毕业设计（论文）-大豆种子超氧化物歧化酶(SOD)提取研究.doc

扬州工业职业技术学院毕业设计第一章 绪论1.1 超氧化物歧化酶的现状研究进展超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase, 简称SOD)是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。生物体的自由基来源有外源性和内源性两类。外源性自由基产生的主要原因是物理的或化学的因素，内源性自由基主要是由非酶反应和酶反应产生。一般来说，内源性自由基主要是指氧自由基及其活性衍生物。在正常生理情况下，机体通过自由基的产生与清除来维持一定的生理低水平的自由基浓度，这个浓度是处于动态平衡状态的，因为某些生理作用或生化反应中需要氧自由基如O2-,-OH等参与。但在某种病理情况下，自由基的产生与清除失去平衡，结果造成对机体的损害。氧自由基oxygen free radicals，OFR)是一类非常活跃的不稳定的代谢物，能使一些重要的生物分子包括蛋白质、类脂和核酸发生改变。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等酶能调节OFR的水平，一些分子比如维生素E,A,C,K及硒、半胱氨酸和一些混合物等也能调节它的水平。增加OFR水平可造成这些代谢物的过表达或控制系统的损伤，从而导致诸如动脉粥样硬化、关节炎、纤维化、肺、心脏损伤、神经失调以及癌症等疾病1。近来医学上大量研究表明人体多种疾病如癌症、心脏病、中风、肺气肿、炎症的发生、发展与恶化都涉及到氧自由基。特别是与O2-有直接关系。而作为其清除剂的SOD倍加受到人们的重视。SOD对自身免疫性疾病、放射病、肺炎、骨髓损伤，SOD与放疗联用治疗癌均有一定效果，以上研究SOD都来自动物血液及脏器。20世纪70年代以来，国内外学者先后从豌豆、菠菜、麦胚、大豆、黄瓜、红松、小白菜等十儿种高等植物中发现有SOD存在，且与多种逆境有关。高浓度SO2、O3持续低温与强光照都能诱发植物体内有过剩自由基的产生,SOD的下降。1.1.1 SOD 的种类与分布根据 活 性 中心所含金属离子的不同，SOD主要分为Cu·Z n-SOD, Fe-SOD和Mn-SOD 3种1。Cu·Z n-SOD主要存在于真核细胞的胞液和叶绿体中，呈现蓝绿色，相对分子量约为32 000。它由2个亚基组成，每个亚基各有1个Cu离子和1个Zn离子。 Fe-SOD和Mn-SOD很相似，但是它们有明显的差异氨基酸以及对过氧化氢的敏感性。Fe-SOD多见于原核细胞及少数植物细胞中，为黄褐色，相对分子量是38 700左右。它是由2个亚基组成的，每个亚基中各含1个Fe离子。紫红色的Mn-SOD在原核生物细胞及线粒体中也比较常见，相对分子量在40 000左右。原核细胞中的Mn-SOD是由2个亚基组成，而来自真核细胞线粒体中的Mn-SOD，是由4个亚基组成，且每个亚基各含有1个Mn离子。3种SOD在许多方面都有不同点，见表1。表 1 3种常见的叙化物歧化酶(SOD)的比较项目 Cu·Z n-SOD Fe-SOD Mn-SOD主要存在部位 真核细胞的细胞质 原核细胞及 原核细胞和和叶绿体的基质中 少数植物中 真核细胞线粒体中颜 色 蓝绿色 黄褐色 紫红色亚基种类及数量 2或4个相同的亚基 2或4个相同的亚基 2或4个相同的亚基亚基相对分子量 16 000 23 000 23 00090年代，人们又陆续从链霉菌属中发现了Ni-SOD和Fe·Z n-SOD，在牛肝中发现了一种Co- Z n-SOD等不同的SOD，这些都是少见的SOD2。1.1.2 SOD 的结构19 75 年 Richardson得到了Cu.Zn-SOD的三维结构Cal，发现它是由2个基本相似的亚基组成的二聚体，且每个亚基含有1个铜原子和1个锌原子。2个相同亚基之间通过非共价键的疏水相互作用而缔合，类似于圆筒的端面。Cu·Zn-SOD的单个亚基活性中心结构3见图1。