miR-430基因簇的生物信息学分析毕业设计论文.docx

南京邮电大学本科生毕业设计（论文）南京邮电大学 毕 业 设 计（论 文）题 目miR-430基因簇的生物信息学分析专 业生物医学工程学生姓名王凯班级学号B09090321指导教师李小慧评阅教师指导单位地理与生物信息学院 日期： 2013 年 3 月 1 日至 2013 年 6 月 1 日毕业设计（论文）原创性声明本人郑重声明：所提交的毕业设计（论文），是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容外，本毕业设计（论文）不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本研究做出过重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并表示了谢意。 论文作者签名： 日期： 年 月 日摘 要microRNAs (miRNAs) 是由基因组非蛋白质编码序列编码的一类小RNA(19-24 nt)，miRNA与靶基因的转录产物互补结合，导致mRNA降解、翻译抑制, 调节靶基因的表达。miRNA对动植物的生长、发育等各种生命活动发挥着至关重要的调节作用。通常多个miRNA基因在染色体上聚集排列形成miRNA基因簇，这些 miRNA 基因簇在不同物种中有较高的保守性，miRNA 基因簇在功能上比单个miRNA的作用更高效，对 miRNA基因簇进行研究，有利于深入了解 miRNA 所参与的复杂调控网络。miR-430基因簇最早在斑马鱼中被发现，是目前已知的最大的miRNA基因簇之一。miR-430簇分布在斑马鱼4号染色体上约20kb的一个区域内，三个miRNA（mir-430a,c和b）组成了三联体，并以此为基本单元进行复制。miR-430在早起胚胎发育中丰度最高，通过抑制和降解母源基因在母源调控向合资调控的转换过程中起到重要作用。本课题主要开展miR-430基因簇分子进化分析研究。主要的步骤：从miRBase数据库中获得数据，即已知的mir-430基因的成熟序列。根据斑马鱼、青鳉、红鳍东方鲀等物种的mir-430基因的成熟序列通过同源性对比的方法在所有动物物种中进行搜索，利用 BLAST软件进行相似性比较的分析。利用CLUSTALW软件进行渐进的多序列比对。利用MEGA 4.1软件，以mir-430基因簇中的mir-430成员成熟序列构建系统进化树。本课题的目的主要是根据miRNA基因在物种间的保守性，利用生物信息学同源性搜寻、对比的方法，探讨miR-430 基因簇的分子进化规律，揭示 miR-430基因簇的起源及相关物种的进化关系，为其调控网络的研究提供理论基础。关键词：MIR-430、NCBI、Blast、ClustalW、MEGA 4.1ABSTRACTmicroRNAs (miRNAs) are a class of small non-protein coding sequence encoded by the genome RNA (19-24 nt) miRNA target gene transcripts complementary binding, leading to mRNA degradation, translational repression, regulate expression of target genes. miRNA growth, development and other activities of life on plants and animals play a crucial regulatory role. Usually multiple miRNA genes are arranged to form miRNA gene cluster on chromosome gathered, these miRNA gene clusters were conserved in different species, miRNA gene clusters are functionally more efficient than a single miRNA miRNA gene cluster