纳米炭示踪胃癌前哨淋巴结的实验研究.pdf

丧盅志篇篡孤恳怒；加·。山n 渺c 3 ，：2 8 7 2 9 。J S o u t h e a s t U n i v ( M e d S c i E d i ) 一一。、7 一。 ·2 8 7 · 纳米炭示踪胃癌前哨淋巴结的实验研究 范新，陈卫东，汤文浩，柏志斌 ( 东南大学附属中大医院普外科，江苏南京2 1 0 0 0 9 ) 摘要 目的：通过纳米炭示踪兔胃癌前哨淋巴结的对照研究，为纳米炭应用于胃癌的临床研究打下基础。 方法：兔胃癌病灶周围浆膜下分别注射9 9 T c “一S C 和纳米炭混悬液( 卡纳琳) ，记录两种示踪法检测到前哨淋 巴结( S L N ) 的例数、S L N 数目及分布情况，计算两种示踪法检测S L N 的敏感性、特异性、假阴性率和预测区域 淋巴结转移的准确性以及S L N 和非前哨淋巴结( N S L N ) 的转移率。结果：纳米炭与9 9 T c “一S CS L N 的检出率 及数目，显示S L N 分布情况、S L N 的转移率差异均无统计学意义( P 0 0 5 ) 。两种示踪法检测S L N 的敏感 性、特异性、假阴性率、准确性差异均无统计学意义( P 0 0 5 ) 。结论：纳米炭示踪胃癌前哨淋巴结效果与放 射性核素蚪T c “一s c 是一致的，但纳米碳示踪法具有显影快而持久、无放射性、使用方便等优点，可替代放射性 核素用于胃癌的临床研究。 关键词 胃癌；前哨淋巴结；纳米炭 中图分类号 R - 3 3 ；R 7 3 5 2 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 卜6 2 6 4 ( 2 0 1 0 ) 0 3 一0 2 8 7 一0 4 d o i ：1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 6 7 卜6 2 6 4 2 0 1 0 0 3 0 1 2 T h ee x p e r i m e n t a ls t u d yo nt h es e n t i n e l l y m p hn o d e0 fg a s t r i cc a n c e r b yc a r b o nn a n o p a r t i c l e ss u s p e I 塔i o ni n j e c t i o n F A NX j n ，C H E NW e j 。d o n g ，T A N GW e n 。h a o ，B OZ h i - b j n ( 珧P 州舰脚o ，鹏以s u 俘，z 胁n g 如日却洫z ，S D 眦I l e t 娩瑙妙，肫彬增2 1 0 0 0 9 ，吼i M ) A b s t r a c t o b j e c t i V e ：T oe v a l u a t et I ec l i n i c a la p p l i c a t i o n “n a n o c a r b o ni nv i s u a l i z a t i o no fs e n t i n e ll y m p hn o d e ( S L N ) i ng a s t r i cc a n c e rs u r g e r y M e t h o d s ：R a b b i tg a s t r i cc a n c e rm o d e lw 鼬e s k 出l i s h e db yt m n s p l a n t a t i o no fV x 2 c e l l si n t ot l l eg a s t r i cs e m s a N a n o c a r b o na n d9 9 T c m S Cw e r e i n j e c t e dr e s p e c t i v e l yi n t ot h eg a s t r i cw a l li nr a b b i t m o d e lo fg a s t r i cc a I l c e r 1 1 1 ec a s e s ，t I en u l b e r sa n dt h ed i s t 曲u t i o no fS L Nw e r ed o c u m e n t e d n e n 山es e n s i b i l i t y ， s p e c i f j c i t ) r ，f a l s en e g a t i v er a t ea n dt l l ea c c u r a