图1，Cu·Zn-SOD的单个亚基活性中心结构从图中可知Cu与4个来自组氨酸残基(His44，46，61，118)的咪哇氮配位呈现1个三角双锥畸变的四方锥构型,Zn则与3个来自组氨酸残基(His61，69，78)的咪哇氮和1个天门冬氨酸残基(Asp81)的梭基氧配位，呈畸变的四面体构型。Mn - SO D和Fe- SOD的结构则比较简单，且二者相似，每个亚基的活性中心金属离子，都是与1个水分子和3个组氨酸(His)残基及1个天门冬氨酸(Asp)残基的梭基氧配位，呈畸变四方锥构型, Mn-SOD和Fe-SOD一般为二聚体或四聚体，每个亚基含0. 5-1. 0个Mn和Fe原子.它们在空间结构上与Cu·Zn-SOD不同，含有较高程度的。一螺旋，而P-折叠较少。现已有多种生物中的SOD的三维结构登录到GenBank中，并且对其内部结构特征进行了分析。目前，通过X-射线衍射分析、光谱分析、核磁共振谱、电了光谱，及电镜等多种近代分析方法和研究手段，获得了不少有关SOD活性中心的分子结构信息。Cu/Zn-SOD酶由两个亚基组成，每个亚基各含一个Cu2+和一个Zn2+, Zn2+和Cu2+都处于四面体配位环境中，Cu2+位于一扭曲的四方平面中，分别和44位、46位、61位和118位的组氨酸形成配位键，Cu2+和Zn2+之间共连1个组氨酸H61的咪唑基形成含咪唑桥的扩展结构铜和锌的配位情况见图1-2；Mn-SOD和Fe-SOD各只含一个亚基，锰离子处在三角双锥的配位环境中，其中一个轴向配体为H2O，另一个轴向位置为蛋白质辅基的配位基; Fe-SOD的活性中心是由3个His-Im-N和1个天冬氨酸羧氧基成扭曲四面体配位图2铜和锌的配位图1.1.3 SOD 的催化机理超氧化物歧化酶作用的底物是超氧阴离子自由基(O-2) ,它既带一个负电荷,又只有一个未成对的电子。在不同条件下, O-2 既可作还原剂变成O2 ,又可作氧化剂变成H2O2 ,H2O2又在过氧化氢酶( Catalase ,CAT) 的作用下,生成H2O 和O2 ,由此可见,有毒性的O-2 在SOD 和CAT共同作用下,变成了无毒的H2O 和O2 。其作用机理如下4:第一步 第二步 1.1.4 SOD 的活力测定SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与CN抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一1。 在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。 1.2 SOD的理化性质SOD是一种酸性蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，因此它对热，pH以及某些理化性质表现出异常的稳定性，SOD的主要理化性质见表1-1。表2 SOD的某些理化性质6类型理化性质Cu/Zn-SODMn-SODMn-SODFe-SOD分子量32,00044,00080,00040,000含有金属数2 Cu，2 Zn2Mn4 Mn2Fe最大光吸收/nm紫外线258280280280nm可见光680475475350氨基酸组成特点酪氨酸和色氨酸缺乏含酪氨酸和色氨酸含酪氨酸和色氨酸含酪氨酸和色氨酸1mol/LKCN抑制明显抑制无无无H2O2处理明显失活无影响无影响明显失活SOD是金属酶，用电子顺磁共振测得，每mol酶含1. 93 mol的Cu和 1. 8 mol的Zn(牛血SOD)；1. 84mo1Cu和1. 76mo1Zn(牛心SOD)。实验表明，Cu与Zn的作用是不同的，Cu与催化活性有关，透析去除Cu则酶活性全部丧失，一旦贡新加入，其活性又可重新恢复；而Zn对维持酶分子结构的完整性有着重要的作用。有实验表明:在Cu/Zn- SOD中，一旦与Zn结合的组氨酸和天冬氨酸被丙氨酸取代，则酶的折叠结构及完整性遭到破坏。在Mn和Fe- SOD中，Mn和Fe与Cu一样，对酶活性是必需的6。1.2.1 SOD的亲水性SOD是能在水中有较好溶解性能的蛋白质，结构已研究较多的牛红细胞Cu/Zn-SOD中，已知310个氨基酸残基，其中30%是极性氨基酸，仅有3%左右的芳香族氨基酸残基，因此决定其具有较好的溶解性能。