结核分枝杆菌胶体金法对分枝杆菌菌型快速鉴别价值探讨.pdf

参；滁_ - 巷。 结核分枝杆菌胶体金法对分枝杆菌菌型快速鉴别价值探讨 陈俊林1 ，顾欣荣2 ，顾德林1 ，施军卫1 ，王小平2 ( 1 南通市肺科医院呼吸内科，江苏南通2 2 6 0 0 3 ；2 南通市疾病预防控制中心，江苏南通2 2 6 0 0 6 ) 中图分类号：R - 3 3 1文献标识码：A文章编号：1 0 0 6 - 2 0 8 4 ( 2 0 0 9 ) 1 8 - 2 8 4 7 - 0 2 摘要：目的探讨结核分枝杆菌胶体金法对分枝杆菌菌型快速鉴别的价值。方法 采用结核分 枝杆菌胶体金法诊断试剂和传统菌型鉴定实验方法。对1 3 1 株分枝杆菌临床分离株进行鉴别并进行 比较。结果采用胶体金法快速鉴定试剂，2 3 株非结核分枝杆菌临床分离株检测结果全部阴性，1 0 8 株结核分枝杆菌临床分离株有1 0 7 株阳性，该试剂快速鉴定结核分枝杆菌敏感度为9 9 1 ，特异度 为1 0 0 。肢体金法植出结核分枝杆菌所需时间平均为9 9d ，传统方法所需时闻平均为2 8 2d ，二 者间差异有统计学意义( P 0 0 5 ) 。结论结核分枝杆菌胶体金法快速诊断试剂盒鉴别结核分枝 杆菌与非结核分枝杆菌。方法简便、快速，是分枝杆菌菌型鉴别的有效方法。 关键词： 免疫色谱法；单克隆抗体；快速诊断；M P B 6 4 T h eV a l u eo fC o l l o i d a lG o l dM e t h o di nR a p i dI d e n 衄c a t i o no fM y c o b a c t e r i n mS t r a i n sC H E NJ u n 1 讥，c u X i n m n 9 2 ，G U D e l i n l ，S i l lJ u n ·“ e i l ，W A N GX i a o - # n 9 2 ( 1 D e p a r t m e n to f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e ， N a n t o n gP u l m o n o l o g i cH o s p i t a l ，N a n t o n g2 2 6 0 0 3 ，C h n a ；2 N a n t o n gC e r 地r f o r 历$ “ C o n t r o la n dP r e v e n - t i o n ，N a n t o n g2 2 6 0 0 6 ，C h i n a ) A 呐t H c t ：o b j e c t i v eT od i s c u s st h ev a l u eo fc o l l o i d a lg o l dm e t h o di nr a p i di d e n t i f i c a t i o no fM y e o b a c - t e r i u ms t r a i n s M e t h o d sAt o t a lo f131c l i n i c a li s o l a t e so fm y c o b a e t e r i u mt u b e r c u l o s i sw e r et e s t e db yc o l l o i d a lg o l dd i a g n o s t i cr e a g e n t sa n dc o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a le x p e r i m e n t a lm e t h o d s R e s u l t s2 3c l i n i c a li s o - l a t e so fn o n - M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sw e r ea l ln e g a t i v eb yc o l l o i d a lg o l dr e a g e n tt e s tr e s u l t s ，a n d1 0 7w e r e p o s i t i v ea m o n g1 0 8c l i n i c a li s o l a t e so fM y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l e s i su s i n gc o l l o i d a lg o l dr e a g e n tr a p i di d e n t i f i - c a t i o n T h es e n s i t i v i t yr a p i di d e n t i f i c a t i o no fM y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sW a g9 9 1 ( 1 c r 7 1 0 8 ) ，w h i l es p e c i f i c i t yw a s1 0 0 ( 2 3 2 3 ) T h ea v e r a g et i m ew 9 9dt op i c k so u tt h eM y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i se o m p a r e db yc o l l o i d a lg o l dd i a g n o s t i cr e a g e n t s 。