t er a t eo fl o c a ll y m p hn o d em e t a s t a s i sw e r ec 出c u l a t e d ，t h em e l a s a s i s r a t i o0 fS L N ，N S L Nw e r ee v a l u a t e d R e s u l t s ：A sf 缸硒t h ei s o l a t i n gr a t e ，m en u m b e r s ，t h ed i s t r i b u t i o na n dt I e m e t 鹊t a s i sr a t eo fS L Nw 鹊c o n c e m e d ，n os i 印i f i c a md i H e r e n c ew 鹊s h o w nb e t w e e nt h et w og r o u p s ( P 0 0 5 ) M o r e o v e r ，m es e n s i b i l i t y ，s p e c i f i c i t y ，f 砒s en e g a t i V er a t ea I l dt l l ea c c u r a t er a t eo fl o c a ll y m p hn o d em e t a s t a s i sw e r e n o td i r e n c eb e t w e e nt w o 目r o u p s ( P 0 0 5 ) C 蚰c I I l s i o 璐：N a n o c a r b o nh 船as i m i l a re f f e c tw i t h9 9 T c m - S Ci nS L N “s u a l i z a t i o n F u l t h e n n o r e ，i tc anb eu s e di ng 嬲研cc 锄c e rg u r g e r yt or e p l a c em d i o n u c l i d e ，c o n s i d e d n gi t s q u j c k 。 d e t e c t i o n ，n o n r a d i o a c t i v i t ) ra n dc o n V e n i e n c e K e yw o r d s g a s t r i cc a n c e r ；s e n t i n e ll y m p hn o d e ；n a n o e a r b o n 收稿日期 2 0 0 9 一1 2 3 0 修回日期 2 0 1 0 ·卜2 0 基金项目 江苏省科技厅资助项目( 编号：B s 2 0 0 6 0 4 6 ) 作者简介 范新( 1 9 6 6 一) ，男，江苏海门人，主治医师，医学硕士。E 1 l I a i l ：6 【3 0 8 4 1 2 6 咖 通迅作者 陈卫东E 。m i l ：9 3 6 0 9 8 8 1 2 Q Q c 0 M 万方数据 ·2 8 8 · 东南大学学报( 医学版)2 0 l O 年6 月，2 9 ( 3 ) 前哨淋巴结( s e n t i n e ll y m p hn o d e s ，S I N ) 是指最先 接受肿瘤引流的第一组区域淋巴结。前哨淋巴结的概 念首先应用于阴茎癌患者区域淋巴结状况的评估， 此后，前哨淋巴结活检( S L N B ) 在临床上相继应用于乳 腺癌、甲状腺癌、外阴癌、头颈部肿瘤等实体肿瘤，以指 导手术方案的制定。国内外的学者也基本达成共识： 如果S L N 无肿瘤细胞转移，那么其他区域性淋巴结发 生肿瘤转移的可能性极小，不必进一步扩大手术范围； 如果前哨淋巴结有转移，则其他淋巴结转移的危险性 很大，需要扩大手术范围旧引。然而，前哨淋巴结活检 技术应用于胃癌的临床还有争议HJ 。本研究通过纳 米炭示踪兔胃癌前哨淋巴结的对照研究，为纳米炭应 用于胃癌的临床研究打下基础。 1 材料与方法 1 1 材料、试剂及仪器 V x ：细胞株( 东南大学放射与介入中心提供) ；日 本大耳兔3 6 只，雌雄各1 8 只( 东南大学医学院动物实 验中心提供，3 4 月龄，体重2 O 一2 5k g ) ；纳米炭混 悬液( 重庆莱美药业产品，平均粒径1 2 9n m ) ；放射性 核素9 9 T c “一S C ( 南京森科医药技术有限公司产品) ； y 计数器探测仪N A V I G A T O RG P s ( 美国外科公司产 品) ；显微摄像系统( 日本N i k o n 公司产品) ；普通显微 镜( O l y m p u s 公司产品) ；腹部手术器械( 东南大学医学 院动物外科提供) 。 