1.2.2 歧化反应速度在Cu/Zn- SOD催化下歧化反应的速率常数大约为1.8×109（mol/L）-1S-1，而且在pH5. 3-10. 5范围内几乎不变。在pH7. 0时，M n- SOD与Cu/Zn- SOD催化速率常数一样，但在碱性条件下明显减小(pH=7.8时，k=1.8×109（mol/L）-1S-1，pH= 10. 2时，k=0.3×109（mol/L）-1S-1)。而也有不同实验表明：Mn- SOD有较宽的最适pH范围( pH7- 11)。Fe- SOD在高pH下活性降低17。1.2.3 温度对SOD的影响Cu/Zn- SOD对热稳定，天然牛血Cu/Zn-SOD在75下加热数分钟，其酶活性丧失很少。在离子强度很低的情况下，加热至95 0C, Cu/Zn- SOD的活性损失亦很少，构象熔点温度Tm的测定表明是迄今发现热稳定性最高的球蛋白之一。而Mn-SOD对热比较敏感。1.2.4 pH对SOD的影响酶活性受pH值的影响，这是人所共知的理论，对SOD来说，pH值改变将会改变酶蛋白金属辅因子的结合状态，而影响其活性。一般认为SOD在pH5.3-9.5范围内，其稳定胜较好，对pH不甚敏感。SalimML等报道Cu/Zn-SOD在pH5.3-9.5范围内基本稳定，在此范围内可见紫外光谱和电子自旋共振波几乎不发生改变，显示了较强的结构稳定性。李泽浩报道在pH为3.6时，Cu/Zn-SOD中95%的Zn2+离子要被脱落，在pH小于6.0时，Cu2+的结合位点仅要移动，pH大于12.2时，酶的构象会发生变化而失活。据有关材料介绍，将SOD溶于不同pH值的磷酸盐缓冲液中，于30保温并定时测活力，发现：猪血SOD在pH7.6-9.0时比较稳定，pH6. 0以下，12.0以上不稳定，pH2.0时极不稳定，l0min酶活力仅为12.5%，45min仅为3%。阂丽娥等人将蜂王浆Cu/Zn-SOD在不同pH值磷酸钾溶液中，测得此酶的最适pH为8.3, pH高于或低于8.3,酶活力均有明显下降趋势，pH在8.0以下和8.5以上，酶活力为零。牛血红细胞的Cu/Zn-SOD和来自细菌中的Fe-SOD对pH表现很不敏感，即使将其保存在(NH4)2SO4中1年其活性仍不见下降17。1.3 SOD 的应用 与其它抗氧化剂一样,SOD 可作为罐头食品、果汁、啤酒等的抗氧化剂,防止过氧化酶引起的食品变质及腐败现象;还可作为水果、蔬菜等的良好保鲜剂。另外还可以作为营养强化剂加入食品中制成新的保健食品,例如绿茶饮料有预防龋齿、敏感症、痛风、降压、抑制氧化等作用，番木瓜SOD 酒采用低温生物技术发酵而成,是一种低度纯天然的绿色健康型果露酒,能帮助消化,消除慢性胃炎,舒张血管, 降低血压等作用。目前已开发的还有蛋黄酱、酸牛奶、可溶性咖啡、奶糖等产品。SOD在医学上有着广泛的应用。人类机体所处的环境复杂，体内经常不断地产生自由基，特别在病理过程中，产生大量的，这些反过来促进病情加重，因而SOD在清除中则显得异常重要。SOD 是生物体防御氧毒性的关键性防线。SOD 的药用研究, 国内外主要用于治疗因超氧阴离子伤害引起的疾病如心肌缺血与缺血再灌注综合症、类风湿关节炎、红斑狼疮等。此外，SOD对治疗贝切特氏病、心肌梗塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射线作用等也东圃渴望有效56。1.4大豆与SOD的生产SOD广泛存在于动物、植物、微生物等体内。如果能从各种生物体内提取出SOD，使其广泛的应用于医疗、保健、食品等方面，这项技术将会带来巨大的社会效益。国外SOD提取纯化上艺在70-80年代已经成型，目前的研究方向主要在医疗方面的检测应用。而国内在此方面的发展远远落后于国外。在90年代才刚刚起步，工艺水平大大落后于国外。目前，国内外有许多方法从各种生物体内提取、纯化SOD。如:猪血、牛血蚕豆、高山红景天、花生种子、蔬菜、紫草种子、大豆种子、茶叶、酵母等。