线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型的研究.pdf

江西医学院学报2 0 0 9 年第4 9 卷第8 期 A c t a A c a d e m i a eM e d i c i n a eJ i a n g x i2 0 0 9 ，V o l4 9 ，N o8 线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型的研究 陈卫松。，朱晓钢2 ( 1 南昌大学研究生院2 0 0 7 级；2 江西省人民医院干部病房神经内科，南昌3 3 0 0 0 6 ) ·1 1 · 摘要：目的探索一种用线栓法制作稳定的大鼠单侧大脑中动脉阻塞( M C A O ) 模型的简易方法。方法 不分离 结扎翼腭动脉( P P A ) ，用3 种不同的线栓即头端未处理的鱼线、指甲油处理的鱼线和特制的尼龙线栓，分别经大鼠 的颈总动脉( C C A ) 和颈内动脉( I C A ) 插线。分析不同种类线栓和插线部位对大鼠单侧M C A O 手术的插线时间及建 立M C A ( ) 模型成功牢的影响；观察2 种不问插线部位和结扎颈外动脉( E C A ) 与否对大鼠M C A O 建模成功率的影 响。结果3 种线栓的插线时间比较差异无统计学意义( P 一0 3 9 7 ) ；未处理的鱼线的建模成功率低于指甲油处理 的鱼线和特制的尼龙线栓( P 一0 0 0 1 ) ，而后2 种线栓的建模成功率比较差异无统计学意义( P = 0 6 2 6 ) ；经C C A 插线时间明显低于经I C A 插线时间( P 一0 0 0 2 ) ；两者的建模成功率比较，差异无统计学意义( P 一0 4 4 1 ) ；2 种不 同部位插线的建模成功率比较及结扎E C A 和未结扎E C A 的建模成功率比较，差异均无统计学意义( 均P = 0 6 9 4 ) 。结论采用指甲油处理头端的鱼线。结扎E C A 经C C A 插线可以简单快捷地建立稳定的大鼠单侧M C A O 模型。 关键词：线栓法；大脑中动脉阻塞；模型；动物，实验；大鼠 中图分类号：R 一3 3 2文献标识码：A文章编号：1 0 0 0 - - 2 2 9 4 ( 2 0 0 9 ) 0 8 - - 0 0 1 1 - - 0 4 R e s e a r c ho nM a k i n gM i d d l eC e r e b r a lA r t e r yO c c l u s i o n M o d e li nR a t sb yU s i n gS u t u r eE m b o l i z a t i o nM e t h o d C H E NW e i - s o n 9 1 ，Z H UX i a o - g a n 9 2 ( 1 2 0 0 7G r a d eo fM e d i c a lD e p a r t m e n to fG r a d u a t eS c h o o l ；2 D e p a r t m e n to fN e u r o l o g y ， C a d r eW a r d s ，J i a n g x iP e o p l e sH o s p i t a l ，N a n c h a n g3 3 0 0 0 6 ，C h i n a ) A B S T R A C T ：O b j e c t i v e T oe x p l o r et h es i m p l ea p p r o a c ht om a k et h es t e a d ym i d d l ec e r e b r a la r t e r y o c c l u s i o n ( M C A 0 ) m o d e l i nr a t sb yu s i n gs u t u r ee m b o l i z a t i o nm e t h o d M e t h o d sI nt h i ss t u d y ，w e d i d n ' ti s o l a t ea n dl i g a t et h ep t e r y g o p a l a t i n ea r t e r y ，a n du s e dt h r e ek i n d so fs u t u r e - t h eu n t r e a t e d f