study , is conducive to the understanding of miRNA involved in complex regulatory networks. miR-430 gene cluster was first found in zebrafish, is the largest known miRNA gene cluster one. miR-430 cluster located within an area of about 20kb zebrafish chromosome 4, three miRNAs (miR-430a, c and b) the triplet, and use it as the basic unit of replication. miR-430 in early embryonic development in the abundance of the highest in the maternal regulation play an important role in the conversion process of joint control by inhibiting the degradation of the maternal gene. Topics using molecular evolution analysis. Main steps: data obtained from the miRBase database, each species precursor of miR-430 gene sequence. Precursor sequence of miR-430 gene in zebrafish, medaka, red fins puffer species by homology comparison method in all animal species to search using BLAST software for the analysis of the similarity comparison. Use of CLUSTALW Software progressive multiple sequence alignment. Use MEGA 4.1 software, the precursor sequence of miR-430 members of the miR-430 gene cluster phylogenetic tree was constructed.The purpose of this project is based on miRNA genes conserved between species, bioinformatics homology search, contrast, investigate the molecular evolution of miR-430 gene clusters law, to reveal the origin of the miR-430 gene cluster and relatedthe evolutionary relationships of the species, for the study of regulatory networks provide a theoretical basis.KEY WORD ：MIR-430; NCBI;Blast;ClustalW;MEGA 4.1目 录第一章 引言11.1 miRNA生物发生及作用机制21.1.1 miRNA的生物发生21.1.2 miRNA作用机制21.2 miRNA基因的结构特征31.3 miRNA命名规则31.4 miRNA相关功能41.4.1 miRNA对动物发育的调控作用41.4.2 miRNA对动物疾病发生的影响51.4.3 miRNA对动物细胞增殖和凋亡的影响51.5 miRNA鉴定方法61.6 miRNA对基因表达的影响71.6.1 miRNA对靶基因表达的整体调节作用71.6.2 miRNA与靶基因表达的关联效应71.6.3 miRNA在小鼠不同发育阶段对靶基因表达谱影响81.6.4 