但是，这些提取工艺比较复杂、难度高，而且原料不易获得，只能少量制取，不适合大规模工业化生产7。大豆是我国北方一种主要的农作物，种植面积大，产量高，可以说是资源丰富且价格低廉。不仅如此，大豆中SOD的含量较一般的植物高。而且，相对于动物和微生物而言，植物不易受各种病毒和细菌的感染。因此，从大豆中提取SOD的工艺，有很大的发展潜力和良好的市场前景。第2章 实验原理2.1超氧化物歧化酶活性测定超氧化物歧化酶(SOD)广泛存在于各种生物体内, 自从1969 年Mccord等 发现SOD 以来,它在临床医学、药学等领域得到广泛应用。因此,各种各样的SOD 测活方法也随之建立,如比色法、化学发光法、放射免疫法、等电点聚焦法、极谱氧电极法等910。其中,经典的邻苯三酚自氧化法(即Marklund法8) 应用较广。该法具有仪器简便、试剂价廉、操作简单等优点。但在实际应用中也存在一定的问题,最突出的是该法所使用的缓冲液的组分较混乱, 如原法的缓冲液为“三羟甲基氨基甲烷(Tris)2二甲砷酸”11 ,也有的用“Tris2二甲砷酸钠2HCl”1213作缓冲液,更多的则采用“Tris2HCl”作缓冲液141516。二甲砷酸钠为剧毒药品,当避免使用该药品时,对该测活体系究竟有何影响。另外, 原法中对缓冲液介质的选用依据及缓冲液浓度的确定依据未做详细说明, 而有关这方面的详细研究也未见报道。因此,本文对经典的邻苯三酚自氧化体系的诸多影响因素进行了条件优化,采用新的改良体系,使实验结果更加准确可靠。2.1.1 SOD的活性测定方法SOD的活性测定方法很多，主要有五种：邻苯三酚法17，肾上腺素法18，核黄素-NBT法19，亚硝酸盐形成法20和细胞色素C还原法21。他们的主要有以下特点：亚硝酸盐形成法灵敏度最高，其次是核黄素-NBT法和邻苯三酚法，细胞色素C还原法灵敏度最低。亚硝酸盐形成法和核黄素-NBT法，特异性强，测定结果稳定，重复性好，所用仪器也简单，但这两种方法试剂配制较繁，操作较复杂，而且测定时间较长，个别试剂昂贵。邻苯三酚法灵敏度较高，稳定，重复性好，试剂配制简单，操作方便，测定快速，可在420nm测定。溶液pH对其氧化速率影响较显著。此法测定SOD是应严格控制反应体系pH值。肾上腺素法也较简便，所用试剂简单，但稳定性较差，干扰因素较多，受温度影响较显著，不易控制，而且灵敏度不如邻苯三酚法。细胞色素C还原法，虽为经典方法，但灵敏度低，干扰因素较多，测试温度要求严格，需有恒温装置，所用试剂较昂贵，配制不易掌握。 结合实验室能力和经济实力及要求，邻苯三酚法最适合在实验室使用，而且比较稳定和便于掌握。邻苯三酚的自氧化速率不能100%的被SOD抑制，有少部分自氧化作用非O2-所催化，用抑制50%自氧化速率的酶量作活性单位，不能准确反映酶活性的大小。只有规定抑制率达到邻苯三酚最大抑制率50%的酶量为一个活性单位才准确。邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,生成一系列在400425nm 处有强烈光吸收的中间产物,并同时释放出O-2 ,SOD 是专以O-2 为底物的金属酶,在有质子的介质中,它能迅速将O-2 歧化,产生O2 和H2O2 ,从而阻止了中间产物积累,据此可测定SOD 的活性。2.1.2 邻苯三酚的自氧化法测定的影响因素1缓冲液介质组成对邻苯三酚自氧化速率及测活灵敏度的影响经典邻苯三酚自氧化法中,缓冲液介质组成较混乱,有的在缓冲液介质中加入二甲砷酸钠, 大多在缓冲液中加入EDTA。,二甲砷酸钠对该测活体系无论是邻苯三酚自氧化初速率还是SOD 抑制率均无显著影响。由于砷是剧毒物,在测活体系中无需加入二甲砷酸钠。缓冲液中的EDTA 量虽小, 但其作用却很大, 因为很多金属离子均可催化邻苯三酚自氧化。无EDTA 时,邻苯三酚自氧化速率很高、吸光值( A0 ) 与时间的线性范围小、SOD 抑制率很低,故向缓冲液中加入适量EDTA 是必要的。2.EDTA 加入量的影响当体系中EDTA 加入量大于0. 1 mmol/L 时, 邻苯三酚自氧化速率及SOD 抑制率均基本保持不变;而当其加入量小于0. 