i s h i n gt h r e a d ，t h ef i s h i n gt h r e a dw i t hi t st e r m i n a t i ot r e a t e dw i t hv a r n i s ha n dt h es p e c i a l l ym a d e n y l o ns u t u r e ，i n s e r t i n gf r o mt h ec o m m o nc a r o t i da r t e r y ( C C A ) a n dt h ei n t e r n a lc a r o t i da r t e r y ( I C A ) r e s p e c t i v e l y ，t oa n a l y z et h ee f f e c to fd i f f e r e n tk i n d so fs u t u r e sa n di n s e r t i n gp o s i t i o n st ot h e t i m eo fi n s e r t i o na n dt h esuccessr a t eo ft h em o d e lb u i l d i n g ；W eo b s e r v e dt h ee f f e c to ft h et w od i f - f e r e n tp o s i t i o n so fi n s e r t i n gt h es u t u r ef r o ma n dl i g a t i n gt h ee x t e r n a lc a r o t i da r t e r y ( E C A ) o rn o t t ot h es u c c e s sr a t eo ft h em o d e lb u i l d i n g R e s u l t sT h et i m eo fi n s e r t i o na m o n gt h et h r e ek i n d so f s u t u r e sh a v en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( P 一0 3 9 7 ) T h eu n t r e a t e df i s h i n gt h r e a d ss u c c e s sr a t eo f t h em o d e lb u i l d i n gw a sl o w e rt h a nt h ef i s h i n gt h r e a d ' sw i t hi t st e r m i n a t i ot r e a t e dw i t hv a r n i s ha n d t h es p e c i a l l ym a d en y l o ns u t u r e s ( P = 0 0 0 1 ) ，a n dt h er a t e sb e t w e e nt h el a t t e rt w oh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( P 一0 6 2 6 ) T ' h et i m eo fi n s e r t i o nf r o mC C Ai so b v i o u s l ys h o r t e rt h a nt h a tf o r m l C A ( P 一0 0 0 2 ) ；A n dt h es u c c e s sr a t e sb e t w e e nt h et w oh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( P 一 0 4 41 ) ：T h eS u c c e s sr a t e so ft h em o d e lb u i l d i n gb e t w e e nt h et w od i f f e r e n ti n s e r t i n gp o s i t i o n sh a d 收稿日期：2 0 0 9 - - 0 6 2 6 作者简介：陈卫松( 1 9 8 2 一) ，男，硕士研究生，主要从事神经病学研究。 通信作者：朱晓钢，女，主任医师。E - m a i l ：z x g s y p s j y a h o o t o m c a 。 