miRNA对靶基因表达调控的倾向性81.7 miRNA基因进化模式81.7.1 miRNA基因簇进化91.7.2 miRNA基因家族进化9第二章 miRNA-430基因家族进化及功能分析102.1 miRNA-430的分布与串联复制102.2 miRNA-430的功能和特点10第三章 miRNA-430基因簇分析使用软件介绍123.1 miRBase数据库123.2 NCBI133.3 BLAST软件143.4 CLUSTALW软件153.5 MEGA 4.1软件15第四章 miRNA-430基因分子进化研究174.1 数据与方法184.1.1 数据184.1.2 序列对比分析方法184.2 已知的mir-430基因簇的分析184.2.1 已知的mir-430基因簇序列处理184.2.2 利用CLUSTALW软件对mir-430基因簇进行多序列比对194.2.3 利用MEGA 4.1软件构建系统进化树204.3 其他mir-430基因簇的搜索与分析234.3.1 通过NCBI 搜索mir-430基因簇的序列234.3.2 物种序列命名244.3.3 将命名后的基因簇做成FASTA文件254.3.4 利用CLUSTALW对物种的mir-430基因簇进行多序列比对264.3.5 利用MEGA 4.1软件构建mir-430基因簇的系统进化树284.4 讨论31第五章 全文总结32结束语33参考文献34致谢35附录36南京邮电大学2013届本科生毕业设计（论文）第一章 引言1958年，DNA双螺旋结构的发现者之一，佛朗西斯.克里克1提出了分子生物学的中心法则，即“遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，完成遗传信息的转录和翻译的过程，也可以从DNA传递给DNA，完成DNA的复制过程”。这是所有具有细胞结构的生命所遵循的普遍法则。根据这一原理，RNA分子在生命过程中主要起信息传递，指导细胞蛋白质合成的作用。然而,，随着近年来非编码RNA分子，特别是microRNA(miRNA)的发现，这一原则正遇到越来越多的挑战。miRNA是一类长度约为22个核普酸的内源性非编码RNA分子，可通过干扰mRNA指导蛋白合成过程，负向调节蛋白编码基因的表达。作为一类进化上保守的、起重要调控作用的分子，miRNA通过与靶标mRNA分子3一非编码区(3.-untranslated region，3-UTR)完全或非完全互补结合，miRNA能有效抑制相关蛋白的合成，或导致靶mRNA降解，产生基因沉默效应。研究表明，miRNA可能为调节基因表达的转录后调控的中心分子。目前已在多个门类的生物中发现miRNA的存在，包括植物、动物、某些病毒和藻类等。研究表明miRNA可能存在于所有多细胞生物以及少数单细胞生物中，起基因表达调控的作用。早在1993年，Lim等人2采用定位克隆的方法在线虫(Caonorhabdttis legans)中发现了第一个miRNA分子lin-4。Lin-4基因不编码蛋白,，而是产生一种小分子RNA,，这种小分子RNA能与靶mRNA的3-UTR相互作用，从而抑制Lin-14基因表达。Lin-4的缺失导致线虫幼虫由L1期向L2期的转化发生障碍。这一发现当时并未引起人们重视，直到2000年第二个miRNA一let-7的发现，miRNA在基因表达调控领域的重要作用才逐渐被人们所认识。与lin-4类似，let-7与lin-41基因的3-UTR互补结合抑制其蛋白表达。Let-7序列与行为模式在包括人类在内的多个物种中高度保守，暗示了miRNA的调控行为可能是一种普遍的模式。目前己有数以千计的miRNA在不同物种中被发现。迄今为止,在miRBase数据库中己有15,172条己注释的miRNA序列。其中包括：1048条人类miRNA，672条小鼠miRNA，176条果蝇miRNA，175条线虫miRNA以及213条拟南芥miRNA。预计在人类基因组中编码的miRNA分子的基因总数可能占到基因总数的2-3%，它们可能多种物学过程中扮演了重要的角色。己证实miRNA参与到包括胚胎发育、细胞凋亡、细胞分裂、分化、死亡、造血作用、癌症发生以及病毒感染等多种基因表达调控途径。