1 2 实验方法 1 2 1 V X ：传代兔的制备将一1 9 6 液氮保存的 V x ：肿瘤细胞株按一般细胞培养技术进行复苏后，将 肿瘤细胞悬液调整成1 0 6m m q 活细胞浓度。取该悬 液0 5m l 接种于4 只种兔后腿外侧的肌肉内，2 周后 可触及肿块即制成了荷瘤兔。取荷瘤兔后腿生长活跃 的肿瘤组织，剔除筋膜和坏死组织，取边缘生长旺盛的 鱼肉样组织，剪成1 2m m 3 大小组织块用于种植。 1 2 2 兔V X ：胃癌模型的制作 剩余3 2 只大耳兔 称重，静脉麻醉后，取仰卧位固定，上腹部局部剃毛，碘 伏消毒。取上腹正中切口进腹( 切口长2 3c m ) ，找 到胃窦部，切开胃窦前壁浆肌层，将肿瘤组织块2 枚装 载于硬膜外穿刺针内，通过硬膜外穿刺针将肿瘤组织 埋植于黏膜下，结扎预置的浆肌层缝线，关闭胃壁伤 口，关腹。麻醉清醒后送动物中心喂养。 1 2 3 胃癌前哨淋巴结两种示踪方法的对照研究 动物喂养3 周后再次剖腹，统计建模成功率。于荷瘤 兔胃肿瘤病灶周围1 0c m 处选择四点，每点浆膜下分 别注射”T c “一S CO 1I I l l ( 0 2 “C i ) 和纳米炭0 1I l l l ( 5m g ) 。纳米炭注射试剂后l 5m i n 就会显示出2 4 条染色的细小淋巴管，沿着显影的淋巴管就会发现 黑染的淋巴结，最早被染色的淋巴结判定为纳米炭组 前哨淋巴结( S L N ) ，观察并记录被纳米炭黑染的前哨 淋巴结数目和分布情况。辨T c “·S C 注射后每隔1 0m i n 分别用y 闪烁计数器( N A V I G A T O RG P s ) 检测9 9 T c ” 示踪的前哨淋巴结的数目和分布情况，直至1 2 0m i n 结束；y 闪烁计数器探测放射线水平高于背景1 0 倍以 上的淋巴结判定为核素组S L N ，记录其数目及分布情 况。分别切取纳米炭和孵T c “- S C 示踪的S L N 、胃肿瘤 病灶及胃区域非前哨淋巴结( N S L N ) 作病理分析。 1 2 4 病理学检查两种方法示踪的s L N 、胃肿瘤病 灶及N s L N ( 非前哨淋巴结) 等标本经1 0 甲醛溶液固 定后，制作石蜡切片，H E 染色，观察胃肿瘤病理特征、 S L N 的转移及N S L N 的转移。 1 3 统计学处理 实验数据以元±s 或百分率表示，组间计量资料比 较采用f 检验；计数资料比较进行卡方检验( 或F i s h e r s e x a c t 检验) 。应用S P s S1 3 Of o rW i n d o w s 统计软件完 成，尸 o 0 5 ) 。 2 3 两种示踪法检测S L N 的正确性比较 见表2 。 表2两种示踪法检测S L N 的正确性比较 T h b2 C ：咖p a s 蛐O f 伽帅r e c 臼l e 鲻b e h 嗍咖蛔c e r m e t h o d st a r g e t i n gS L N 注：括号内为百分比 表2 显示，两种示踪法检测S L N 的敏感性、特异 性、假阴性率和预测区域淋巴结转移的准确性差异均 无统计学意义( P 0 0 5 ) 。 2 4 纳米炭示踪的S L N 黑染的程度及淋巴管显影 情况 见图l 、2 。 图l 术中所见的黑染淋巴结 n g lB I 舵k l 严p hn o d 髓i n t h eo p e n 蛐 图2 术中所见的黑染淋巴管 n g2 B l a c kl y m p h 娟璐t u b 皓i no p e m t 萱帅 S L N 完全黑染2 8 个，部分黑染8 个；完全黑染 S L N 占S L N 的百分比为7 7 8 。 2 5 两种示踪法的检测S L N 所需时间 纳米炭法检测S L N 所需时间为( 4 0 6 ±2 1 2 ) T I l i n ； 核素法( 2 8 1 7 ±1 3 4 8 ) m i n ，两者差异有统计学意义 ( P O 0 1 ) 。其中纳米炭示踪的S L N 在实验观察的 1 2 0m i n 内无明显褪色。 2 6 S L N 与非前哨淋巴结( N S L N ) 转移率比较 两种示踪法共检测S L N 共4 l 枚，其中转移S L N 1 8 枚，转移率为4 3 9 ；2 7 只兔共切取N S L N2 4 4 枚， 其中转移淋巴结3 9 枚，转移率1 6 0 ，两者比较差异 有统计学意义( P 0 0 1 ) 。 3 讨论 在我国胃癌发病率居消化道恶性肿瘤的首位，并 有上升趋势。