牛乳中抗生素残留的检测_本科生毕业论文(设计).doc

黑龙江东方学院本 科 生 毕 业 论 文（设 计）牛乳中抗生素残留的检测黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）评语（一）姓名学号专业班级总成绩毕业论文（设计）题目：答辩委员会评语答辩成绩主任签字： 年 月 日答辩委员会成员签字学部毕业论文（设计）领导小组意见组长签字： 年 月 日 学部公章黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）评语（二）姓名学号专业班级毕业论文（设计）题目：指导教师评语指导教师成绩指导教师签字： 年 月 日黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）评语（三）姓名学号专业班级毕业论文（设计）题目：评阅教师评语评阅教师成绩评阅教师签字： 年 月 日黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）任务书姓名学号专业班级毕业论文（设计）题目：毕业论文（设计）的立题依据主要内容及要求进度安排学生签字：指导教师签字：年 月 日本表一式三份，学生本人、指导教师、学部各一份。黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）牛乳中抗生素残留的检测摘 要本实验采用国标TTC法，纸片法和试剂盒法三种微生物方法对哈尔滨市大型超市中不同品牌的13种牛奶进行抗生素检测,并对三种微生物法进行比较。实验结果证明：快速检测法比TTC法和微生物纸片法的灵敏度要高，国标TTC法检测结果不是很准确；纸片法虽然较准确但前序工作所耗时间特别长。本研究通过三种微生物法的检测结果的比较，为抗生素残留快速检测方法的补充提供理论依据。关键词:抗生素；TTC；纸片法；试剂盒iiTest the Antibiotics Survival in MilkAbstractThere are three methods in this experiment .They are GB TTC method, disk method and detection met.The experiment is testing the antibiotics survival in milk.The 13 kinds of milk in different brands of large supermarkets,and comparing the three methods in harbin. The result of experimental show that: rapid detection method is more sensitive than GB TTC method and disk method, but GB TTC method moreexact than.Though the disk method is more correctly,its pre-arranges time is ionger than others.   In this study, through the comparing in the results of three microbiological methods, it provides a theoretical basis for the supplement to rapid detection of antibiotic survival.Key words: antibiotics; TTC; disk method; detection met目录摘 要iAbstractii第1章 绪 论11.1 抗生素简介11.1.1抗生素的概念11.1.2抗生素的分类11.2 牛奶中抗生素残留的危害及其产生的原因21.2.1牛奶中抗生素残留的危害21.2.2牛奶中抗生素残留产生的原因31.3 