对这些小分子RNA相关的生物信息学与进化分析的基因序列、加工表达方式、功能等方面的研究表明其系统发育广泛性与进化保守性的特点，暗示了其在生命活动中复杂的调节方式，并可能对构建多细胞组织起精确调控遗传网络的作用。1.1 miRNA生物发生及作用机制1.1.1 miRNA的生物发生miRNA的生物发生是一个多步骤过程。以动物为例，多数miRNA过RNA聚合酶，少数通过RNA聚合酶转录为长度在数百至数千核普酸的初级转录本，初级转录本其5-端多具有7-甲基鸟嘿吟帽子，3-端具有poly(A)结构。在细胞核中，初级转录本在辅助因子DGCR8帮助下被核酸酶Drosha加工成长度约为60-80nt的非完全互补茎-环结构，称为前体miRNA。前体miRNA在辅助因子Ran的参与下，与细胞膜转运蛋白Exportin-5结合,，由细胞核转移至细胞质中，这一过程需要以及GTP的水解提供能量。在细胞质中，前体miRNA在另一种核酸酶Dicer：及其辅助因子TRBP作用下,，被进一步切割为18-24nt的双链miRNA分子。其中的一条或两条链同时作为成熟的miRNA分子与蛋白质结合形成核糖核蛋复合体miRNP，或称为RNA诱导沉默复合物，其后miRNA通过与靶基因mRNA3-UTR区互补配对，发挥基因表达调控作用。植物细胞中miRNA的发生过程与动物miRNA稍有不同，其加工过程主要在细胞核内完成。Pri-miRNA在细胞核内由Dieer-like protein和其他蛋白,如HYLI的参与下加工为pre-miRNA，pre一m1RNA进一步被DCLI加工为miRNA-miRNA*双链复合体，之后被HENI蛋白甲基化后在HASTY蛋白(与动物ExPortin-5基因同源)的协助下从细胞核运往细胞质,在解旋酶作用下加工为成熟的miRNA，降解特定的靶基因。1.1.2 miRNA作用机制miRNA与靶标mRNA通过碱基互补配对而发生作用，通常miRNA5-端的第2-8个核普酸对于miRNA发挥调节功能至关重要，这段区域与3-UTR靶位点完全互补配对，被称为seed区，其在同源miRNA中通常保守。miRNA靶序列在不同物种中也通常保守。已证实miRNA主要存在两种不同的作用机制：降解mRNA或抑制mRNA翻译。通常情况下，如果miRNA与mRNA的3-UTR非完全互补结合，则mRNA不被降解而产生翻译抑制，如果二者具有较高互补程度或完全互补，则导致mRNA降解。通常认为在动物细胞中miRNA与靶基因序列具有较弱的互补性，多导致翻译抑制。通过高通量表达谱分析表明,，动物miRNA对多个mRNA同时产生降解作用，造成靶基因mRNA表达水平的不同程度的下降也可能是一种普遍的现象。相对而言，在植物细胞中miRNA通常与靶基因有较高程度的配对，因而多导致靶mRNA的降解，而较少看到翻译抑制的现象存在,，如miR-39或miR-171与其靶mRNA完全互补，切割降解靶基因mRNA。1.2 miRNA基因的结构特征miRNA基因通常位于蛋白编码的基因间区域，约有三分之一的miRNA位于已知蛋白编码基因内含子区的有义或反义链上，miRNA前体在同一或不同染色体中常呈单拷贝或多拷贝存在，2-3个甚至更多个miRNA基因排列在一起，共同转录为多顺反子RNA。例如miR-17-92基因簇，在人类中共由6个成员组成，而在果蝇中则由8个成员组成。Ambros等人3提出了miRNA基因识别与鉴定的一系列标准：（l)）通过Northem等方法可以从RNA样品中检测到22nt左右的转录本；（2)）由分级分离得到的RNA分子构建的cDNA文库中得到的长度为22nt左右的序列，这些序列必须精确地与来源生物的基因组序列相匹配；（3)）具有可以预测的发夹结构前体，在其中一条臂上具有成熟的miRNA分子。该发夹结构必须具有最低的能量状态,并且在发夹结构的其中一条臂上必须含有22核普酸中的至少16个，预测的前体miRNA二级结构中不应该有大的内部环、泡等结构。在动物中,该发夹结构通常为60-80nt,而在植物中该前体长度变化较大，甚至可能达到数百nt；（4)）miRNA及其发夹结构前体在进化上高度保守。保守的发夹要符合标准3中最少配对碱基数的要求，但不必是能量最低；（5)）如果Dieer功能降低或丧失，应可检测到前体miRNA分子在细胞内积累。