紫外交联实验筛选HCV RNA结合蛋白的应用.pdf

*基金项目：国家自然科学基金资助面上项目 （30170824） 作者单位：第四军医大学预防医学系流行病学教研室， 西安 710033 作者简介：张景霞 （1966 - ） ， 女， 河南长葛人， 高级实验师， 本科， 研 究方向： 病毒性肝炎。 文章编号：1001-0580 （2006） 03-0289-02中图分类号： R 512.6 文献标识码：A 【论著】 紫外交联实验筛选 HCV RNA 结合蛋白的应用* 张景霞， 苏海霞， 李端， 闫永平， 门可， 卢娟， 王安辉 摘要：目的选择一种用于筛选与丙型肝炎病毒 （HCV） RNA 核心区结合的细胞蛋白质分子较佳方法。方法 用体外转录的方法制备地高辛标记 （DIG）- HCV RNA； 从 HepG2 细胞中提取细胞蛋白质分子。分别用紫外交联实验 （UV） 和凝胶迁移实验 （EMSA） 筛选 HepG2 细胞中可与 HCV RNA 结合的蛋白质分子。结果2 种实验方法均可检测到 细胞蛋白质分子与 HCV RNA 结合， 但凝胶迁移实验结果所见 DIG - RNA 信号比较弥散， 而紫外交联实验的结果可见 比较清晰的 RNA - 结合蛋白条带。结论紫外交联实验是用于筛选 HCV - RNA 结合蛋白的首选方案。 关键词：紫外交联； 凝胶迁移； RNA 结合蛋白 Ultraviolet cross-linking assay in screening of cellular proteins binding to Hepatitis C virus RNAZHANG Jingxia， SU Haixi- a， LI Duan， et al . Department of Epidemiology， Faculty of Preventive Medicine， the Fourth Military Medical University （Xi an 710033， China） Abstract： ObjectiveTo select a better method for screening of cellular proteins binding to Hepatitis C virus （HCV）RNA. MethodsDIG-labeled RNA （DIG-RNA） transcripts were prepared by in vitro transcription.Cytoplasmic extracts were prepared from human hepatoma cells （HepG2） . Ultraviolet （UV） cross-linking assay and electrophoretic mobility shift assay （EMSA） were used to screen the cellular proteins that would bind to HCV RNA.ResultsBoth UV cross-linking assay and EMSA detected that there were proteins binding to HCV RNA.The signals of DIG-RNA detected by EMSA were dispersing and unclear.The results of UV cross-link- ing assay were clear RNA-binding protein bands.ConclusionUV cross-linking assay is a preferred method for screening of cellular proteins binding to Hepatitis C virus RNA and other RNA molecules. Key words：UV cross-linking； electrophoretic mobility shift assay （EMSA） ； RNA-binding protein 丙型肝炎病毒 （HCV） 的基因组是由 9000 多个核苷酸组 成的单股正链 RNA 分子， 结构上可分为 5 端非翻译区、 一个 长的蛋白编码区 （ORF） 和 3 端的非翻译区。ORF 由具有不同 功能的基因构成， 可翻译出核心蛋白 （C 蛋白） 等 10 多种蛋白 质。HCV C 区 RNA 所编码的核心蛋白能够与多种宿主蛋白 结合， 在宿主细胞中发挥多种作用 1。但对于 HCV C 区 RNA 结合蛋白的研究报道较少。本研究利用蛋白质分子与 RNA 的相互作用， 通过对紫外交联实验和凝胶迁移实验的比较， 寻 找一种简便、 特异、 重复性好的实验方法用于筛选人肝细胞中 可与 HCV - RNA 核心区结合的蛋白质分子， 为探讨细胞蛋白 对 HCV C 蛋白表达的影响和机制提供实验依据。 