牛奶中抗生素残留的现状31.4 牛奶中抗生素残留检测研究进展41.4.1 微生物检测法41.4.2理化检测法51.4.3快速检测试剂盒61.5 本实验研究的目的与意义7第二章 实验材料和方法82.1 实验材料82.1.1材料82.1.2 主要仪器和设备102.2 试验方法102.2.1 原料预处理102.2.2 TTC法132.2.3试剂盒法132.2.4 纸片法13第三章 结果与讨论153.1判定方法与结果153.1.1 TTC法153.1.2 试剂盒法163.1.3纸片法173.2 结果统计183.3 方法比较183.3.1从检测时间183.3.2从灵敏度上183.3.3 应用场所193.3.4判定结果的方便性19结 论20参考文献21致 谢22黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）第1章 绪 论牛奶是最接近“完善”的食品，它含有丰富的动物蛋白质和人体需要的氨基酸、维生素、矿物质、钙质、脂肪、糖类等多种营养成分，所以它不仅是新生儿天然的全营养食品，也是男女老少理想的营养食物。因此，各个国家对牛奶的质量与安全问题十分重视，与此同时，在检测技术上各国都进行大量的研究。随着抗生素在乳畜饲养业中的广泛应用，牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视1。对此，检测技术也迅速发展，以寻求简便、快速、准确、敏感性高的检测方法满足日趋严格的残留限量要求，保证人们引用牛奶的卫生和安全。1.1 抗生素简介1.1.1抗生素的概念 由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类代谢物，以及甚至用化学方法合成或半合成的化合物。1.1.2抗生素的分类  抗生素指由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类物质。自1940年以来，青霉素应用于临床，现抗生素的种类已达几千种。在临床上常用的亦有几百种。其主要是从微生物的培养液中提取的或者用合成、半合成方法制造。其分类有以下几种：（一）-内酰胺类青霉素类和头孢菌素类的分子结构中含有-内酰胺环。近年来又有较大发展，如硫酶素类、单内酰环类，-内酰酶抑制剂、甲氧青霉素类等。（二）氨基糖甙类包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等。（三）四环素类包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。（四）氯霉素类包括氯霉素、甲砜霉素等。（五）大环内脂类临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等。（六）作用于G+细菌的其它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等。（七）作用于G菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。（八）抗真菌抗生素如灰黄霉素。（九）抗肿瘤抗生素如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。（十）具有免疫抑制作用的抗生素如环孢霉素。1.2 牛奶中抗生素残留的危害及其产生的原因1.2.1牛奶中抗生素残留的危害1.2.1.1 产生过敏反应 由于一般的抗生素对热的稳定性高，牛奶加热杀菌无法将其破坏，所以混有抗生素的牛奶加工成奶制品后仍有大量的抗生素残留2，如果经常饮用此种牛奶，将反复受到抗生素的刺激而发生致敏。有报道称，一对青霉素高度敏感的病人，在食用含抗生素约 10 IU/mL 的商品奶后，发生了变态反应3。1.2.1.2 产生耐药性菌株 人类经常食用含抗生素的奶制品，某些细菌因长期接触抗生素而产生了耐药性，当机体发病时，因耐药菌株的存在而使治疗效果下降或完全失效，从而危及病人生命。