1 mmol/L 时, 邻苯三酚自氧化速率大大加快, SOD 抑制率显著降低。因为一定量的SOD 其歧化O-2 的能力是一定的,随着邻苯三酚自氧化速率的增加, O-2的生成速率也在增加,结果必然造成等量SOD 对邻苯三酚自氧化速率的抑制率降低,从而使方法的灵敏度下降。因此体系中EDTA 加入量不应小于0. 1 mmol/L , 12mmol/L EDTA 加入量是安全可取的。 图3 EDTA 浓度的影响 图4 pH 的影响3.pH 值对邻苯三酚自氧化速率及SOD 抑制率的影响邻苯三酚自氧化速率随pH 的升高而增大,SOD 抑制率则降低。其中在pH = 7. 708. 20 范围内,pH 变化对SOD 抑制率影响不太大,但当pH 低于或高于此范围时，微小的pH 变化会引起邻苯三酚自氧化速率的显著变化,从而导致SOD 抑制率的显著变化。当pH < 7. 50 时, 虽然SOD 抑制率很高, 但此时由于邻苯三酚自氧化速率很低,不便于A0的准确读数。综合考虑诸因素的影响,选pH 8. 00 作为缓冲液适宜的pH。4.不同组成的缓冲液对邻苯三酚自氧化速率及SOD 抑制率的影响 目前,文献报道的经典邻苯三酚法缓冲液采用“Tris2HCl”者为多,但对其选用依据未作详细说明。本文在固定缓冲溶液的pH 及浓度, EDTA 加入量也不变的条件下,改用不同介质组成的缓冲液进行实验, 缓冲溶液介质组成对该测活体系影响很大,所测定的9种缓冲溶液中,第3 种组成最佳, 测量的线性范围时间较长, 且SOD 测活灵敏度显著高于其它缓冲溶液。文献22报道,Cl-对SOD 有一定的抑制作用。当用醋酸代替原法中的盐酸时,可大大提高SOD 对O-2的竞争力,从而使体系的测活灵敏度大为提高。 H3BO3和Na2B4O7 不适合用作该测活体系的缓冲液介质,因为当缓冲液中含有它们时,邻苯三酚自氧化速率数分钟内几乎不变,即在420nm 处测不到A0 值。这可能是硼酸的存在阻碍了邻苯三酚的自氧化,因为硼酸可与含两个邻近羟基的化合物可逆地形成环状的硼酸酯。5.缓冲液浓度对邻苯三酚自氧化速率及SOD 抑制率的影响 以pH 8. 00 的Tris2HAc (内含2 mmol/L EDTA) 为缓冲液,缓冲液浓度变化对本测活体系的影响也很大,缓冲液浓度愈低,邻苯三酚自氧化速率愈小,等量SOD 的抑制率就愈高。选0. 01 mol/L 为缓冲液的适宜浓度,既提高了测活灵敏度,又节省了试剂。第3章 实验步骤3.1 样品、主要试剂及仪器3.1.1 样品来源大豆，农贸市场购得3.1.2 主要试剂表3 主要试剂主要试剂生产厂家邻苯三酚（化学纯AR）丙烯酰胺（化学纯）N-N 亚甲基双丙烯酰胺十 十二烷基硫酸钠氯化硝基四氮唑蓝硫酸铵（分析纯AR）考马斯亮蓝G250中国医药（集团）上海化学试剂公司成都科龙化工试剂厂成都科龙化工试剂厂成都科龙化工试剂厂中国惠世生化试剂有限公司天津市科密欧化学试剂有限公司日本进口分装其他试剂：磷酸缓冲液，聚乙二醇 20000 ，三羟甲基氨基甲烷(Tris ,AR ,) ，四甲基乙二胺， 蔗糖 ，甘氨酸 ，核黄素 ，H2O2 ，溴酚蓝等均为化学纯或分析纯。3.1.3 主要仪器组织捣碎机（用蒜泥器替代），722紫外分光光度计日立高速冷冻离心机CR22G恒温水浴锅DYY-6C型电泳仪，3.2 实验内容3.2.1 大豆匀浆粗提液的制备磷酸盐缓冲液提取法制备：将大豆种子洗净后在4下蒸馏水吸胀，称取膨胀后的大豆种子50g，按每克大豆种子加2ml磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH7.8），破碎并匀浆，先用四层纱布过滤，再抽滤取上清液，然后15 000rpm，4离心20min，上清液即为SOD粗酶液，取两份备用，各50ml。3.2.2 SOD样品的提取由文献可知23目前使用较多的提取方法有硫酸铵分级盐析法和铜盐热变性法两种。以这两种方法做比较，分别提纯样品：1）硫酸铵分级盐析法：将硫酸铵晶体研磨成粉末，称取14.55g的硫酸铵粉末，缓慢加入到50mlSOD粗提液中，使之达到50%的饱和度，再放置与4冰箱中30min，10 000r/min，冷冻离心20min，除去沉淀杂蛋白，取上清。