1.3 miRNA命名规则由于发现的miRNA数量众多，为防止混淆，除最早发现的lin-4，let-7及lsy-6之外，研究者们对于其他miRNA统一用miR-#(#为数字)表示，其基因则记为mir-#(#为相应数字)。高度同源的miRNA在其后加英文字母加以区别，多拷贝miRNA基因再其后再加数字。（ （1）除了lin-4和let-7外，其他miRNA统一用miR-#(#为数字)表示， mir-#(#代表数字)表示相应的编码基因。（(2)）高度同源的miRNA在#后加英文小写字母(般从a开始)。（(3）)多基因拷贝的在后面加-No(如miR-2a-I)。之后人们又对命名规则作了补充。不同物种中同源的miRNA最好用同一个名字；如果一个前体的两条臂上分别产生一个miRNA，则根据克隆实验，观察成熟产物，次要的在后面加“*”号，如果蝇的miR-306与miR-306*(*表示量少的)：如果不能区分表达量的多少，可以如下表达：如拟南芥的miR-835-5p和miR-835-3p(5p表示在5端的臂上，3p表示在3端的臂上)。1.4 miRNA相关功能首先，miRNA 的生成过程起始于pri-miRNA 的产生,，它由细胞核内编码miRNA 的基因转录生成，长度为几百到几千个核苷酸。Lee 等 人证明其中一大类miRNA 由多聚酶(Pol)转录,，而且一些miRNA 的转录本(如let-7)具有5帽和3poly(A)的结构。Rodriguez 等 在基因组水平对miRNA 的转录也进行了分析，哺乳动物中由内含子编码的miRNA，其转录酶应该是Pol。其次, pri-miRNA 在核内被RNase 核酸酶Drosha 加工成长约70nt 的发夹状的pre-miRNA。在这个过程中, Drosha 和另外的一些成分(如人类中的DGCR8蛋白、果蝇中的Pasha蛋白)构成一个微小RNA处理器(microprocessor)的复合体， pri-miRNA 在这个microprocessor 中被加工成pre-miRNA。最后, pre-miRNA 在Ran-GTP 依赖的核质/细胞质转运蛋白exportin5 的作用下，从核内运输到胞质中。能与exportin5 结合的pre-miRNA 必须具有大于16nt配对的茎和3末端有2 个悬垂碱基的结构特点。胞质中pre-miRNA 在Dicer 酶的作用下，被切割成双链的miRNAmiRNA*配对分子，然后成熟的miRNA分子被解链， 单链的miRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNP(也叫RISC), 通过与靶基因的3UTR 区互补配对, 指导miRNP 复合体对靶基因mRNA 进行切割或者翻译抑制。MiRNA 到底是抑制还是切割取决于miRNA 与靶序列互补配对的程度，互补配对高的可能进行切割，而配对低的就只是抑制。近年来，关于miRNA的研究已经从识别miRNA、阐明其作用机制，转移到鉴定其功能。并且，随着生物信息学的预测方法、原位杂交、过量表达、基因沉默技术等的发展, 一些miRNA 的功能已经得到确认。这些miRNA 的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化、信号转导、疾病和死亡的过程。总的来说，miRNA对动物的负调控作用具体体现在如下三点：1.4.1 miRNA对动物发育的调控作用通过DNA芯片技术，Krichevskv等4在2003年证明了在哺乳动物脑发育阶段miRNA表达的精确调控，约有20的miRNA的表达发生了显著变化，其中miR19和miR131表达失调时，无早衰素的老鼠表现出严重的大脑缺陷；随后相继发现，miRNA在调控线虫神经系统发育过程中发挥重要作用；美国哈佛医学院的研究人员研究发现，miRNA通过转录后抑制HOX基因表达，在脊椎动物发育过程中发挥重要作用；美国华盛顿大学的研究人员证明在干细胞不断分裂的过程中miRNA是必要的条件；Bruneau5发现现了miRNA是心脏形成过程的一个靶标，同年，美国西北大学和卡耐基梅隆大学的研究人员合作研究发现，miRNA在调节卵生长过程中起到重要的作用。