1.2.1.3 造成人体肠道内的菌群失调 正常情况下，人体内的菌群维持在一个平衡状态，但当长期接触含抗生素残留的牛奶时，此种平衡状态将会遭到破坏，引起胃肠疾病和生理紊乱，如造成维生素缺乏和紫癫性损伤。1.2.1.4 其他危害 此外牛奶中抗生素残留会影响奶制品品质，如果用含抗生素的原料奶生产酸奶或奶酪等，则残留的抗生素将会抑制细菌的发酵，降低产量和质量，给生产者造成经济损失。1.2.2牛奶中抗生素残留产生的原因1.2.2.1 对泌乳期奶牛的用药治疗 对泌乳期奶牛用药不当或不注意安全时间是造成牛乳中抗生素残留的重要原因，尤其是采用乳房灌注治疗奶牛乳房炎时，更易造成牛乳中抗生素的残留。美国食品和药品管理局（FDA）调查结果表明，用药不当是造成牛乳中抗生素残留的主要原因4。1.2.2.2抗生素作为奶牛饲料添加剂使用 在饲料中添加抗生素，可有效抑制或杀灭畜体内的有害微生物，维持畜体胃肠道微生物的平衡，从而促进动物的健康，提高其生产性能但是，奶牛如果长期食用含抗生素的饲料，很容易造成牛奶中抗生素残留，这也是造成牛奶中抗生素残留问题的一个重要原因。1.2.2.3受到抗生素污染的挤奶工具和贮奶用具 某些奶牛场由于操作不规范，在尚未彻底清洗和消毒患乳房炎的奶牛使用过的挤奶工具和贮奶设备情况下，用于其它健康牛只，造成抗生素残留问题。1.2.2.4 在牛奶中加入抗生素防止牛奶腐败 一些不法交奶户在高温季节为了防止牛奶酸败，在牛奶中掺杂各种抗生素通过抑制细菌生长以达到防止牛奶酸败，保持牛奶品质的目的，这也是牛奶中抗生素残留的一个重要原因。1.3 牛奶中抗生素残留的现状牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视5。联合国粮农组织（FAO）和世界卫生健康组织（WHO）早在 1969 年就提出，应对各种动物性食品中的抗生素残留规定允许标准，并建议在奶牛接受抗生素治疗停药后至少 3d（最好 57d）的牛奶不能作为食用奶的原料。欧美国家多年前即已明文禁止抗生素残留超量的牛奶上市（对青霉素类药物的限量为 410g/kg）。我国虽然也颁布了相关管理条例，但是由于各种原因牛奶中抗生素残留问题依然十分严重。丁洁等在2003 年对南京市牛奶中抗生素残留进行了调查6，发现消毒牛奶、奶粉、婴幼儿奶粉和生牛奶的阳性率分别为13.3% 、37.8% 、34.4% 、3.2% ；广州市卫生防疫站对广州市牛奶中抗生素残留进行监测，结果如下：消毒牛奶、奶粉、婴幼儿奶粉和生牛奶的阳性率分别为21% 、39% 、44% 、60% 。可见国内市场中牛奶抗生素超标现象十分严重，应引起社会重视7。1.4 牛奶中抗生素残留检测研究进展1.4.1 微生物检测法微生物检测法测定原理是根据抗生素对微生物的生理代谢作用的抑制作用，来定性或定量确定样品中抗生素的残留8，如纸片法（PD法），TTC 法，拭子法（STOP）等。微生物法具有费用低，操作简便，可靠性高等特点。但该方法必须经过几个小时才能观察到结果，测定的结果与试验菌株的敏感性，琼脂平板中的试验菌株数，培养基及其成分的pH值有关，且通过肉眼判断显色状态，容易产生误差。目前常用的两种方法是纸片法（PD法）和TTC 法。1.4.1.1纸片法 常用的纸片法包括枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片法9，主要用于检测牛奶中的-内酰胺类抗生素。枯草杆菌纸片法只适用于-内酰胺类抗生素的检测，检测限为0.01IU/mL，而嗜热脂肪杆菌纸片法不仅适用于-内酰胺类抗生素的检测，他还可检测到奶样中其它抗生素的存在，检测限为0.008IU/mL。1.4.1.2 TTC 法 TTC 法，即氯化三苯四氮唑试验，它是目前我国食品卫生标准中规定的检测牛奶中抗生素残留的检测方法10。此方法为向检样中加入嗜热乳酸链球菌和 TTC 试剂，通过观察显色状态的变化判定检样中有无抗生素存在。