在上清液中逐渐再加13.4g硫酸铵粉末使之达到90%饱和度，置于4摄氏度冰箱中2h，10 000g冷冻离心20min，收集沉淀。将沉淀溶于磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH7.8）中，透析，测体积，即为SOD提取液1。2）铜盐热变性法：植物SOD有较好的热稳定性，在70以下加热10min，抑制活性几乎无明显变化，80活性下降50%，90加热10min，活性几乎完全丧失。而大部分杂质蛋白则在不到70时就已经变性，根据SOD的该特性，可以对SOD进行提取。 将另一份50ml上清液与1ml，浓度为0.25M/L硫酸铜溶液置于60水浴锅中20min，使杂蛋白变性，然后15 000g 4离心20min，上清液即为SOD提取液2。2.2.3 SOD活性测定由文献知24，邻苯三酚法可作为快速检测SOD活性的首选方法。所需试剂的配置：邻苯三酚溶液：用10mmol/L的盐酸溶液配制成45mmol/L的溶液，此溶液需临用现配。Tris-HCl-EDTA缓冲液：配制50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，内含1mmol/L的EDTA溶液，调pH为8.2。（1）邻苯三酚自氧化速率的测定，取pH8.2的Tris-HCl-EDTA缓冲液4.5ml于10ml试管中，加4.46ml蒸馏水，于25恒温20min，再加入25恒温的45mmol/L的邻苯三酚溶液40l，混匀后迅速于1cm石英比色杯325nm波长25测光密度值，每隔30s测一次光密度值共测4min，求出邻苯三酚的自氧化速率/min。同时用10mmol/L的盐酸做空白试验26。（2）SOD活性测定：取pH8.2的Tris-HCl-EDTA缓冲液4.5ml于10ml试管中，加4.45ml蒸馏水，25恒温20min，加入已恒温至25的样品溶液10l迅速混匀，加40l邻苯三酚于325nm波长测定光密度值，30s测一次，测4min，求出光密度变化速率。（3）计算：由两种提纯方法提取得的样品分别进行邻苯三酚法测酶活力。有公式：酶活力（U/ml） （1）反应液总体积，ml测定样品体积，l n样品稀释液倍数邻苯三酚的自氧化速率。样品光密度值变化速率。3.2.4 SOD的电泳（1）采用圆盘电泳的方法，根据表2-1配置浓缩胶为4%，分离胶为10%，起始电压70-80V，起始电流20-30mA，2-3h，分别点样样品液1、2各20微升。电泳完成后分别进行蛋白质常规染色和SOD酶活性染色。表格4 不连续电泳浓缩胶和分离胶配方28贮液凝胶终浓度T（C=3%）4%10%单体贮液/ml0.653.8浓缩胶缓冲液贮液（ml）0.10分离胶缓冲液贮液（ml）0.3双蒸水（ml）4.2510.910%过硫酸铵（l）1550TEMED（l）525注：在加过硫酸铵以前，溶液应抽气，过硫酸铵应该在即将灌胶前加。过硫酸铵和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。凝胶聚合后，应在4保存12h再用，以使凝胶充分聚合，孔径均匀，改善电泳分辨率。（2）蛋白染色脱色，0.04%考马斯亮蓝G-250溶于3.5%过氯酸+20%的甲醇溶液中，固定和染色到见带为止约1.2h，用5%醋酸+20%甲醇脱色28。（3）SOD活性染色29，黑暗中将电泳后的凝胶片浸泡于氮蓝四唑（NBT）20min，然后将凝胶片移入含有0.028M四甲基乙二胺（TEMED），核黄素和0.03pH7.8磷酸钠缓冲液中，浸泡15min，最后将胶片浸在含有0.05M磷酸钠缓冲液pH7.8，EDTA溶液，并用4000lx光照25-30min，SOD同工酶活性谱带是出现在蓝色背景上的无色透明区带。第4章 实验结果与讨论4.1 硫酸铵分级盐析法和热变性法的对比：由文献8知，邻苯三酚法可作为快速检测SOD活性的首选方法。首先，按照使用步骤要求，利用紫外分光光度计测量出现场配置的邻苯三酚自氧化速率。