在肌肉发育方面，Alex Clop等6证实，Texel绵羊中的GDF8基因的3'UTR内的一个点突变产生了一个可以在骨骼肌内高度表达的两个miRNA，即miR-1和miR-206，它们同时作用的靶位点，从而引起miRNA介导的myostain浓度在转录后降低而造成肌肉造成肌肉肥大；CHENChen等证实，miR-1通过作用于HDAC4而促成肌细胞分化为成熟的肌肉细胞，抑制细胞扩增，miR-133则通过抑制SRF而促进成肌细胞扩增，抑制其分化。1.4.2 miRNA对动物疾病发生的影响研究表明，miRNA与人类的肿瘤形成、癌症发生密切相关。Michael等7发现在人类直肠瘤形成过程中，miR-143和miR-145表达量保持较低水平：Van denBerg A等用SAGE技术研究发现，霍奇金淋巴瘤中miR-155BIC高度表达(达91)，作为对照，其在非霍奇金淋巴瘤中几乎不表达；随后Calin等8发现，在超过68的慢性淋巴细胞白血病例中，miR-15a与miR16a水平双双下调；Takamizawa等9发现肺癌病人的let-7表达显著降低；还有研究表明：淋巴瘤中，miRNA的一类miRl7-92可能是潜在的致癌基因，并且发现一种叫做e-Myc的转录因子能调节miRNA；2006年，美国俄亥俄州立大学的Volinia等10通过分析来自肺部、胸部、胃部、前列腺、结肠和胰腺等处的癌细胞样品540份，发现了有过量表达的部分miRNA组成的实体癌症miRNA信号，在这些miRNA中包括miR-17-5p、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-106a和miR-155。这说明miRNA在实体肿瘤的癌症发病机理中发挥着重要的作用。1.4.3 miRNA对动物细胞增殖和凋亡的影响Hipfner等11在果蝇体内鉴定出第一个与增殖相关的miRNA基因Bantam及其靶基因hid。Bantam与hid miRNA的3'UTR互补结合，阻止了hid miRNA的翻译，抑制蛋白的表达，最终表现为促进细胞增殖的作用；随后，Xu等在果蝇体内发现了另一种凋亡抑制miRNA-miR14。miR-14的缺失促进了Reaper以来的细胞凋亡的发生，尽管果蝇仍能存活，但对压力反应过敏，生存期缩短；耶鲁大学分子发育生物学和细胞发育生物学系还证实了miRNA对衰老和死亡的调控作用，miRNA可以阻止细胞过早死亡。动物miRNA的负调控功能不仅局限于抑制靶基因转录，Brennecke等利用人工构建的与Bantam完全互补的靶基因，证实了动物miRNA一样可以引起靶基因的降解。还有研究发现，miR-196基因和靶基因Hoxb8匹配得非常完美，导致靶基因mRNA的降解，从而达到调控作用。而植物中的miRNA几乎都引起靶基因降解，这是植物miRNA和动物miRNA的一个重要的区别。植物miRNA同靶基因配对完美，而且它们的互补位点可以位于靶基因转录区域，而不是限制在3'UTR。在研究拟南芥花发育过程中发现的miR172是作为转录抑制基因出现，它同靶基因APETALA2(AP2)的互补位点却位于编码区域，而非3'UTR。1.5 miRNA鉴定方法迄今发现的miRNA主要通过两种途径获得，即构建富集miRNA 的cDNA 文库和生物信息学方法。（1） cDNA 文库法该方法是首先从细胞组织中提取总RNA，用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行大小分级，回收大小在2025 个核苷酸的RNA 分子，利用T4 连接酶，直接将人工合成的5和3接头连接到RNA 上后，用PCR 反转录扩增这些序列，获得miRNAs 的cDNA文库，再将这些cDNA 进行克隆、测序，然后用生物信息学软件对其进行基因组中定位，并验证是否具有发夹结构的前体以及该发夹结构在其它物种中的保守性，最后将具有发夹结构的小分子RNA 进行Northern 杂交等以检测其表达情况，最终将符合miRNA 标准的小分子RNA 鉴定为新的miRNA。但是，对于部分表达丰度低、且具有组织和阶段表达特异性的miRNA，以及一些由于自身的物理因素，如序列成份和转录后修饰等，而很难通过克隆的方法得到的miRNA, 通过建文库的方法寻找miRNA 具有明显的局限性。除此之外, 一些内源性的小RNA 以及mRNA 和其他非编码RNA 的降解产物对克隆也具有一定的干扰作用。