乳样中有抗生素存在，则在向检样中加入菌液培养时细菌不增殖，此时由于加入的指示剂 TTC 不还原，所以不显色。相反，如果没有抗生素存在，则加入菌液即进行增殖，TTC 被还原而显红色。也就是说当检样呈乳的原色时为阳性，微红色是为可疑，桃红色或红色时为阴性。目前 TTC 法检测的各种抗生素灵敏度如下：青霉素为0.004单位、链霉素0.5单位、庆大霉素0.4单位、卡那霉素5单位。1.4.1.3 DelvotestSP（ 戴尔沃检测法） DelvotestSP 检测法是由荷兰 Gist-brocades BV 公司开发的。其与先前的 DelvotestSP相似，但用时更短，只需培养 2h，对青霉素的检测灵敏度提高到 0.003-0.004IU/mL。它可检测的抗生素种类更多，包括青霉素 -G、氨苄青霉素、头孢噻林、新霉素、土霉素、阿莫西林、螺旋霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、四环素、金霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素、氯霉素、泰乐菌素和甲氧苄氨嘧啶等。D.Scannella，P.等通过实验比较 DelvotestP 和DelvoX-Press两种检测方法得出以下结论：DelvoX-Press能准确测定原料奶中的 - 内酰胺类抗生素，可应用于农场外散装原料奶的检测11。由于使用快速方便，价格更低，因此适合奶牛场的抗生素快速检测。1.4.1.4其它方法 Brilliant Black Reduction Test(亮黑裉色试验)是另一种重要的检测方法，包括德国的 AiM-Aanlytikin Mitch Production-und Vertiebs GmbH.BRIBRT Aim 和荷兰的Gist Brocades等。它所用的菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌。阴性样品呈黄色，否则呈蓝色。目前仍有许多关于新技术和方法的报道，如 Gaudin 发表了生物传感器方法测定 - 内酰胺类抗生素残留方法。1.4.2理化检测法理化检测方法的原理是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量12。它包括波谱法、色谱法及其联用技术，如 HPLC、GC、薄层色谱法（ TLC）、毛细管电泳（CE）等。理化检测法具有灵敏度高，可进行准确定性分析（ 给出被测组分的结构信息）和定量分析能力的优点，Takeba等人已经成功地使用 HPLC 同时检测出牛奶中三氯苯达唑及其代谢产物亚砜和砜；Pollmeier更是在十亿分之的水平上检测出牛奶中的阿维菌素类似物乙酰氨基阿维菌素。但理化检测程序复杂，且费用较昂贵。最常用的方法为高效液相色谱法和联用技术。1.4.2.1 高效液相色谱法 HPLC 是在经典的液相色谱法基础上发展起来的。通过引入气相色谱的理论和技术，发展了高分离效能的色谱柱和高灵敏感性的检测器，特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析，因此，高效液相色谱法成为目前广泛应用的一种抗生素残留检测手段。1.4.2.2 HPLC使用的检测器 目前在残留分析中使用的主要HPLC 检测器为紫外可见（UVD）、荧光（FLD）和电化学 (Echo）检测器。UVD 是应用最早和最广泛的 HPLC 检测器。目前绝大多数 HPLC 系统都配备有该种检测器。其灵敏度高，选择性较好，能满足残留分析的一般要求。UVD 对环境温度，流动相组成和流速变化不敏感，能适应等度和梯度洗脱13，对强紫外吸收的物质的检测限可以达到 1ng以下。在许多常规分析中，HPLC/PDA 是一种简便的定性分析方法。1.4.2.3 联用技术 各种分析技术联用是现代兽药残留分析的发展趋势。它一般集分离、定量和定性于一体，特别适用于确证性分析。