热应激对大鼠TNF-α性发热及下丘脑中CAMP含量的影响.pdf

论 著 热应激对大鼠 TNF-性发热及下丘脑中 cAMP 含量的影响 刘利丹， 李 妍， 吴晓岚， 曹 宇， 赵书芬 （中国医科大学基础医学院生理学教研室， 沈阳 110001） 收稿日期： 2005 -01 -15， 修回日期： 2005 -03 -14 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （No 30270198） 作者简介： 刘利丹 （1978 - ） ， 女， 硕士， 研究方向： 体温调节， Tel： 024- 23256666-5301， E-mail： liulidan1978126. com； 赵书芬 （1946 - ） ， 女， 教授， 硕士生导师； 曹 宇 （1963 - ） ， 女， 教授， 博士生导师， 研究方向： 温热 生理， 通讯作者， Tel： 024-23256666-5301， E-mail： caoy5955 sina. com 中国 图 书 分 类 号：R-332；R 318. 03；R 329. 24；R 341； R 342. 4； R 364. 6； R 977. 6 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 09 -1054 -04 摘要： 目的 观察热应激对大鼠 TNF- 性发热效应及下丘 脑中 cAMP 含量的影响。方法 确定热应激后下丘脑 HSP70 表达的高峰时间； 观察热应激后大鼠 TNF- 性发 热效应及下丘脑 cAMP 含量的变化。结果 下丘脑中 HSP70 表达在热应激后12 h 达高峰值， 热应激后可见 TNF- 性发热幅度降低， 同时抑制下丘脑中 cAMP 的含量。结论 热应激能够减弱大鼠 TNF- 性发热效应， 且此作用很可能 是通过高表达的 HSP70 来抑制下丘脑中 cAMP 的升高而实 现的。 关键词： 热应激； 热休克蛋白 70； 肿瘤坏死因子-； 环磷酸腺 苷酸； 发热 生物体在生理或病理情况下致体温升高时通常 不会超过一定高度 （41） ， 此现象称为热限。目前 的研究显示， 体内存在有内源性解热物质如精氨酸 加压素 （Arginine vasopressin， AVP） 和 -黑色素细胞 刺激素 （-melanocyte stimulating hormone， -MSH） 等， 但有关热限的生物学机制还有许多不明之处。 当组织、 细胞或机体暴露于高温时， 温热刺激能 够诱导细胞产生热休克蛋白质 （Heat shock proteins， HSPs） ， 此过程称为热休克应答 （Heat shock reac- tion， HSR） 1。大量研究证明 HSP70 在细胞保护、 炎症反应和自身免疫等生理病理过程中起重要作 用 2， 3。 本实验观察通过热应激诱导 HSP70 表达对肿 瘤坏死因子 （Tumor necrosis factor-， TNF-） 性发 热的影响， 并检测下丘脑中环磷酸腺苷酸 （Cyclic AMP， cAMP） 含量的变化情况， 以探索 HSP70 是否 参与热限作用及可能的机制。 1 材料与方法 1. 1 实验动物与分组 健康) SD 大鼠， 体重 200 250 g， 由中国医科大学实验动物中心提供， 室温 （22 ± 2） ， 昼夜明暗节律 12 h:12 h， 基础体温 （37. 5 ±1. 0） ， 单笼饲养， 自由进食水。实验所用 试剂均用无热源生理盐水稀释。 实验前对大鼠进行测温服习 7 d。测量体温时 将温度探头插入大鼠直肠 6 cm 处， 待数值稳定后读 数， 以给药前 1 h 测得的 3 次直肠温的平均值为大 鼠基础体温。实验过程中记录大鼠体温 （0 1 h 内 每隔 15 min， 1 2 h 内每隔 30 min， 2 8 h 内每隔 60 min 测量 1 次） 。实验结束后检查插管位置， 舍 掉位置不正确的数据。 热应激处理： 将大鼠麻醉后置入42 人工气候 室中， 使其直肠温达42， 15 min。为了观察热应激 后下丘脑组织 HSP70 表达水平的变化， 分别于热应 激处理后 0、 4、 8、 12、 16 h 取材测定， 测定方法见后； 另外， 在热应激前 10 min 先将大鼠腹腔注射 HSP70 合成抑制剂放线菌酮 4 （Cycloheximide， CHX， 美国 Sigma 公司产品） ， 再在 HSP70 表达高峰时测定 HSP70， 确认 CHX 对 HSP70 合成的抑制作用。 实验分组： 将 24 只大鼠随机分成 4 组， 每组 6 只。Control 组： POA 注射 1µl 生理盐水； TNF- 组： POA 注射 TNF- 20 mg·L -1 （北京宝赛公司产品） ； HS + TNF- 组： 热应激后 12 h POA 注射 TNF- 20 mg·L -1； CHX + HS + TNF- 组： 热应激前 10 min 2. 5 mg·kg -1剂量腹腔注射 CHX， 其余处置同 HS + TNF- 组。连续观察 8 h。 1. 2 下丘脑视前区 （POA） 核团插管 用盐酸氯胺 酮 （上海第一生化药液公司产品） 和盐酸甲苯噻嗪 （美国 FAH 公司产品） 联合腹腔麻醉， 参照大鼠脑 图谱 （A Stereotaxic Atlas of the Rat Brain） ， 用立体定 位仪向一侧 POA 区 （A： 7. 8 mm； R： 1 mm； V：- 1 mm） 插入一规格为 23 号的不锈钢管， 并留置与之相 匹配的针芯， 用牙科水泥固定。