1材料与方法 1.1主要试剂和材料重组质粒 PinpointTMT - HCV 2， 包含 HCV core 区 （1 - 503nt） cDNA 片断， 由本室构建； HepG2 细胞株 由本室保存； 质料提取试剂盒购自华舜公司： 内切酶、 T7RNA 聚合酶均购自 TAKARA 公司； 地高辛 （DIG） 标记、 检测试剂购 自 Roche 公司； 细胞培养基购自 GIBCO 公司。 1.2方法 1.2.1细 胞 总 蛋 白 提 取HepG2 细 胞 用 胎 牛 血 清 培 养 液 （DMEM） 液体培养基于 37 CO2培养箱内培养， 培养至对数 生长期时， 收集细胞， 用预冷的 0.01 mol/ L pH 7.4 磷酸盐缓冲 液冲洗 2 次， 将细胞转移至离心管中， 3 000 r/ rnin 离心 10 min， 弃上 清 后 加 入 1 ml 细胞 裂 解 液 （50 mmol/ L Tris pH 8.0， 10 mmol/ L 乙 二 胺 四 乙 酸 （EDTA） ， 150 mmol/ L NaCl， 1% NP40， 0.1%十二烷基硫酸钠 （SDS） ， 1 mmol/ L 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 和 1 × protease inhibitor cocktail 用前加入） 冰浴 30 min， 4离心 10 min， 吸取上清， 分装保存于 - 80 冰柜， 取少量 Bradford 法 测定蛋白浓度。 1.2.2质粒的线性化和体外转录制备 RNA 探针用质粒提 取试 剂 盒 提 取 质 粒 DNA， 经 Bgl酶 切， 使 质 粒 线 性 化。 0.7%琼脂糖凝胶电泳回收、 纯化后作为体外转录的 DNA 模 板， 用 T7RNA 聚合酶体外转录同时 DIG 标记 RNA 探针， 具体 操作按 DIG - NTP Mix 说明书进行。 1.2.3紫外交联试验参照文献 3 进行。 1.2.4凝胶迁移实验参照文献 4 进行。 2结果 2.1RNA 的体外转录产物 （图 1） 线性化的质粒经体外转 录后， 可见约 1400nt 的 HCV - RNA 转录产物。 图 1 体外转录 HCV 核心区 RNA 片断 2.2紫外交联实验 （图 2） 在紫外线的作用下， DIG 标记的 HCV - RNA 与细胞蛋白提取物结合， 经 SDS - 10% 聚丙烯酰 胺凝胶 （PAGE） 电泳分离， 可见 2 条清晰的蓝紫色结合蛋白条 带， 以不加 HCV RNA 和不加细胞蛋白提取物的反应体系作为 对照， 均未出现阳性蛋白条带。分别以不同浓度的蛋白提取 物 （0， 4， 8， 16， 32µg） 与定量的 DIG 标记的 HCV - RNA （2 pmol） 982中国公共卫生 2006 年 3 月第 22 卷第 3 期Chin J Public Health Mar 2006 Vol . 22 No . 3 结合， 可以看到随着蛋白浓度的增加， RNA 与蛋白结合的量 也随之增多 （图 3） 。由此可见， 试验筛选到 HepG2 细胞中有 2 个蛋白分子可以与 HCV RNA 结合， 其分子量约为 50 70KD。 1： 未加细胞蛋白提取物， 仅有 DIG - RNA； 2： HCV - RNA 与细 胞蛋白的结合 （无 UV 照射） ； 3： HCV - RNA 与细胞蛋白的结 合 （UV 照射 30 min） ； 4： 未加 HCV RNA， 仅有细胞蛋白提取物 图 2 HCV 核心区 RNA - 蛋白紫外交联实验结果 1： 细胞蛋白提取物 0µg； 2： 细胞蛋白提取物 4µg； 3： 细胞蛋白 提取物 8µg； 4： 细胞蛋白提取物 16µg； 5： 细胞蛋白提取物 32 µg 图 3 不同蛋白浓度的 HCV 核心区 RNA - 蛋白结合产物 2.3凝胶迁移实验DIG 标记的 HCV - RNA 与细胞蛋白提 取物中蛋白质分子结合后， 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 电泳 结果显示： 在 NC 膜上可见边缘模糊比较弥散的 DIG 阳性信 号， 且随着 DIG - HCV - RNA 加入量的增多 （1， 2， 4 pmol） 阳性 信号而增强， 未加 DIG - HCV - RNA 的空白对照没有出现阳 性信号， 从 DIG - HCV - RNA 分子迁移率可以初步判断可能 有细胞蛋白与 HCV - RNA 结合， 但 DIG - RNA 条带的特异性 不是很强 （图 4） 。 图 4 RNA 凝胶迁移实验结果 3讨论 国外学者 Yen JH 等 5采用凝胶迁移实验筛选到 HCV RNA 结合蛋白并用紫外交联实验进行了验证。Fan 等 6也采 用凝胶迁移实验证实了 HCV C 蛋白可与其 5 NCR 区域特异 结合； Ito 等 3， 4采用紫外交联实验筛选到 2 个未知蛋白 （50 70KD） 与 HCV 核心区 RNA 结合， 并用凝胶迁移实验进行了验 证， Chung 等 7也采用紫外交联技术证实了一种蛋白质分子 能与 HCV3 - NTR 进行特异结合。国内对于 HCV RNA 结合 蛋白的研究一般采用酵母双杂交技术 8或紫外交联实验筛选 RNA 结合蛋白 9， 而较少使用凝胶迁移实验。 