张素霞等报道了用 M SPD-HPLC-UV 分析法检测牛奶中四环素类药物残留。样品平均回收率为 78.7% 90.2% ，变异系数在 2.4% 18.1% 之间，方法检测限为 0.020.05g/mL；贾薇等建立了一种用 C18 小柱进行固相萃取，液相色谱 - 质谱联用仪检测牛奶中 4 种四环素类的方法，每毫升牛奶中含四环素、土霉素及美他环素为 0.05g，金霉素0.1g时可以被定量检出；而 Van Bruiynsvoort则成功运用色谱联用技术测定了牛奶中的链霉素和二双氢链霉素。常见的联用技术包括：GC-M S、LC-M S、SFC-M S、CZE-M S 等。目前GC-M S 应用较多，而 LC-M S 是除 GC-M S 之外，又一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统。1.4.3快速检测试剂盒1.4.3.1微生物法 荷兰Gist-brocades BV公司开发了DelvotestP，DelvotestSP，Delvotest Cow Test，DelvotestMCS检测系列14。DelvotestP成型于20世纪70年代，主要用于检测内酰胺类抗生素，装在小型安碚瓶或者微孔板微孔中的琼脂里，含有用微胶囊包裹的标志微生物嗜热硬脂酸芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的芽孢和pH指示剂(溴甲酚紫)，同时包装内附有一瓶营养药片，检验时将营养药片与乳样同时放在培养基上，在64e温度下培养3h，培养基颜色由紫变黄表明抗生素残留阴性，颜色不变表示阳性。琼脂装在小型安碚瓶里的格式适用于小规模和单个试验，微孔板格式一次可以同时检测96个乳样，适用于大批量乳样检验。DelvotestP已经在全世界通用，可以检测到0.05IU/mL浓度的青霉素G。DelvotestSP则可以检测包含B-内酰胺类抗生素在内的更多抗生素(如磺胺类、泰乐霉素、红霉素、链霉素、庆大霉素、三甲氧卞二氨嘧啶等)。DelvotestSP的用法基本与DelvotestP相同，只是培养时间缩短为2h，对青霉素G的敏感度可以提高到0.03IU/mL0.04IU/mL。Delvotest Cow Test与DelvotestP小型安碚瓶格式除外装不同外，内容物和用法基本相同，还配有加热池，更适合牛奶场使用。Delvotest MCS是DelvotestSP的微孔板格式，但营养试剂已直接加入琼脂内，使用时无需再添加营养药片，操作更方便，但保质期短，适合于大型检测中心使用。1.4.3.2免疫法Snap法是美国IDEXX Laboratories Inc公司采用酶联免疫吸附(ELISA)原理，将酶化学反应的敏感性和抗原抗体免疫反应的特异性相结合的方法，其敏感性和特异性较好。在需要检测其他种类的抗生素时，可以选用对应的试剂盒进行检测。在检测结果方面，不仅可以知道结果的阴性阳性，而且也可了解所检测的结果是哪一类抗生素。Snap快速检测法耗时9min，结果重现性好，操作简便，但实验成本较高。1.4.3.3 基于受体分析法比利时UCB Byproducts公司开发的Beta-STAR检测法是将特定的B-内酰胺受体蛋白固定在试纸上，用胶体金有色微粒作为标记物，5min内可以检测到青霉素和头孢菌素残留。美国Charm Science公司Charm MRL检测法与Beta-STAR检测法形式十分相似，在8min内可以检测到青霉素和头孢菌素残留。比利时UCB Byproducts公司开发的Penzym检测法有两种形式:Penzy和PenzymS，它们的区别是培养时间和灵敏度不同，此方法适用于检测B-内酰胺类和头孢菌素类抗生素。1.5 本实验研究的目的与意义牛奶是营养最全面的营养品 。但饮用含有抗生素残留的牛奶可引起细菌耐药性， 导致人体过敏反应等症状。 经常饮用抗生素超标的牛奶还会破坏人体道菌群平衡。抗生素的影响使酸奶 、奶酪等一些高质量的牛乳产品无法加工生产，造成大量的原料奶浪费，致使企业遭受很大的经济损失。