术后大鼠单笼饲养， 常规喂养 1 wk 后进行实验。 1. 3 下丘脑中 cAMP 含量的测定 在 TNF- 引起 ·4501·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep； 21 （9） ： 1054 7 的发热高峰时将大鼠颈椎脱臼处死后， 快速取脑组 织于液氮中20 min， 之后 -70深冻冰箱保存待测。 取下丘脑组织 50 mg， 加 2 ml 冰醋酸， 进行匀浆， 3000 r·min -1离心 15 min， 取上清， 在 60 水浴中 用氮气将上清吹干， 之后按照 cAMP 放免检测试剂 盒 （上海中医药大学同位素室提供） 说明书进行测 定。 1. 4 采用 Western blotting 方法检测大鼠下丘脑 组织 HSP70 表达 取大鼠下丘脑组织， 冰浴匀浆， 4 离心12 000 r·min -1， 15 min， 取上清， 再进行蛋 白定量之后， 进行电泳， 转膜， 封闭， 加抗 HSP70 抗 体 （武汉博士德生物有限公司产品） ， 稀释倍数 1: 500， 二抗为羊抗兔 IgG （武汉博士德生物有限公司 产品） ， DAB 显色。 1. 5 统计学处理 数据用*x ± s 表示； 体温变化情 况采用 T （） 和体温反应指数 （Thermal response index， TRI） 分析。T 为即时体温与基础体温之差， TRI 为体温曲线与时间轴的面积积分。下丘脑组织 中 cAMP 含量用 pM·mg -1湿重表示； 各组均数间比 较用 t 检验法检验。 2 结果 2. 1 热应激处理后 HSP70 表达水平以及放线菌酮 对 HSP70 表达的影响 从 Fig 1 可以看出热应激处 理后大鼠下丘脑组织 HSP70 表达水平逐渐增多， 在 12 h 时达高峰。而给予放线菌酮后可以明显抑制 HSP70 的表达， 各时间点 HSP70 表达均明显低于热 应激组。 Fig 1 The expression of HSP70 at 0， 4， 8， 12 and 16 h after heat treatment in HS and CHX + HS groups HS represents heat stress without CHX treatment； CHX + HS repre- sents heat stress after CHX treatment. 0， 4， 8， 12 and 16 represent hours after heat stress. 10 µg total protein was loaded in each lane. The experi- ment was repeated three times with slmilar results. 2. 2 TNF- 性发热过程的体温变化 将各实验组 的各时间点的体温值与基础体温的差值 T 求出， 绘制曲线为 Fig 2。结果可见： 向大鼠 POA 区注入 TNF- 后 （TNF- 组） ， 在 15 min 内大鼠体温迅速升 高， 180 min 时达发热高峰 （T： 1. 85 ± 0. 46） ； Control 组在观察期间未见体温明显变化； HS + TNF- 组体温略有升高， 但各时间点体温变化明显低于 TNF- 组， 两者之间差异有显著性； CHX + HS + TNF- 组则未见明显影响 TNF- 性发热的幅度。 同样体温反应指数的变化趋势与 T 相似。各组体 温变化最大值 Tmax及体温反应指数 TRI3、 TRI6（分 别为 3、 6 h 的体温反应指数） 见 Tab 1。 Fig 2 The body temperature change with time in different groups * x ± s， *P 0. 05） ； 但在热应激之前给予 Tab 2 Content of cAMP in hypothalamus among different experimental groups （*x ± s， n =6） GroupContent of cAMP/ pM·mg-1 Control0. 66 ±0. 22 TNF- 1. 07 ±0. 33* HS + TNF-0. 67 ±0. 26+ CHX + HS + TNF-1. 10 ±0. 27* HS0. 65 ±0. 24+ *P 0. 05） 。 3 讨论 本实验采用 TNF- 制作了大鼠发热模型， 给药 后 15 min 内大鼠体温即有升高， 经 3 h 达发热高峰 （T： 1. 85 ± 0. 46） ， 发热持续 8 h 以上。大量 文献证实 cAMP 是内生致热源 （Endogenous pyrogen， EP） 性发热的中枢介质之一， TNF- 作为一种内生 致热源很可能是通过升高下丘脑中的 cAMP 含量致 体温升高 5。本实验结果显示 TNF- 组发热高峰 时下丘脑内 cAMP 含量的升高与对照组相比差异有 显著性 （P 0. 05） 。以上 结果提示热应激后 TNF- 性发热效应减弱， 且很可 能通过高表达的 HSP70 来抑制下丘脑内的 cAMP 含量而实现的。 关于热应激究竟如何抑制 cAMP 含量升高的机 制尚需探讨。国内李楚杰等 11认为 EP,下丘脑中 Na + / Ca2 +-,cAMP-,调定点上移， 这一路径很 可能是多种致热原引起发热的重要途径， 我们已经 知道其中的 cAMP 和 Ca2 +均为细胞内的第二信使， 因此可通过检测下丘脑内 Na + / Ca2 +比值以及研究 第二信使通路来进一步探讨 TNF- 引起 cAMP 含 量升高的机制， 从而进一步明确热应激抑制 TNF- 性发热的作用机制。