万方数据 · 1 2 - n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( P 一0 6 9 4 ) a n da l s ot h er a t e sb e t w e e nl i g a t i n gt h eE C Aa n dn o n l i g a t i n g t h eE C A ( P 一0 6 9 4 ) C o n c l u s i o n A p p l y i n gt h ef i s h i n gt h r e a dw i t hi t st e r m i n a t i ot r e a t e dw i t h v a r n i s h ，l i g a t i n gt h eE C Aa n di n s e r t i n gf r o mt h eC C Ac o u l db u i l ds t e a d yu n i l a t e r a lM C A Om o d e l i nr a t ss i m p l ya n dq u i c k l y K E YW O R D S ：s u t u r ee m b o l i z a t i o nm e t h o d ；m i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ；m o d e l ； a n i m a l s ，l a b o r a t o r y ；r a t s 大脑中动脉供I I f L 区是脑梗死最常发生的部位， 研究急性脑缺血后脑组织损伤的病理乍理变化，有 赖于建立稳定可靠的动物卒中模型，常见的模型是 大鼠大脑中动脉阻塞( m i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u - s i o n ，M C A o ) 模利。M C A O 模型的制作方法有很 多，目前国内外最常用的是线栓法。1 9 8 6 年，K o i - z u m iJ 等首次报道了通过无需开颅的线栓法制 作M C A O 模犁，1 9 8 9 年L o n g aE Z 等 2 1 报道了对 这种方法的改进，此后该法得到了广泛的应用。但 由于线栓法制作M C A O 模型存在众多影响因素， 至今仍缺乏统一的标准。 本研究采用线栓法建立大鼠单侧永久性 M C A 0 模型，并对有关影响因素进行分析，探索一 种简易制作稳定、可靠的M C A O 模型的方法。 1 材料与方法 1 1 实验动物 健康雄性S D 大鼠8 0 只，S P F 级，质量2 4 0 2 8 0g ，由江西省中医学院动物实验中心提供。 1 2 线栓制备 准备3 种线栓：( 1 ) 未处理的龟线：从渔具店购 买的柔韧性较好的单丝尼龙鱼线，鱼线直径为 0 2 4m m ，切成3 5m m 长的一段，插入端用手术刀 片垂直龟线切下，使横切面平整，切缘光滑；( 2 ) 指甲 油处理的鱼线：将部分鱼线的插入端均匀涂抹透明 指甲油略成球状，千分尺测得球体直径须为 0 3 2m m 左右，显微镜下观察球体须光滑无毛刺； ( 3 ) 特制的尼龙线栓：从北京沙东生物技术有限公司 购买的尼龙线栓，其头端经显微操作特殊烧制而成， 光滑且大小一致，线身直径0 2 4m m ，线头直径 ( 0 3 2 ±0 0 2 ) m m 。3 种线栓长度均为3 5m m ，线 身略微弯曲J ，两端的直线距离为3 3m m 左右，在 1 8 、2 0 和2 5m m 处作标记，并在离非插入端5m m 处折成一个朝向弯曲侧的钩，以便识别弯曲方向。3 种鱼线均经洒精消毒后浸泡于肝素钠中备用。 1 3 主要材料 动物手术的器械主要有：显微剪、显微镊、微血 管夹等；自制细铁丝拉钩，外套输液器前部的软管； 4 一。和5 0 的手术线；2 的红四氮唑( T T C ，北 京拜尔迪生物公司) 磷酸盐缓冲液；1 0 的水合氯 醛。 1 4 实验方法 1 4 1 动物分组 本实验分两部分：实验一：将4 8 只大鼠随机 分成3 组，每组1 6 只，分别用3 种不同的线栓，每组 中8 只插线栓部位在大鼠的颈总动脉( c o m m o nc a r o t i da r t e r y ，C C A ) ，另8 只在颈内动脉( i n t e r n a l c a r o t i da r t e r y ，I C A ) 。