牛奶中抗生素残留问题日益受到社会各界的重视。抗生素检测的方法、 检测技术也随之迅速发展，只有简便 、快速 、准确 、灵敏性高的检测方法才能满足日趋严格的检测要求。 保障人们饮用牛奶的卫生和安全。 抗生素的检测方法很多， 主要可以分为微生物测定法、理化测定法和免疫学测定法15 等。本实验通过国标TTC法和试剂盒法、纸片法检测结果的比较为抗生素残留快速检测方法的补充提供理论依据。第二章 实验材料和方法2.1 实验材料2.1.1材料2.1.1.1采样 从哈市食品商场随即采取六个主要品牌不同品种的袋装消毒纯牛奶及其相关品牌的花色奶作为检样，将采集的样品编号，送实验室检测，乳样共计13份，见表2-1。表2-1 原材料表品种编号规格（ml）来源纯牛奶1220市售2220市售3220市售4220市售5220市售6220市售花色奶7280市售8250市售9220市售10280市售11240市售12250市售13220市售 对照试验样品的采样，见表2-2。表2-2 对照样品表对照样品编号来源脱脂乳+青霉素14脱脂乳: 东北农大食品实验室提供青霉素: 天林药业有限公司提供灭菌生理盐水+青霉素15NaCL: 天林药业有限公司提供青霉素: 天林药业有限公司提供无抗脱脂乳16市售灭菌生理盐水17市售2.1.1.2菌种嗜热乳酸链球菌，由东北农业大学乳品研究中心提供；枯草芽孢杆菌，由黑龙江东方学院微生物实验室提供。2.1.1.3主要药品与培养基（1）脱脂乳：经113、20min灭菌（2）牛肉膏蛋白胨培养基：a 牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏            3.0g蛋白胨            10.0gNaCL              5.0g水                1000mlpH                7.07.2 b 溶液或试剂：牛肉膏，蛋白胨，Nacl，琼脂，1molL NaOH，1molLHCL。c 仪器或其他用具：试管，三角瓶，烧杯，量筒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压灭菌锅，PH试纸（pH5.59.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。（3）试剂TTC指试剂：4% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）批号830222。TTC水溶液：称取1gTTC，溶于5ml灭菌蒸馏水中，装入褐色瓶内与7冰箱保存，临用时用灭菌蒸馏水以1:5稀释。如遇溶液变为绿色或淡褐色，则不能再用。2.1.2 主要仪器和设备表2-3 主要实验仪器与设备仪器与设备生产厂家Hws24型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司LRH-50生化培养箱上海一恒科技有限公司京制00000249号电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司科拓抗生素检测试剂盒北京科拓恒通生物技术开发邮箱公司容声冰箱广东科龙电器股份有限公司JJ200型精密电子天平美国双杰兄弟有限公司常熟双杰测试仪器厂高压灭菌锅上海一恒科技有限公司检测试剂盒由反应管、营养药片、取样注射器、取样吸头、镊子和使用说明书等组成。其中：检测反应管 50×2营养药片 100 片取样注射器 1支取样吸头 100支镊子 1支使用说明书 1份2.2 试验方法2.2.1 原料预处理 TTC法: 依据GB4789 27-94方法检测抗生素残留。阴性对照管为无抗生素10%还原脱脂乳粉溶液，阳性对照管为10%还原脱脂乳粉加青霉素钾盐16。纸片法: 青霉素标准液，准确称取青霉素G钾标准品20mg，用磷酸盐缓冲液溶解，制备为1 000g/mL的标准储备液，置4冰箱中保存。