如实验要求配置溶液并混匀后，迅速于1cm石英比色杯325nm波长测光密度值，每隔30s测一次光密度值共测4min，求出邻苯三酚的自氧化速率/min。表5 邻苯三酚自氧化速率数据表：时间（s）0306090120OD值0.0960.1480.2060.2590.301时间（s）150180210240OD值0.3540.3990.4440.437=( 0.110+0.111+0.101+0.095+0.092+0.090+0.088)/70.098/min分别加入两种使用不同初提方法的样品溶液10l到4.5ml蒸馏水中，并迅速混匀，再加40l邻苯三酚于325nm波长测定光密度值，30s测一次，测4min，得如下：表6 盐析法处理后的样品酶液的光密度变化速率ODb1时间（s）0306090120OD值0.0640.1110.1590.2050.253时间150180210240OD值（s)0.2980.3440.3880.432ODb1=(0.095+0.094+0.094+0.093+0.091+0.090+0.088)/70.092/min表7 热变性法处理后的样品酶液的光密度变化速率ODb时间（s）0306090120OD值0.0450.0880.1320.1740.217时间150180210240OD值（s)0.2590.3010.3400.382ODb2=(0.087+0.086+0.085+0.085+0.084+0.081+0.081)/70.084/min由公式： V1反应液总体积，ml V2测定样品体积，ml （10l） n样品稀释液倍数 ODa邻苯三酚的自氧化速率。 ODb样品光密度值变化速率。 V1-反应液体积为15.5ml，可得：U盐=（0.006/0.098）×2×15.5×1/0.01189.79 U热=（0.014/0.098）×2×15.5×1/0.01442.86可以看出，使用热变性法粗提SOD效果较好，是较好的选择。且实际操作中，盐析法步骤繁琐，消耗大量药品及样品，而热变性法只有一步操作，且效果明显，故推荐使用铜盐热变性法初步提纯大豆种子SOD。4.2 SOD的电泳及染色取热变性法提纯后的SOD酶液为样品，首先用聚乙二醇（PEG）吸水浓缩，再用圆盘电泳法电泳30min，固定后，用考马斯亮蓝法进行常规染色。图4 大豆种子SOD酶液，圆盘电泳常规染色，可见明显分为4或5带：正极负极图5 热变性处理的样品（左）与粗酶溶液（右）电泳效果对比：可以看出，粗酶液为混杂的蛋白，而经过热变性法初步除杂，分为明显的带。图6 大豆种子SOD活性染色亮带4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳的活性染色鉴定SOD的种类图7 大豆SOD变性剂法鉴定同工酶过氧化氢（左）、氯仿-乙醇（中）、磷酸缓冲液（右）右端：是在磷酸缓冲液（PBS）处理后，NBT活性负染。可以看出有3条SOD同工酶带，其中近负极端有两条弱带，远离负极端有四条较强的同工酶带，因为在PBS缓冲液中，SOD未受任何抑制。中间：是在氯仿-乙醇处理后，活性负染，在远离负极端呈现活性带，并且活性有所丧失，而近负极端未显酶带，这是因为在氯仿-乙醇作用下，只有Cu.ZnSOD留存,并且活性被部分抑制。左端：是在过氧化氢作用下,再NBT活性负染,在近负极端呈现两条活性带,而远离负极端不显酶活性带,因为在过氧化氢作用下,MnSOD有活性。我们可以看出，在大豆种子中，最主要的SOD同工酶类型是Cu.ZnSOD，以及少量的MnSOD。结 论SOD 是一类清除自由基的蛋白酶,对需氧生物的生存起着重要的作用,是生物体防御氧毒性的关键。迄今为止,科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。本文采用磷酸盐缓冲液提取、铜盐热变性法及硫酸铵分级盐析法提取的方法,对大豆种子超氧化物歧化酶(SOD)进行了提取 。通过实验得到，用铜盐热变性法较硫酸铵分级盐析法好，得到的样品更纯，比活力更高。