及肿瘤侵袭的重要客 观指标 1 0 。 本实验通过大鼠 C 6 胶质瘤模型研究抑胶 素对大鼠脑胶质瘤的血管内皮生长因子的影响， 通 过抑胶素与对照组及顺铂组比较， 发现胶质瘤中 V E G F呈高表达， 经抑胶素治疗后肿瘤中V E G F阳 性细胞下降， 但低浓度组与对照组差别不大， 而高浓 度组及顺铂组与对照组差别显著， 说明抑胶素对肿 瘤细胞的抑制作用可能通过V E G F而起作用， 但这 种抑制作用与抑胶素本身的浓度有关， 高浓度抑胶 素抑制作用强。 仁 参考文献 1 王伟民. 脑胶质瘤临床治疗现状与展望 J 中华神经医学杂志， 2 0 0 2 , 1 1 ( 1 ) : 8 . 2 张守涛， 郭霭光， 肖乐义， 等. 东亚钳蝎神经毒素基因B m K C T的 克隆与表达 J . 西北农林科技大学学报( 自 然科学版) , 2 0 0 2 , 1 2 ( 6 ) : 3 1 一 3 3 . 3 B a r k e r M, H o s h i n e T , G u r c a y O, e t a l . D e v e l o p m e n t o f a n a n i m a l b r a i n t u m o r m o d e l a n d i t s r e s p o n s e t o t h e r a p y w it h 1 ， 3 - B is ( 2 - c h l o r o e t h y ) n i t r o s o u r e a J . C a n c e r R e s , 1 9 7 3 , 3 3 : 9 7 6 - 9 8 6 . 4 n g e r D , F u i t a T, K i s h m o t o S , e t a l . I n h ib i t o r y a n d s u p p r e s s t u m o r g r o w t h 仁 J . N a t u r e , 1 9 9 0 , 3 4 8 ( 6 3 0 1 ) : 5 5 5 - 5 5 7 . 5 o k r y J , N e m e c e k S , A d l e r J . e t a l . I n c u l a t i o n o f C 6 c e l l s u s p e n - s io n i n t o t h e b r a i n o f a d u l t r a t s : im m u n o h is t o c h e m i c a l s t u d y J . F u n c t D e v Mo r p h o l , 1 9 9 3 , 3 ( 3 ) : 1 7 5 - 1 7 7 . 6 S e n g e r D R , v a n d e r Wa t e r L , B r o w n L F , e t a l . V a s c u l e r p e r m e a b i l- it y f a c t o r ( V P F , V E G F ) i n t u m o r b io lo g y J J . C a n c e r Me t a s t a s i s R e v , 1 9 9 3 , 1 2 ( 3 ) : 3 0 3 - 3 2 4 . 7 C o n n o l l y D T , H e u v e l m a n D M, N e l s o n R , e t a l . T u m o r v a s c u l e r p e r m e a b i l i t y f a c t o r s t i m u l a t e s e n d o t h e l i a l c e l l g r o w t h a n d a n g io - g e n e s i s J . J C l in I n v e s t , 1 9 8 9 , 8 4 ( 5 ) : 1 4 7 0 - 1 4 7 8 . 8 V a l t e r MM, H u g e l A, H u a n g H J , e t a l . E x p r e s s i o n o f t h e E t s 1 t r a n s c r i p t i o n f a c t o r i n g h u m a n a s t r o c y t o m a s i s a s s o c i a t e d w i t h F m s l ik e t y r o s i n e k in a s e 1 ( F l t 1 ) / v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 1 s y n t h e s is a n d n e o a n g io g e n e s is J . C a n c e r R e s , 1 9 9 9 , 5 9 ( 2 1 ) : 5 6 0 8 - 5 6 1 4 . E 9 李志强， 袁先厚， 文志华 V E G F与脑胶质瘤血管形成及预后意义 的初步研究 J . 中国临床神经外科杂志， 2 0 0 1 , 6 ( 1 ) : 3 0 - 3 1 . 1 0 龚俊扬， 孙奋勇， 罗其中. 人脑胶质细胞瘤中血管内皮生长因子 基因的表达研究 J 实用癌症杂志， 2 0 0 0 , 1 5 ( 3 ) : 2 7 0 - 2 7 2 . 投稿须知 本刊为中华人民共和国教育部主管、 吉林大学主办的国家核心期刊。 读者对象主要为神经内外科、 内科、 儿科的临床医师、 研究生、 进修生及基础医学的教师、 研究生。以刊载脑血管病内容为主， 兼报道其它神经内 外科的疾病及临床各科的神经系统并发症等。主要栏目有: 论著与经验总结、 论著摘要、 治疗通讯、 短篇与个 案报告、 综述、 学会建议、 学术动态、 专题讲座、 J li 床病理讨论等。 来稿需附单位核实证明， 署名作者均应对文章内容负责， 并按次序排列。如属国家或省部级以上资助的 课题， 请在首页脚注注明基金名称及批准文号， 并附基金证书复印件。 参考文献著录项目包括主要责任者( 3 名以内全部列出， 3 名以上列出前3 名后加“ 等” ， 其后不加“ 著” 、 “ 编” 、 “ 主编” 、 “ 合编” 等责任说明) 、 文献题名及版本( 初版省略) 、 文献类型及载体类型标识、 出版项( 出版地、 出版者、 出版年) 、 文献出处或电子文献的可获得地址、 文献起止页码、 文献标准编号( 标准号、 专利号) 。 来稿一律文责自负。本刊有权对来稿做文字修改、 删节， 遇有涉及原意的修改则提请作者考虑。作者如有异 议， 请事先声明。 作者投稿时请一定在稿件上注明联系电话， 自留底稿， 并请同时通过邮局汇稿件处理费2 0 元。 作者收到 回执 6个月后仍未收到稿件处理意见时， 可转投它刊并同时通知本刊撤回稿件， 切勿一稿两投。 来稿请寄: 1 3 0 0 2 1 长春市新民大街1 号 中风与神经疾病杂志 编择部， 请勿寄给个人。 谢谢广大作者、 读者对本刊的支持与合作!