试验结果表明， 凝胶迁移实验由于其阳性信号比较弥散， 结合了蛋白的 DIG - RNA 分子与未结合的 HCV - RNA 分子之 间界限不明显， 只是阳性信号稍强一些， 没有特异性较强的条 带出现， 无法确定结合蛋白分子量的大小， 只能初步判断是否 有蛋白结合， 而不能确定结合蛋白的数量和分子量。本实验 中筛选结果不理想原因可能为：（1） 试验中所用细胞蛋白提取 物为粗提物， 混有许多其它如 DNA/ RNA 等成分影响结果； （2） 在实验过程中 DIG - RNA 可能有部分降解， 导致 DIG 信号 比较弥散。而紫豌交联实验由于其可见 2 条清晰的蛋白条 带， 不但可以判断是否有细胞蛋白与 HCV RNA 结合， 且能初 步判断筛选到的蛋白分子量的大小。从操作过程看， 由于 RNA 是用 DIG 标记， 2 种方法都需将电泳后的凝胶转膜后检 测膜上的 DIG 标记信号。但在凝胶迁移实验中， 从始至终都 要特别注意防止 RNase 的污染， 很容易出现 DIG - RNA 的降 解， 会对结果造成较大影响， 因而从试剂、 仪器的准备到实验 的实际操作过程都需要特别的谨慎。紫外交联实验中， RNA - 蛋白结合物经紫外线照射形成共价结合后， 即可用 RNase A 将未结合的 RNA 消除掉， 之后的的实验过程相当于对蛋白进 行电泳、 转膜， 污染和降解的可能性较小， 最后检测到的蛋白 条带清晰、 锐利、 明确。因此， 我们认为， 紫外交联实验可以作 为筛选细胞内能结合 HCV RNA 的蛋白质分子的首选方案， 并 可用于其它 RNA 结合蛋白的筛选研究。而凝胶迁移实验只 能作为辅助性的定性试验， 可以将紫外交联实验所筛选到的 蛋白纯化后与 RNA 分子结合， 进行凝胶迁移实验， 验证其与 RNA 结合的特异性。 参考文献 1 成军 .丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白的研究进展 J . 国外医 学病毒学分册， 2000， 7 （4） ： 123 - 127. 2 赵小宁， 徐德忠， 惠宏襄， 等 . 中国人丙型肝炎病毒 2a 型基因组 C 区基因 cDNA 的克隆及序列分析 J . 第 四 军 医 大 学 学 报， 1998， 19 （1） ： 66 - 69. 3 Ito T， Lai MM. Determination of the secondary structure of and cellular protein binding to the 3- untranslated region of the hepatitis C virus RNA genome J .J Virol， 1997， 71 （11） ： 8698 - 8706. 4 Ito T， Lai MM. An internal polypyrimidine-tract-binding protein-binding site in the hepatitis C Virus RNA attenuates translation， which is relieved by the 3 -Untranslated sequence J . Virology， 1999， 254 （2） ： 288 - 296. 5 Yen JH， Chang SC， Hu CR， et al. Cellular proteins specifically bind to the 5 -noncoding of hepatitis C virus RNA J .Virology， 1995， 208 （2） ： 723 - 723. 6 Fan Z， Yang QR， Twu JS， et al.Specific in vitro association between the hepatitis C viral genome and core protein J .J Med Virol， 1999， 59 （2） ： 131 - 134. 7Chung RT， Kaplan LM. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein I （hn- RNP - I/ PTB） selectively binds the conserved 3terminus of hepatitis C viral RNA J . Biochem Biophys Res Commun， 1999， 254 （2） ： 351 - 362. 8 邵清， 成军， 白雪帆， 等 . 酵母双杂交技术筛选白细胞中 HCV 核 心蛋白结合蛋白基因 J . 世界华人消化杂志， 2004， 12 （1） ： 86 - 88. 9 黄开红， 邓庆丽， 王巍， 等 .形成丙型肝炎病毒副链复制体的相关 蛋白的分析 J .中山医科大学学报， 2002， 23 （5） ： 348 - 335. 收稿日期：2005-06-13 （蔡天德编辑刘铁校对） 092中国公共卫生 2006 年 3 月第 22 卷第 3 期Chin J Public Health Mar 2006 Vol . 22 No . 3