w h i c hw a ss i g n i f i c a n t l ys h o r t e rt h a nt h a tb yt r a d i t i o n a lm e t h o d s w i t ha v e r a g et i m eo f2 8 2d a y s C o n c l u s i o nC o l l o i d a lg o l dm e t h o di ss i m p l ea n dr a p i di ni d e n t i f i c a t i o no f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ，w h i c hi s8 I Ie f f e c t i v ew a yt oi d e n t i f ym y c o b a c t e r i u ms l r m n s K e yw o r d s ：I m m u n ec h r o m a t o g r a p h y ；M o n e c l o n a la n t i b o d y ；R a p i dd i a g n o s i s ；M P B 6 4 结核病的控制关键在于早发现和早治疗，临床 非结核分枝杆菌肺病的发病率有逐年提高的趋势， 而非结核分枝杆菌的药敏结果往往和结核分枝杆菌 复合群有很大的区别¨J 。在结核的确诊中，必须进 行患者痰的结核菌的培养鉴定。传统分枝杆菌菌型 鉴别耗时长、操作复杂。特异性的核酸探针检测鉴 定方法需要昂贵的设备和试剂，难以在日常的检查 中推广。本实验利用结核分枝杆菌分泌的M P B 6 4 特 异性蛋白旧1 对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行 鉴别。 1 材料与方法 1 1 实验对象南通市肺科医院菌株库中1 3 1 株 分枝杆菌临床分离株。 1 2 试剂抗酸染液和改良酸性罗氏培养基为本 院实验室参照全国结核病细菌学检验规程自配，结 核分枝杆菌标准菌株H 3 7 R v ( 中国菌种保存中心) 作 为质控参考株，7 H 9 液体培养基及结核菌胶体金检 基金项目：江苏省预防医学科研课题( Y 2 0 0 7 3 4 ) 测试剂盒( 杭州创新生物检 控技术有限公司提供) ，7 H 9 液体培养基( 批号为 0 6 1 2 1 5 、0 7 0 5 2 4 ) ；结核菌胶 体金检测试剂盒( 批号 0 7 0 5 0 1 、0 6 11 0 4 ) 。 1 3 实验方法 1 3 1 分枝杆菌涂片和培 养检查按照卫生部制定的 结核病诊断细菌学检验规 程1 有关规定进行。将痰 标本用4 N a O H 处理后， 吸取0 1m L 均匀地接种于 改良酸性罗氏培养基斜面； 碱处理后再行中和离心接种 于7 H 9 液体培养基中，放人 3 7 孵箱中进行培养，并且 每隔5d 观察一次生长情况，肉眼观察培养基底层有 颗粒状沉淀或浑浊时，涂片染色检查见抗酸杆菌后， 方可报告分枝杆菌培养阳性。 1 3 2 传统菌种鉴定实验结核分枝杆菌菌群 与非结核分枝杆菌菌群鉴定实验：分枝杆菌菌株经 对硝基苯甲酸( P N B ，5 0 0 斗g m L ) 培养基生长、耐热 触酶实验，区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。 分枝杆菌菌种鉴定实验：按照中国防痨协会制定 的结核病诊断细菌学检验规程旧。的方法进行。 1 3 3 分枝杆菌胶体金法快速诊断实验 经7 H 9 液体培养基培养后( 5 1 5d ) ，吸取2 0 0 汕7 H 9 液体 培养上清液加入结核菌胶体金检测试剂盒的检测孑L 中，1 5r a i n 后观察结果。结果判定：检测区和控制区 均出现紫红色条带为阳性结果，在控制区出现紫红 色条带，在检测区未出现为阴性结果。控制区未出 现任何条带需重新检测。 1 4 观察指标通过与传统方法比较，观察结核分 枝杆菌胶体金法对结核分枝杆菌菌型鉴别的敏感度 和特异度以及检测结核分枝杆菌的时间。 万方数据 1 5 统计学方法计量资料用均数表示，采用t 检 验，以P 0 0 5 为差异有统计学意义。 2 结果 2 1M P B 6 4 胶体金法检测结核分枝杆菌的敏感度 和特异度敏感度= 1 0 7 1 0 8X1 0 0 = 9 9 1 ，特异 度= 2 3 2 3X1 0 0 = 1 0 0 ，假阳性率= O 2 3X1 0 0 = 0 ，假阴性率= 1 1 0 8X1 0 0 = 0 9 ( 表1 ) 。 表lM P B 6 4 胶体金法检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度 2 2 结核分枝杆菌检出时间比较到第1 5 天时， M P B 6 4 胶体金法共可以检测到1 0 7 例结核分枝杆 菌，而传统方法仅检测到8 例结核分枝杆菌。M P B 6 4 胶体金法检测所需时间为5 2 0d ，平均为9 9d ；改 良罗氏培养检测时间为1 5 5 5d ，平均为2 8 2d ( 表2 ) 。在平均检测时间上两种方法间差异有统计 学意义( t = 5 6 7 ，P 0 0 5 ) 。 表2M P B 6 4 胶体金法与传统方法对1 0 8 株 结核分枝杆菌检出时间比较 3 讨论 无论是流行病学的研究需要还是在结核病临床 治疗工作中，对结核病的致病菌做严格的分类学鉴 定非常重要。鉴别菌型的最终目的是指导用药，敏 感药物相同的物种之间没有必要再进行鉴别。结核 分枝杆菌都倾向于对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链 霉素敏感，非结核分枝杆菌则倾向于对氧氟沙星或 环氧沙星敏感，而对前面4 种药显示出先天性的耐 药HJ 。因此对临床分离菌株，实验室首先要鉴别出 结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌。基因检测方法 要求配置价格昂贵的仪器，且操作技术复杂，无法在 基层医院推广应用。传统的菌型鉴定首先需依赖耗 时较长的改良罗氏培养，且作为后续步骤的鉴定检 查还需l 周时间，不能尽快选择最佳治疗方案而对 患者的治疗产生影响。因此市场迫切需要快速简便 的分枝杆菌菌型鉴别工具”J 。 M P B 6 4 蛋白是结核分枝杆菌在生长繁殖中分泌 的相对分子质量为2 4 ×1 0 3 的蛋白质，是一种有特殊 作用的分泌蛋白，可导致强烈的迟发型超敏反应。 M P B 6 4 蛋白主要存在于结核分枝杆菌复合群菌，非 结核分枝杆菌极少数出现阳性M 引。分枝杆菌胶体 金法结核菌族特异性产生的外分泌蛋白M P B 6 4 为测 定对象，用免疫色谱法测定M P B 6 4 ，操作简便，短时 间获得结果。近7 年来国内外许多学者通过免疫方 法检测这种抗原来进行快速的结核分枝杆菌菌型鉴 别，如张嵘等”1 报道用免疫色谱法抗一M P B 6 4 单克隆 抗体检测和诊断结核分枝杆菌结核菌群，发现用该 法能完全区分结核和非结核分枝杆菌。另外有学者 报道，利用C a p i l i aT B ( 一种免疫层析试剂) 抗M P B 6 4 单克隆抗体区分结核分枝杆菌复合群菌和非结核分 枝杆菌，敏感度9 9 2 ( 3 8 1 3 8 4 ) 一J 。本实验组利用 结核分枝杆菌胶体金法诊断试剂盒对1 3 1 株分枝杆 菌临床分离株进行检测，敏感度为9 9 1 ，特异度为 1 0 0 ，该试剂的检测结果与传统菌种鉴定实验的结 果符合性很高，与报道相符。较传统的菌型鉴定时 间明显缩短、且操作简单。本实验中1 株结核分枝 杆菌用该方法检测为阴性，可能为结核杆菌分离株 M P T 6 4 编码基因，发现基因突变，产生T G A 终止码， 部分C 末端区域缺失pJ 。分枝杆菌胶体金法的优点 是能进行快速的菌型鉴定，缺点是不能进一步进行 区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的菌种。 结核分枝杆菌胶体金法能够为临床分枝杆菌菌 群快速鉴定提供一个较好的实验方法，且适于在实 验条件较差的基层实验室使用。 参考文献 1 C o l eS T ，B m s c hR ，P a r k h i l lJ ，da 1 D e e i p h e r i n gt h eb i o l o g yo fM y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sf r o mt h ec o m p l e t eg e n o m es e q u e n c e J N a t u r e ，2 0 0 0 ，3 9 3 ( 6 6 8 5 ) ：5 3 7 - 5 4 4 2 A b eC ，H i r a n oK ，T o m i y a m aT S i m p l ea n dr a p i di d e n t i f i c a t i o no f t h e m y c o b a e t e r i u mt u b e r c u l o s i sc o m p l e xb yi m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ea s - s a yu s i n ga n t i M P B 6 4m o n o c l o n a la n t i b o d i e s J JC l i nM i e r o b i o l 。 1 9 9 9 ，3 7 ( 11 ) ：3 6 9 3 3 6 9 7 3 中困防痨协会结核病诊断细菌学检验规程 J 中国防痨杂 志，1 9 9 6 ，1 8 ( I ) ：2 8 - 3 1 4 W a n gZ ，P o t t e rB M ，G r a yA M ，e ta 1 T h es o l u t i o ns t r u c t U r eo f a n t i g e n M P T 6 4f r o mM y e o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sd e f i n e san e wf a m i l yo fb e - t a ·g r a s pp r o t e i n s J M o lB i d ，2 0 0 7 ，3 6 6 ( 2 ) ：3 7 5 - 3 8 1 ， 5 张嵘，蒋颜，陈功祥免疫色谱法抗M P B 6 4 单克隆抗体检测结 核分枝杆菌蒴群方法学评价 J 中华检验医学杂志，2 0 0 5 ，2 8 ( 8 ) ：7 9 3 - 7 9 5 6 B a iY X u eY ，G a oH ，e t 以E ) c 眇鹞i o f Ia n dp u r i f i c a t i o n0 fM y c 0 1 ) 日c 吲m t u b e r c u l n a i sE S A T - 6a n dM P l 6 4f u s i o np r o t e i na n di t si m n 酬y l a e - t i cp o t e n t i a li n 咖s em o a d J P r o t e i na x p rP u r i f ，2 0 0 8 ，5 9 ( 2 ) ：1 8 9 1 9 6 7 】A b eK ，H a r aM I m p r o v e m e n tf o ri d e n t i f i c a t i o no fM y e o b a c t e r i u mt u - 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