（2）生物信息学方法生物信息学方法是依据在不同的物种中，成熟的miRNA 具有较大的序列同源，前体的茎环结构具有相当大的保守性，其结构和序列的热力学稳定性与已知miRNA 具有相似性，以及miRNA 在基因组中往往是成簇排列的这一特征在基因组数据库中搜索新的miRNA 基因。第一种方法主要根据保守性来进行预测。MiRscan 根据候选miRNA 与已确认的miRNA 的相似性来识别并分类保守的发夹结构，预测了35 个C.elegans的新候选miRNA 和107 个人的新候选miRNA。除了MirScan 以外，根据保守性预测的软件还有miRseeker。MiRseeker 不仅仅简单的利用了保守性, 而且可以识别miRNA 的特殊的保守类型, 如较多分叉的茎环序列或者更加保守的发夹茎部。另一种有效方法是通过研究已知miRNA 的临近序列来发现miRNA，因为许多miRNA 都是成簇排列的或距离很近。许多人类和小鼠的miRNA就是通过这种方法发现的。近来，实时定量PCR 也应用于miRNA 的定量分析。它的最大优点是高精度定量与高灵敏度。Bandrés 等12用实时定量PCR 检测了16 个结肠癌细胞系与12 对临床的肿瘤组织-正常组织的对比样本中156 个miRNA 的表达，鉴定出在结肠癌细胞系于临床样本中有13 个miRNA 的表达异常。1.6 miRNA对基因表达的影响了解造成生物体各种表型差异的分子生物学基础是遗传学的基本问题之一。在过去的很长一段时间中，分析基因表达谱变化造成的生物体表型改变是分子生物学领域的研究热点。研究表明，蛋白编码基因的表达在不同细胞、组织及不同的环境状况下具有极大的差异，其表达状况可能受到各种内在因素，如分子伴侣调控，以及其他外在环境因素的影响。目前,随着高通量基因表达技术如基因芯片等方法的发展，对来自不同生物样本的数以万计的基因表达进行测定已经成为生物学常规分析手段，极大地方便了在不同条件下基因的表达状况的检测。利用全基因组芯片分析方法表明，miRNA与其靶基因具有复杂的调控关系，可能对全基因组表达状况产生复杂的影响。1.6.1 miRNA对靶基因表达的整体调节作用Lim等人于2005年首次报道了人类miRNA对靶基因表达谱的作用，将组织特异性表达的miRNA,miR-l与miR-124，转导至hela细胞内，通过对hela细胞转导前后全基因组表达谱对照分析，发现分别有上百个蛋白编码基因在miRNA导入hela细胞后表达水平呈下降趋势，其中多数基因3-UTR存在与miRNASeed区域互补序列，充分说明动物中miRNA可直接导致靶基因mRNA表达水平降低。此外，他们还将miRNA靶基因在该miRNA特异表达的组织与其他组织中的表达量相比较，发现相对m1RNA表达的组织中，miRNA靶基因表达量较无该miRNA表达的组织为低。1.6.2 miRNA与靶基因表达的关联效应Sood等12怎么有两个12采用与Lim等人类似方法，选取多套人类基因表达谱数据，利用PicTa:软件预测miRNA靶基因，证实miRNA靶基因在miRNA特异表达的组织中的表达量低于非表达组织,并且发现在某些癌症组织，个别miRNA表达异常增高,而其靶基因表达量出现相应下降。1.6.3 miRNA在小鼠不同发育阶段对靶基因表达谱影响Farh等13采用对小鼠miRNA靶基因相对表达量进行密度做图的方法，与Lim等人的方法取得了较为一致的结论，并发现随着小鼠从胚胎期到成年的过渡，某些miRNA表达量上升，同时造成靶基因表达量的下降。说明miRNA可能对限定靶基因表达范围，促使器官分化中具有重要意义。1.6.4 miRNA对靶基因表达调控的倾向性Yu等人14参考文献编码为上标，下同采用与Lim与Sood等类似的方法，大规模分析miRNA对靶基因表达的影响，除进一步证实胚胎期蛋白编码基因表达量由于miRNA的影响，较成年组织有所下降之外，还发现,miRNA更倾向于调控在多种组织中普遍表达的基因。以上研究表明，miRNA对于基因表达可能具有极为复杂的影响，然而目前miRNA与靶基因表达相互作用研究多集中在miRNA对其靶基因表达水平的改变上。越来越多的证据表明，调节靶基因表达水平只是miRNA作用方式的一个方面，更多的m1RNA可能起降低靶基因表达波动性，从而稳定靶基因表达的作用。