此外， 近年来的研究显示 HSF1 在 HSP70 参与的许多生理病理过程中起重要作 用 12。我们将进一步结合 HSF1 在热限中作用的 研究来探讨热应激抑制 TNF- 性发热的作用机制。 参考文献： 1 Wagner M，Hermanns I，Bittinger F et al. Induction of stress pro- teins in human endothelial cells by heavy metal ions and heat shock J . Am J Physiol， 1999， 277 （5 pt 1） ： L1026 -33. 2 Moseley PL. Heat shock proteins and the inflammatory response J . Annals of the New York Academy of Sciences， 1998， 856： 206 -13. 3 Pockley AG. Heat shock proteins as regulators of the immune re- sponse J . Lancet， 2003， 362 （9382） ： 469 -76. 4 Akagawa H，Ishi A，Mizuno S. Suppression of thermotolerance development through CHX-induces negative control of stress pro- tein gene expression J . J Biochem， 1998， 123 （2） ： 226 -32. 5 佟 雷， 张 量， 吴晓岚 et al. BN 对 IL-1 致热的抑制作用及 POA 和血中 cAMP 的影响 J . 中国药理学通报，2004， 20 （11） ： 1239 -41. 6 王燕如， 肖献忠， 黄生宁 et al. 热休克基因表达对过氧化氢所 致肺泡巨噬细胞损伤的保护作用 J . 湖南医科大学学报， 1997， 22 （1） ： 1 -4. 7 Yellon DM，Latchman DS. Stress proteins and myocadial protec- tion J . J Mol cell cardiol， 1992， 24 （2） ： 113 -24. 8 Kregel K. Molecular biology of thermoregulation invited review： Heat shock proteins： modifying factors in physiological stress re- sponses and acquired thermotoleranceJ . J Appl Physiol， 2002， 92 （5） ： 2177 -86. 9 Kiang JG，Wu YY，Lin MC. Heat treatment induces an increase in intracellular cyclin AMP content in human epidermoid A-431 cells J . Biochem J， 1991， 276 （Pt 3） ： 683 -9. 10Zensho H，Nishiba A，Shimizu M et al. Heat shock protein 72 re- stores cyclic AMP accumulation after heat shock in N18TG2 cells J . Brain Res， 1998， 790 （1-2） ： 278 -83. 11王华东， 李楚杰， 屈 洋 et al. 下丘脑 Ca2 + i、 cAMP 在家兔 EGTA 性发热机制中的作用 J . 中国病理生理杂志， 1996， 12 （4） ： 402 -5. 12Pirkkala L，Nykanen P，Sistonen L. Roles of the heat shock tran- scription factors in regulation of the heat shock response and be- yond J . FASEB J， 2001， 15 （7） ： 1118 -31. ·6501·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep； 21 （9） Effects of heat stress on TNF-induced fever and the content of cAMP in rat hypothalamus LIU Li-dan，LI Yan，WU Xiao-lan，CAO Yu，ZHAO Shu-fen （Dept of Physiology，China Medical University，Shenyang 110001， China） Abstract： Aim To explore the effects of heat stress on TNF-induced fever and the content of cAMP in rat hypothalamus. Methods We examined the peak time of HSP70 expression in hypothalamus after heat stress；We studied