手术是目前惟一有可能治愈胃癌的方 法。胃癌的预后直接与肿瘤浸润程度、淋巴结转移或 肝和腹膜转移等因素相关“ J 。在日本，根据消化道肿 瘤的外科和病理学研究，以上因素已作为肿瘤分期的 标准；其中淋巴结转移在生存率的多因素分析中是一 重要的影响因素叮J 。术中是否彻底清除了转移淋巴 结是影响手术疗效的关键，临床上常见有两种倾向： ( 1 ) 大范围的淋巴结清扫，切除很多没有转移的无辜 淋巴结及其组织，造成并发症增多；( 2 ) 切除范围不 够，造成转移淋巴结残留，导致日后很快复发。如何根 据每个个体确定科学合理的淋巴结清扫范围，这是外 科医师共同关注的问题，也是胃癌外科的难点所在。 前哨淋巴结的概念为其提供了理论依据。 目前，前哨淋巴结有两种常用的检测方法：一种放 射性核素法，即使用放射性核素标记物作为示踪剂，术 中y 计数器探测仪检测手术区域，探测放射线水平高 于背景l o 倍以上的淋巴结作为前哨淋巴结，术后7 计 数器探测仪检测术后标本。此法简单，放射性核素在 前哨淋巴结内停留时间较长，并且可记录，显像灵敏度 较高。但M a s a h i r o 等 8 1 则认为，由于受到原发病灶放 出的y 射线的影响，放射性核素示踪很难明确检测出 前哨淋巴结；另外患者和医护人员要接触放射性物质； 放射性物质来源困难，使用受限制。另一种是染色剂 染色显影法，常用的染色剂有亚甲蓝、专利蓝、i s o s u 孤 b l u e 等染料。染色显影法简单，可以清晰显示淋巴管 和淋巴结，具有实时观察的优点，且医患无须接触放射 性同位素，不需要特殊的设备和仪器，显像时间短而且 直观，可以指导术中手术操作，医疗成本低。但染色显 影法存在染色需较长的时间且着色不充分、染色剂淋 巴结内滞留时间短、淋巴特异性差、术中使用会造成淋 万方数据 东南大学学报( 医学版) 2 0 1 0 年6 月，2 9 ( 3 ) 巴管、组织间隙广泛染色等缺点，而且有1 5 的患者 对染色剂过敏。 纳米炭混悬注射液为淋巴示踪剂，具有吸附性能 优良、淋巴靶向性极高、组织内滞留性和示踪速度良 好、不进入血液循环等特点，其团粒粒径平均为 1 2 9n m 。注射到肿瘤局部组织后，可被巨噬细胞吞 噬。同时，由于毛细血管内皮细胞间隙为2 0 一5 0n m ， 而毛细淋巴管内皮细胞间隙为1 2 0 5 0 0n m ，且基膜 发育不完全，故纳米炭粒不进人血管，迅速进人淋巴 管，滞留集聚到淋巴结，数分钟内能使引流淋巴结明显 而持久地染色，便于术中辨认，减少组织损伤，增加清 除淋巴结的数目，减少肿瘤复发的几率。在这些被黑 染的淋巴结中，有些淋巴结虽然直径在0 2 0 3c m ， 但已有转移，这些微小的淋巴结在常规根治术中易被 忽略，而采用本方法很容易找到而被清除。本实验中 纳米炭与放射性核素9 9 T c - S C 在胃癌S L N 的检出数 目、检出率、分布规律、敏感性、特异性、假阴性率和预 测区域淋巴结转移的准确性等方面无明显差异；纳米 炭淋巴结平均显影时间为( 4 0 6 ±2 1 2 ) m i n ，显影时 间明显较9 9 T c “- S C 缩短，且淋巴结染色满意，完全黑染 率为7 7 8 ；操作较简单，医患无须接触放射性核素， 不需要特殊的设备和仪器，显像直观，能够替代放射性 核素用于胃癌前哨淋巴结的检测，更适合于手术中 使用。 胃周淋巴结根据J R s G C 规则主要分为3 站1 8 组，这些不同分组的淋巴结虽分别代表胃不同区域的 淋巴回流，但其互相成网状沟通。一般情况下，胃淋巴 由第1 站向第2 、3 站引流，但胃癌的淋巴引流是复杂 的，S L N 有随机性、多向性和跳跃性的特点。S a n o 等旧1 的研究表明，首先转移的淋巴结仅6 2 在病灶周 围，“跳跃转移”的几率高达1 3 ，且淋巴回流径路可 因人和病灶而异，使得应用示踪剂定位的胃癌S L N 分 布难以预测。本实验2 7 只实验兔中S L N 仅位于N 。 的占6 5 2 ，仅位于N ：的占1 3 6 ，与上述结果相 仿，也存在“跳跃转移”。而s L N 的定义是首先接受肿 瘤淋巴液，最早转移的淋巴结，均可认为是S L N 。淋巴 结转移的“跳跃性”只是相对于解剖位置而言。因此， 我们理解，与其说s L N 是一形态、解剖学概念，不如说 是功能、外科学概念。当首先转移的淋巴结出现在N ： 或N ，时，功能上其实相当于N ，。如果S L N 检测能发 现胃癌异常解剖部位的“跳跃性”转移淋巴结，将对指 导胃癌手术切除范围、提高胃癌分期准确性有重要意 义。