实验二：将3 2 只大鼠随机 分为2 大组，每组1 6 只，一组经C C A 插线，另一组 经I C A 插线，每组都分为2 小组，结扎E C A 和不结 扎E C A 的各8 只。 1 4 2 手术建模 ( 1 ) 麻醉：按0 3 5m l 。l o og 4 经腹腔注射1 0 水合氯醛，6 1 0m i n 麻醉完全，仰卧不能自己翻 正。( 2 ) 固定：大鼠仰卧位，剪去手术区的毛发，于手 术台上固定大鼠门齿及四肢，消毒术区皮肤，铺盖无 菌洞巾。( 3 ) 暴露血管：经左侧旁正中线切口I s ，钝 性分离软组织，经肌肉间隙逐渐分离，用2 根铁丝拉 钩分别向两边牵引胸骨乳突肌和胸骨舌骨肌，完全 暴露C C A 、颈外动脉( e x t e r n a lc a r o t i da r t e r y ， E C A ) 和l C A 。游离血管，缠绕在C C A 表面的小血 管用5 - 0 的线结扎后离断。分离l C A 和E C A 分叉 处血管，在C C A 、E C A 及I C A 处各绕一根4 0 的 线备用，E C A 的分支枕动脉不必结扎，不分离出 I C A 的分支翼腭动脉( p t e r y g o p a l a t i n ea r t e r y ， P P A ) 6 。( 4 ) 插线：实验一：若经C C A 插线栓，则 先结扎E C A ，后于分叉0 8 1 0a m 处结扎C C A ， I C A 的结扎线尽量远离分叉而先不结扎，在线和分 叉之间夹一个微血管夹。用显微剪在距分叉2 3m m 处的C C A 腹侧面剪一小口可容线栓插入，插 线栓时线栓弯曲侧先朝腹内侧，在插入1 0 1 5m m ( 越过P P A ) 后改为内侧，直至入颅后微遇阻力而停 止插入，插入深度距分叉处约( 1 8 2 ±0 5 ) m m 7 J ， 然后结扎I C A 固定线栓；若经I C A 插线栓，则同 样方式结扎E C A 和C C A ，I C A 则置线先不结扎，并 用微血管夹夹闭I C A ，在分叉和微血管夹下方之间 万方数据 江西医学院学报2 0 0 9 年第4 9 卷第8 期 A c t aA c a d e m i a eM e d i c i n a ed i a n g x i2 0 0 9 V o l4 9 ，N o8·1 3 · 的l C A 腹侧面切一插线栓口，过程类似上述。然后 在插线栓口和P P A 之间结扎I C A 固定线栓。记录 从插线开始到插线成功后停止的时间。实验二：操 作大致如实验一，统一用指甲油处理的鱼线作线栓。 若经C C A 插线栓，不结扎E C A 者，插线栓时须 用微血管夹夹闭E C A ，插线结束还须在分叉和切口 之问结扎C C A ，防止从切口出血；结扎E C A 者，则 在分叉和枕动脉之间结扎。若经I C A 插线栓，不 结扎E C A 者，则须在近分叉处结扎I C A ，在结扎处 和微血管夹之间切口插线栓，最后在切口和P P A 间 结扎I C A 固定线栓；结扎E C A 者，则在分叉和枕动 脉之间结扎E C A 。( 5 ) 结尾：撤去拉钩，消炎，缝合 组织和皮肤并消毒。保温，单独置于笼内，等待麻醉 苏醒。 1 5 观察指标 1 ) 神经行为学评分：待大鼠麻醉苏醒后，观察 大鼠的神经行为学表现，并参考文献 2 的标准进行 评分：0 分：无神经功能缺损症状；1 分：提尾不能伸 展对侧前爪；2 分：行走向对侧转圈；3 分：即行走困 难，并向对侧倾倒；4 分：不能自发行走，意识障碍。 2 ) T T C 染色：将存活7 2h 大鼠麻醉断头取 脑，速冻后将脑组织切成2m m 厚度的切片，浸入 2 的T T C 磷酸盐缓冲液中，3 7 染色4 0m i n ，正 常脑组织被染为红色，脑梗死灶呈白色。 3 ) 造模成功率：以存活7 2h 、评分1 3 分、 T T C 染色可见明显缺血灶为造模成功标准 8 ，计算 造模成功率。 1 6 统计学方法 采用S P S S l 3 0f o rw i n d o w s 统计软件进行统 计分析，定量实验数据以均数±标准差表示，两因素 析因设计的定量资料用一元方差分析，三维列联表 的二分类定性资料用L o g i s t i c 回归分析，采用双侧 检验，以P 0 0 5 为差异有统计学意义。 