the change of TNF-induced fe- ver and the content of cAMP in hypothalamus after heat stress. Result The maximum expression of HSP70 in hypothalamus was attained at 12 h after heat stress. Heat stress limited TNF-induced fever and decreased the content of cAMP in hypothalamus. Conclusion Heat stress can inhibit TNF-induced fever in rats， and this effect may be related with the inhibition of cAMP synthesis induced by high expression HSP70 in hypothalamus. Key words： heat stress；HSP70；TNF-；cAMP；fe- ver 牛磺酸对大鼠急性脑缺血神经元凋亡的影响 罗 璨， 郭莲军 （华中科技大学同济医学院药理学系， 湖北 武汉 430030） 中国图书分类号： R-332； R 322. 81； R 329. 25； R 348. 2； R 394. 2； R 743. 310. 53； R 977. 3 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 09 -1057 -05 摘要： 目的 从细胞凋亡的角度探讨急性脑缺血后牛磺酸的 保护作用及作用机制。方法 采用大脑中动脉线栓法 （MCAO） 和氧糖剥夺模型 （OGD） 复制在体和离体的大鼠急 性脑缺血模型； 采用荧光定量逆转录聚合酶链反应 （real-time fluorescence quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，real-time FQRT-PCR） 检测 Caspase-3/8 的 mRNA 表 达； 流式细胞术 （flow cytometry， FCM） 检测细胞凋亡； 用 Fura 2/ AM 荧光探针检测细胞内游离钙离子浓度 （intracellular calcium concentrations， Ca2 + i） 变化。结果 MCAO 可以 引起大鼠脑内 caspase-3/8 mRNA 表达上调，OGD 使培养神 经元Ca2 + i上升， 与 OGD 模型中凋亡神经元数量增多一 致。牛磺酸可以减少细胞凋亡数量， 抑制 Caspase-3 mRNA 表达上调及 Ca2 + i的升高。结论 急性脑缺血后皮质神 经元 caspase-3/8 的 mRNA 表达上调和 Ca2 + i增加可能与 脑缺血后神经元凋亡有关； 牛磺酸可以减少急性脑缺血后神 经元凋亡， 该作用与影响凋亡相关蛋白酶 Caspase-3/8 的基 因表达及 Ca2 + i水平有关。 收稿日期： 2005 -02 -24， 修回日期： 2005 -04 -07 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （No 30171082） 作者简介： 罗 璨 （1971 - ） ， 女， 博士， 研究方向： 神经药理学， Tel： 13027189144， E-mail：annyluocan yahoo. com. cn； 郭莲军 （1953 - ） ， 女， 教授， 博士生导师， 研究方向： 神经 药理学， 通讯作者， Tel： 027-83691762， E-mail：gljyl ya- hoo. com. cn 关键词： 牛磺酸； 脑缺血； 半胱天冬酶； 钙； 凋亡 脑缺血周边区神经元迟发性死亡与凋亡密切相 关， 直接影响患者的神经功能恢复和预后。凋亡相 关蛋白酶系 Caspases 和钙离子在细胞凋亡中发挥重 要作用， 其变化直接调控凋亡发生的动态过程， 决定 了细胞凋亡的进展和细胞的归宿。外源性损伤激活 Caspase-8， 随后将信息传到 Caspase-3 执行凋亡。缺 血时钙超载可以激活 calpain 途径和线粒体途径诱 导神经元凋亡 1， 2。此外 Caspases 还影响质膜钙泵 的转运， 加重钙超载 3。用钙拮抗剂 nimodipine 抑 制脑缺血后钙超载的临床实验没有达到预期效果， 原因在于降钙同时降低血压， 使未损伤区血管对缺 血区的供血减少， 加重缺血 4， 5。 在谷氨酸诱导和低氧诱导的神经元损伤中， 牛 磺酸可以降低培养的神经元内钙超载 6 8； 可以通 过 Akt/ caspase-9 途径抑制心肌细胞凋亡 9； 对高糖 诱导的人血管内皮细胞凋亡也有抑制作用 10。但 目前缺乏牛磺酸对脑缺血后神经元凋亡的作用及作 用机制的研究。鉴于钙离子和 Caspases 在凋亡发生 中的重要地位， 而且与 nimodipine 不同， 没有报道显 示牛磺酸降 Ca2 + i 同时会加重缺血损伤，我们在 大脑中动脉栓塞法 （middle cerebral artery occlusion， MCAO） 和氧糖剥夺模型 （oxygen-glucose deprivation， OGD） 中， 观测了牛磺酸对急性脑缺血后神经元凋 ·7501·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep； 21 （9） ： 1057 61