G e r v a s o n i 等¨训研究发现，如果区域淋巴结转移的 机会 5 ，不做广泛的淋巴结清扫是可以接受的，胃 癌的S L N B 允许有5 的假阴性率。本实验S L N 转移 率明显高于N s L N 转移率，说明胃癌淋巴结转移最易 发生在S L N 。因此，本研究也证实了S L N 概念同样适 用于胃癌，可在术中通过示踪剂准确识别，并能准确反 映胃癌周围淋巴结的转移情况。 根据纳米炭对淋巴结的高亲和性和炭的吸附性 能，近来有学者将其吸附化疗药物后，作为淋巴靶向化 疗，功能性缓释给药。这能提高淋巴结内化疗药物的 浓度，更好地发挥对癌细胞的杀灭作用，克服化疗药物 全身使用所致的严重毒副反应；术前及术中使用可防 止医源性肿瘤扩散，对失去手术机会的晚期或复发癌 肿可作定向化疗，改善症状，提高生活质量，延长生命。 参考文献 1 c A B A N A sRM A n 印p r o a c hf o rt h et r e a t m e n t o f p e n i l e c a r c i n o 眦 J c a n c e r ，1 9 7 7 ，3 9 ( 2 ) ：4 5 6 - 4 6 6 2 o T ADM I si n 呻r a t i v eI y T n p hn o d e 眦p p i n g 蚰ds e n t i n e l 1 y m p hn o d eb i o p s yf o rc 0 1 0 r e c t a ：Ic a r c i n o m an e c e s s a r y ? 【】 A n nS u r g0 n c o l ，2 0 0 0 ，7 ( 2 ) ：8 2 8 4 3 刘奇，左文述，王永胜，等乳腺癌哨位淋巴结临床意义的 研究 J 肿瘤防治杂志，2 0 0 0 ，7 ( 3 ) ：2 4 7 - 2 5 3 4 程黎阳，钟世镇，黄宗海胃癌前哨淋巴结的回顾性研究 J 中华胃肠外科杂志，2 0 0 3 ，6 ( 2 ) ：1 0 5 5 N I s H lM ，0 M O R IY ，M 1 w AK ，e ta 1 J a p a n e c l 鹊s i f i c a t i o n0 f 群塔t r i cc a r c i n o m a M J 印a n e s er e s e a r c h8 0 c i e t yf o rg 鹪t r i c c a n c e r ( J R S G c ) T o k y o ：K a n e h 蝴，1 9 9 5 ：6 1 5 6 s A N OT ，H O L L 0 w 0 0 DA E a r l yg 酷t r i cc a I l c e r ：d i a g n 0 8 i sa n d l e s si n v 鹊i v e a t m e n t s J s c a n dJs u r g ，2 0 0 6 ，9 5 ( 4 ) ： 2 4 9 - 2 5 5 7 吴星宇，席时富胃癌病理学的变化及其与外科治疗的关 系 J 现代医学，2 0 0 4 ，3 2 ( 6 ) ：3 9 9 4 0 0 8 H I R A L s u K AM ，M I Y A s H I R oI ，I s H I K A w AO ，e t a 1 A p p l i c a t i o no fs e n t i n e ln o d eb i o p 8 yt og a s t r i cc 肋c e rs u r g e r y J s u r g e r y ，2 0 0 l ，1 2 9 ( 3 ) ：3 3 5 3 4 0 9 s A N 0T ，K A T A IH ，s A s A K 0M ，e ta 1 G a s t r i cl y m p h o 弹p h y 蛐dd e t e c t i o no fs e n t i n e ln o d e s J R e c e n tR e s a l i sc a n c e r R e s ，2 0 0 0 ，1 5 7 ( 2 ) ：2 5 3 之5 8 1 0 G E R V A s 0 N IJE ，T A N E I Ac ，c H u N GMA ，e ta 1 B i o l o 百c 柚dc l i n i c a ls i 印i f i c a n c eo fl y m p h a d e n e c t o m y J s u r gc l i n N o r t hA m ，2 0 0 0 ，8 0 ( 6 ) ：1 6 3 1 - 1 6 7 3 万方数据