试剂盒法：试剂盒中的反应管和营养药片，保存于015，避光、干燥阴凉处，防止凝结成块或冻结。2.2.2 TTC法 按照国家标准中规定的TTC实验法并参考有关文献进行。2.2.2.1 灭菌脱脂乳培养基制备取12.00g脱脂乳粉配制成100ml乳液于水浴锅中煮沸30min后，置4冰箱过夜，然后弃去上层乳脂，将脱脂乳分装大试管，10磅20min灭菌备用。2.2.2.2 菌液制备将冻干保存的嗜热性乳酸链球菌接种于灭菌脱脂乳培养基中，36±1培养15h。再转接23次，以活化菌种脱脂乳培养基，经36±1培养15h后，以灭菌脱脂乳11稀释待用。2.2.2.3检验方法（1）取待检乳液9ml，置灭菌试管中，80水浴加热5 min。（2）冷却至37以下，加制备的菌液1ml，36±1水浴培养2h后，向试管内加4%TTC试剂0.3ml，36±1水浴中培养30min后取出，观察结果。（3）结果观察 乳中有抗生素存在时，加入指示剂TTC后牛乳不显色，即抗生素阳性；相反，如果没有抗生素存在，则加入TTC后显红色，即抗生素阴性。抗生素阳性者，在于水浴锅中培养30min第二次观察，记录结果。（见表2-4）表 2-4 显色状态判断标准（GB4789）显色状态判断未显色者阳性微红色者可疑桃红色红色阴性（4）每份检样作两份，同时做阴性和阳性对照各一份，阳性对照用无抗生素乳8ml加1ml青霉素溶液（0.16IUml）及菌液1ml和4%TTC试剂0.3ml。阴性对照用无抗生素乳9ml加菌液1ml和4%TTC试剂0.3ml，其他同于检样反应。操作顺序如下图：检 样80，加热5min冷却37以下加菌液，36±1水浴2h加TTC指示剂，36±1水浴30min36±1水浴30min不显色红色 色 显色者抗生素阴性报 告报 告抗生素阴性不显色者 抗生素阳性图2-1 TTC法操作顺序2.2.3试剂盒法(1)准备工作：确定被检样品和数量后，开启恒温器电源加热升温，待恒温器温度上升至64（±0.5）时，取出取样注射器、吸头和营养药片以及相应数量的反应管，进行编号标记，用注射器吸头捅破封口铝膜，准备加样。（2）添加营养药片：用镊子夹取营养药片，每个反应管各放入一片。尽量放置于基质中央。（3）被检奶样的吸取：去一支取样洗头插到取样注射器上，将塞柱缓慢抽回吸取被检奶样0.1ml，全部移入被检反应管中。（4）样品保温检测：将被检样品加入到各个反应管中后，全部插入到已达到64的恒温器样品孔内，开始计时间。（5）放映时间与判读结果：反应温度：64±0.5反应时间：2.53小时判读结果：含有被检样品的反应管固体基质颜色由紫色变为黄色者，证明无抗生素残留抗生素检验阴性（）；反应管固体基质颜色未变仍为紫色者，证明有抗生素残留抗生素检验阳性（+）。2.2.4 纸片法(1)枯草芽孢杆菌芽孢悬液的制备从新制备的斜面培养基上挑取一满环试验菌，接种到盛有150 mL牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶中，于(64±2)培养4872 h。取出培养液以5 000 r/min的转速离心15 min，倾去上清夜，将细胞悬浮于灭菌生理盐水中，再次离心。如此反复洗涤，最后把洗涤过的芽孢悬浮于30 mL灭菌生理盐水中，并于4保存，检测前测定芽孢活力。(2)鉴定平皿的制备将制备好的芽孢悬液接种到灭菌并冷却至64的青霉素培养基中，调整接种量，于(64±2)培养34 h，以青霉素阳性对照得到可见的抑菌圈为宜。把6 mL接种培养基倾入各个平皿，并于超平的平面上凝固，4贮存，5 d内使用。(3)鉴别试验(过筛试验) 用清洁、干燥的无菌镊子把纸片轻轻接触到已充分混合的牛乳表面，纸片通过毛细管作用吸附牛乳，把纸片稍稍接触样品容器内壁让多余的牛乳滴干，立刻把纸片安放在琼脂表面，轻轻压迫以很好接触。把含有0.008U/mL青霉素的对照纸片也安放在琼脂表面，各作2个滤片，标记不同的滤片位置。翻转平皿，于(64±2)，直到0.008 U/mL的对照滤片得到很好确定的抑菌圈，一般为4 h。