2结果 1 )实验一：有6 只大鼠未能插入线栓，其余 4 2 只均在术后进行神经行为学评分，其中有5 只分 值为0 或4 分，7 只7 2h 内死亡。3 0 只大鼠行 T T C 染色，结果显示，大鼠均有梗塞侧皮质和尾状 核缺血，提示建模成功。3 种线栓的插线时间差 异无统计学意义( P = 0 3 9 7 ) ；经C C A 插线的插线 时间明显低于经I C A 的插线时间( P = 0 0 0 2 ) ；线栓 种类和插线部位间的交互效应无统计学意义( P 一 0 7 3 4 ) ，见表1 。 2 )大鼠的建模成功率未处理的鱼线线栓明显 低于指甲油处理的鱼线和特制的尼龙线栓( P = 0 0 0 1 ) ，后2 种线栓比较差异无统计学意义( P = 0 6 2 6 ) ；C C A 及I C A2 种不同插线部位的建模成功 率比较差异无统计学意义( P = 0 4 4 1 ) ，见表2 。 3 ) 实验二：不同插线部位及结扎E C A 与否 对建模成功率均无明显影响( 均P 一0 6 9 4 ) ，见表 3 。 表1不同种类线栓和不同插线部位对插线时间的影响 表2 不同种类线栓和不同插线部位对建模成功率的影响 表32 种不同的插线部位和结扎E C A 与否对建模成功率 的影响 3 讨论 缺血性卒中在临床上非常常见，它具有高发病 率、高致死率、高致残率，目前已成为威胁人类健康 的主要疾病之一。系统研究其病变过程及转归，建 立大鼠M C A O 模型模拟局灶性脑缺血显得至关重 要。自从1 9 8 6 年K o i z u m iJ 等( 1 开创了线栓法制 作大鼠M C A 0 模型，后经L o n g aE Z 等比3 对此法 适当改进后便被广泛用于实验性脑缺血的研究。线 栓法建模的技术日趋完善，但终因建模过程中材料， 操作等众多因素的影响，至今仍缺乏一个简易制作 有稳定缺血灶的成功模型的标准。 鉴于徐立新等凹 研究证实按照L o n g aE Z 等 万方数据 ·1 4 · 的线栓法但不结扎P P A 也能很好地建立局灶性脑 缺血模型，故在本试验中，一律不分离结扎P P A ，以 减少手术难度，缩短手术时间。本研究经过大鼠 M C A o 建模的整个过程，初步推测影响建模成功的 因素主要有2 个，一是线栓的选择及制备；另一个是 插线的部位和深度。在本研究中，线栓统一为单丝 尼龙线，线栓的线身直径统一为0 2 4m m ，处理过 的线头直径为( 0 3 2 ±0 0 2 ) m m 1 0 j ，插入深度离分 叉处为( 1 8 2 士0 5 ) m m 。目前线栓插入端的处理 主要有砂纸磨光滑】、火烧、电烙铁烫f I 引、石蜡包 裹¨引、硅胶包裹、左旋多聚赖氨酸包被等口引。用 砂纸磨不易手工操作且有毛刺不光滑；火烧或铁烙 难以使头端均匀，多会弯曲；石蜡容易脱落；硅胶、左 旋多聚赖氨酸均不易方便获得。本研究发现，应用 未处理的鱼线、指甲油处理的鱼线和特殊烧制的尼 龙线栓，术中插线栓时间的无明显差别；未处理的鱼 线建模成功率明湿低于指甲油处理的鱼线或特殊烧 制的线栓，而后两者间的建模成功率无明显差别，都 有较高的成功率。据本研究对大鼠死后解剖的结果 分析，其主要原因可能是未处理的鱼线头端比较锋 利，大鼠在醒后扭头挣扎时很容易使鱼线刺破菲薄 的血管膜而致蛛网膜下腔出血而死，降低建模成功 率；而用指甲油处理的鱼线和特殊烧制的线栓包埋 了头端，使头端变得光滑圆钝，不易刺破血管膜，不 会因此而降低建模成功率。由于指甲油处理弹力鱼 线的头端而制成的线栓，取材方便，制备亦很容易， 作者认为在不影响建模成功率的情况下，它可以取 代需特殊工艺烧制的较昂贵的线栓。在插线部位 上，经C C A 插线和经I C A 插线，两者间的手术插线 时间有明显差别，前者时间低于后者，而两者在建模 成功率上无显著差别。经I C A 插线栓操作较经 C C A 者复杂且分离血管时更易出血，在不影响建模 成功率的情况下，选择经C C A 插线栓更简便。 本研究还对不同插线部位和结扎E C A 与否对 建模成功率的影响作了探讨。结果显示，经C C A 和经I C A 插线的建模成功率无明显差别，而结扎 E C A 和不结扎E C A 间的建模成功率亦无明显差 别。这表明，术中可以结扎E C A ，以防止出血而影 响手术视野，亦避免了用微血管夹暂时夹闭E C A 近分叉处时给插线栓过程带来的麻烦。本实验中， 大鼠M C A O 模型的建模成功率较高，究其原因可 能有两方面，模型成功标准相对宽松：存活7 2h ， T T C 染色出现明湿缺血灶即可，未测定缺血灶体积 并界定符合标准的缺血灶体积大小；样本量还不 够大。 