基于这一前提，目前已有多项研究对miRNA对靶基因表达稳定效应进行了初步分析。我们利用Mcta分析方法，对多套全基因组表达谱进行统计分析，挖掘多个在不同状况下稳定表达及波动表达的基因。随后利用不同的靶miRNA基因预测软件，研究这两类基因的miRNA调控偏好型趋势。对于用不同的预测软件的结果，我们发现miRNA倾向于调控稳定表达的基因，即miRNA使靶基因表达波动性降低，从而起到稳定基因表达的作用。此外我们进一步分析了转录因子对其靶基因波动性影响，发现转录因子与miRNA具有相反的调控效应。为今后进一步研究miRNA及转录因子对靶基因调控作用机制带来新的启示。1.7 miRNA基因进化模式通常认为，生物进化模式遵循由简单到复杂的进化过程，在过去较长一段时间中，困扰生物学界的一个基本问题是就基因组及蛋白编码基因而启，进化上较为低等的生物与较为高等的生物如人类相比，其数量并无明显差异。随着近年来基因表达调控网络相关研究的进展，越来越多的研究表明，基因表达调控的复杂性可能是推动生物进化的主要原因。miRNA参与的转录后调控可能是造成的基因表达模式差异的重要原因，因此，miRNA基因进化保守性以及多样性可能对物种进化及不同物种间的表型差异起到重要的推动作用。Grimson等人15在利用深度测序技术对进化上较为低等的生物非编码序列分析后发现，miRNA基因数量随着生物个体复杂性的增加，在基因组进化过程中呈现不断扩增的趋势。miRNA新基因的产生及消亡的进化过程对于基因表达网络的调节及物种形成都具有的重要意义。1.7.1 miRNA基因簇进化基因簇是指在染色体几紧密排列的基因群。这此基因位于染色体的特殊区域，可能有两个或两个以卜的基因串联排列而成，可能由一个祖先基因扩增而来。在对miRNA基因在染色体上分布分析后发现，许多miRNA在染色体上成簇排列。处于同基因簇内的miRNA基因可能由同一家族的基因构成，也可能不具有任何同源性。成簇排列的miRNA基因可能使用相同的转录调控元件而以多顺反子基因的形式而存在，其成员对于基因表达调控网络及蛋白相互作用网络具有协同调节作用。研究表明，在果蝇基因组中约占总数一半的miRNA基因具有成簇排列的特征。而在人类基因组中有超过30%的基因miRNA为成簇排列。位于miRNA基因簇多由同一祖先基因经串联重复而形成。1.7.2 miRNA基因家族进化序列上相似且具有类似功能的基因被称为基因家族，在基因组进化过程中，由miRNA祖先基因通过重复而形成两个或多个拷贝构成基因家族。由串联重复形成的miRNA基因家族多在染色体上成簇排列，而某些m1RNA基因家族成员分散在不同染色体上。基因组复制和转座子介导miRNA基因复制可能是除除串联重复之外导致其miRNA基因家族形成的重要原因。基因复制事件可直接导致miRNA家族成员基因的快速增加，从而使某些miRNA基因产生功能分化,最终导致了个体复杂性的增加及新物种的形成。在此我们对脊椎动物中具有重要生物学功能的miRNA家族，miR-181的起源及进化进行了分析，发现该家族基因可能起源于低等尾索动物，尾索动物只具有该家族成员的一个拷贝，而在脊椎动物中该家族由6个成员基因组成。我们发现该基因家族由祖先基因经次整体复制伴随一次片段复制而形成，我们的发现为基因组整体复制及片段复制同时作用而导致miRNA家族扩增提供了证据。第二章 miRNA-430基因家族进化及功能分析2.1 miRNA-430的分布与串联复制在斑马鱼(D.rerio)中最大的mir-430簇分布在4 号染色体上约20 kb 的一个区域内，它包括了约60 个pre-miRNAs。在之前的研究中，人们观察到在该簇中三个miRNA组成了三联体(mir-430a, c 和b)， 并以此为基本单元在该区域内复制。通过进一步比较这些pre-miRNAs 及其旁侧序列， 我们发现通常不完全相似的两个三联体(前体序列间的距离和序列有明显差异)进一步组成一个六连体，并以六连体的方式在该簇中复制。同样，我们在红鳍东方鲀(F. rubripes)和黑青斑河豚(T. nigroviridis)中也观察到了mir-430miRNA 簇, 但这些簇的结构却完全不同：红鳍东方鲀中2 个miRNA(mir-430c 和a) 组成二联