本文通过用邻苯三酚测SOD活性的方法测定SOD提取物的活性，并为进一步研究提供了一些理论与实践的依据。基于金属辅基不同,SOD可以分为Cu/ Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 三种类型。用上述方法只能测定总SOD的活性，而不能确定究竟是那种SOD 在起作用。所以在本文中进一步通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的活性染色，根据H2O2，CHCl3-CH3CH2OH对不同SOD的抑制作用不同，进行活性染色，对大豆种子中SOD的种类进行了鉴定。从而使我们不仅可以确定大豆种子中含有丰富的SOD，而且可以确定绿豆种子含有较多的Cu/ Zn SOD和少量的Mn-SOD谱带。通过实验，进一步加深了对生化提取与分离方法的认识，熟悉了常见的生化提取与分离方法的特点，掌握了从生物组织中提取酶并测活性的操作，对SOD这种生物机体内十分有用的酶有了更加深入的认识，为今后从事生物科学方面的研究打下了基础。实验中遇到的问题： 1、大豆匀浆的制备：在制作大豆匀浆的时候，出现在最大问题是缺少可用的高速匀浆机。单凭研钵来手工研磨，不久效率极其低下，且匀浆效果很差。而后从菜市场购得蒜泥器替代匀浆机，效率大大提高，但效果仍然不及高速匀浆机。2、粗酶液的制备：匀浆中除了渣滓外，还有另外一种杂质，即大豆种子中的油脂成分。将原液置于冰箱数小时后便出现可见油脂分成。在第一次冷冻离心后，油脂凝固于上清液面之上，即可小心除去。查阅外文文献，得知一简便除杂方法，即直接将聚乙二醇（PEG）加入离心管直接离心，不仅可以除杂质，还能够吸水浓缩。碍于PEG消耗太大，未能使用该方法。3、硫酸铵盐分级盐析：硫酸铵溶解度受温度影响，粗酶液需要保持室温。硫酸铵经过研磨后溶解速度快。4铜盐热变性法：SOD主要以铜锌类型存在，在热变性时，加入氯化铜，有助于保护SOD。植物SOD热稳定性好，热变性法除杂简便易行，效果也高。5、电泳：蛋白质电泳可用圆盘电泳法和垂直板电泳法进行，一般来说，垂直板电泳效果更好，便于比较。本次实验中，都分别多次进行了电泳，但由于操作熟练程度和器材效果，最后选取的是圆盘电泳。6、常规染色和活性染色：在利用样品液点样的时候，多次出现样品SOD浓度过低的现象，在有限的加样条件下，不得不进行样品液的浓缩，经查阅相关文献，确定利用透析带和聚乙二醇（PEG）的效果最好，且PEG可以经过烘干重复使用，试剂消耗小。常规染色使用考马斯亮G250染色，染色与固定同时进行，在加热条件下染色更快。NBT活性染色中，注意光照的影响。参考文献1.刁治民.超氧化物歧化酶的研究及应用前景.青海科技.1995,2(1):1-6.2.王岚.超氧化物歧化酶的研究及应用概况.武汉工业学院学报.2002,(1):37-38.3.汪立耀.超氧化物歧化酶的制备及其临床应用.武汉化工学院学报.2003,25(4):16.4.靳月华,陶大立,杜英君.沙棘果汁及叶片中超氧化物歧化酶的初步研究.沙棘.2002,15(4):27-31.5.王岚.超氧化物歧化酶的研究及应用概况.武汉工业学院学报.2002,(1):37-38.6.李文楚,章羽,陈芳艳.超氧化物歧化酶研究及应用概况.广东蚕业.42（1）:45-49.7.杨东升.超氧化物歧化酶的研究与应用.化学与生物工程.2004,(3):7-9.8.许平.袁原.大蒜超氧化物歧化酶活性测定及某些性质研究J渝州大学学报(自然科学报),1997,14(1):4347.9.陈执中.中国医药杂志.1989,24(10):582584.10.袁勤生.中国医药工业杂志.1989,20(10):473477.11.Marklund S.Marklund G.Eur.J.Biochem,1974 ,47: 469474.12.陈执中.中国医药杂志.1989,24(10):582584.13.袁勤生.王志友.翁清清等.医药工业.1983,16(1):1619.14.袁勤生.中国医药工业杂志.1989,20(10):473477.15.静天玉.赵晓瑜.生物化