本研究结果表明，用指甲油处理头端的线栓可 以替代特殊烧制的线栓，制备简易。经C C A 插线 比经I C A 插线更易操作且可缩短插线时间，而对建 模成功率无明显影响。另外，可直接结扎E C A ，可 避免术中出血和给插线栓带来的麻烦，而不影响建 模成功率。作者认为，采用指甲油处理头端的高弹 力鱼线，结扎E C A 而经C C A 插入线栓建立永久性 单侧M C A O 模型的方法简单快捷，建模稳定。 参考文献： 1 K o i z u m iJ ，Y o s h i d aY ，N a k a z a w aT ，e ta 1 E x p e r i m e n t a lS t u d i e s o fI s e h e m i aB r a i nE d e m a 1 AN e wE x p e r i m e n t a lM o d e lo f C e r e b r a lE m b o l i s mI n f a r c t si nt h eI s c h e m i aA r e a J J p nJ S t r o k e 1 9 8 6 ( 8 ) ：1 8 2 L o n g aEz ，W e i n s t e nPR C a r l s o nS ，e ta 1 R e v e r s i b l eM i d d l e C e r e b r a lA r t e r yO c c l u s i o nw i t h o u tC r a n l e c t o m yi nR a t s J 3 S t r o k e ，1 9 8 9 。2 0 ( 1 ) ：8 4 9 1 3 朱继万东，唐文渊改良线栓法制备大鼠局灶脑缺血模型 J j 第四军医大学学报，2 0 0 8 2 9 ( 8 ) ：6 8 5 6 8 7 4 高善荣，杜闻伟，曾丽等不同厂家葛根素注射剂防治实验性 大鼠脑损伤的比较研究L J 中国实验方剂学杂志，2 0 0 5 ( 5 ) ： 3 l 一3 2 5 吴培要，王静。谢丽芬，等线栓大鼠大脑中动脉缺血模型制作 方法的改进 J 贵阳医学院学报，2 0 0 9 3 4 ( 1 ) ：1 0 8 一l l o 6 吴莹。陈文荣。吴春泽，等栓线法大鼠局灶性脑缺血模型的建 立与改进 J 汕头大学医学院学报，1 9 9 9 ，1 2 ( “ ：2 3 2 5 7 C a r c i aTH AR e l i a b l eM e t h o dt OO c c l u e daM i d d l eC e r e b r a l A r t e r yi nW i s t a rR a t s J S t r o k e ，1 9 9 3 。2 4 ( 9 ) ：1 4 2 3 8 沈斌，X u H a o l i a n g 线栓法制备S D 丈鼠局灶性脑缺血再灌注 模型的改良研究 J 首都医科大学学报，2 0 0 7 ，2 8 ( 6 ) ：7 8 2 7 8 4 9 徐直新袁芳改良的犬鼠脑局部缺血模型 J 中国康复理论 与实践，2 0 0 5 。1 1 ( 1 ) ：2 3 2 4 1 0 - I 国明。晶晶，乔欣等C d k 5 与丈鼠腩缺血再灌注损伤时细 胞凋亡的关系 J 中国实验动物学报，2 0 0 8 1 6 ( 2 ) ：1 1 7 一1 2 1 1 1 K a w a m u r aS ，L iY ，S h i r a s a w aM ，e ta 1 R e v e r s i b l eM i d d l e C e r e b r a lA r t e r yO c c l u s i o ni nR a t sU s i n ga nI n t r a l u m i n a l T h r e a dT e c h n i q u e J S u r gN e u r 0 1 1 9 9 4 。4 l ( 5 ) ：3 6 8 3 7 3 1 2 王耀明，董萼塘，肖学宏M R I 评价改进的大鼠可逆性局灶性 脑缺血模秘 J 卒中与神经疾病1 9 9 9 ，6 ( 3 ) ：1 7 1 1 7 3 1 3 3 刘运泉，戴颖线栓法大鼠局灶性脑缺血模型的改进 J 中国 临床解剖学杂志，2 0 0 5 ，2 3 ( 2 ) ：2 2 2 2 2 3 ( 责任编辑：周丽萍) 万方数据