样品纸片如有明显的抑菌圈，直径>14 mm，表示确诊有抑菌物质，为阳性，并结合青霉素酶滤片的抑菌情况来确证是否为青霉素所致(如14 mm则为阴性)。(4)确证试验温度为80，2 min加热试样，迅速冷却到室温，用清洁、干燥的无菌镊子把纸片轻轻接触已充分混合的牛乳表面，通过毛细吸管作用吸附牛乳。加青霉素酶0.05 mL于5 mL试验中混匀并用滤片浸渍，把滤片轻轻接触样品容器内壁以滴干多余牛乳，立即把各个滤片放在琼脂表面，轻轻压迫以很好接触。把含有0.008 U/mL青霉素的对照纸片也安放在琼脂表面。每个平皿放4个滤片，相互间隔90°角，记住不同性质滤片的安放位置。翻转平皿，于(64±2)培养，实验可延长培养时间至5.58 h，抑菌圈明显清晰，测定抑菌圈直径。在使用纸片法进行检测时，每个浓度作4个平皿，重复3次。第三章 结果与讨论3.1判定方法与结果3.1.1 TTC法3.1.1.1判定方法被检牛奶中如果有抗生素残留 ，则加入的嗜热链球菌受到抑制 ，因此指示剂TTC 不能被还原, 所以不显色,结果呈阳性。与此相反 ，被检牛奶中如果没有抗生素残留， 加入的嗜热链球菌则可以进行增殖，TTC被还原而显红色，呈阴性结果。3.1.1.2判定结果 表3-1 TTC法测结果品种编号显色状态判断纯牛奶1桃红色2桃红色3微粉色/4未显色5桃红色6桃红色花色奶7微粉色/8微粉色/9桃红色10桃红色11桃红色12微粉色/13桃红色阳性对照14未显色15未显色阴性对照16桃红色17桃红色注：+为阳性，-为阴性,+/-为可疑。国标TTC检测法检测结果：未显颜色的奶样有奶样4，为阳性，有抗生素存在；显微粉色的奶样有奶样3、7、8、12，为可疑对象，可能有抗生素残留显桃红色的奶样有奶样1、2、5、6、9、10、11、13，为阴性，无抗生素残留。阳性对照试验14、15结果未显色，为阳性，说明有抗生素残留。对照实验成功。阴性对照试验16、17结果桃红色，为阴性，未检出抗生素残留。对照实验成功。3.1.2 试剂盒法3.1.2.1判定方法从微孔面观察结果。绿-黄色或者黄色表示抗生素不存在（阴性），蓝-紫色表示抗生素存在（阳性）。3.1.2.2 判定结果测得结果见表3-2表3-2试剂盒法测得结果品种编号显色状态判断纯牛奶1淡黄色2紫色3黄色4紫色5紫色6紫色花色奶7淡黄色8淡紫色/9紫色10浅紫色11紫色12黄色13紫色阳性对照14紫色15深紫色阴性对照16黄色17淡黄色注：+为阳性，-为阴性,+/-为可疑。快速检测法测得的结果：显紫色的奶样有奶样2、4、5、6、9、10、11、13，为阳性，有抗生素存在；显淡紫色奶样有奶样8，为可疑奶样，可能含有抗生素残留；显黄色的奶样有奶样1、3、7、12，为阴性，无抗生素残留。样品14、15为对照实验，均显紫色，为阳性，青霉素抑制微生物生长；样品16、17为对照实验，均显黄色，为阴性，说明无抗生素。实验表明试剂盒没有问题，对照实验成功，抗生素抑制微生物生长。3.1.3纸片法3.1.3.1 判断方法 把含有青霉素的对照纸片也安放在琼脂表面，各作2个滤片，标记不同的滤片位置。翻转平皿，于(64±2)，直到对照滤片得到很好确定的抑菌圈，一般为4 h。样品纸片如有明显的抑菌圈，直径>14 mm，表示确诊有抑菌物质，为阳性，并结合青霉素滤片的抑菌情况来确证是否为青霉素所致(如14 mm则为阴性)。3.1.3.2 判定结果测得结果见表3-3表3-3 纸片法测得结果品种编号抑菌圈（mm） 判断纯牛奶10215±0.130405060花色奶70813±0.1/901013±0.1/1101201315±0.1阳性对照1415±0.11515±0.1 阴性对照160170注：+为阳性，-为阴性,+/-为可疑。纸片法测得结果：有抑菌圈的奶样有奶样2和13，大约15mm的抑菌圈，为阳性，有抗生素存在；奶样8和10有大约13mm左右的小圈,为可疑对象；其他奶样均无抑菌圈存在，为阴性说明无抗生素存在。对照奶样14、15中青霉素抑制了微生物生长所以有大约15mm的抑菌圈存在；对照奶样16、17无抗生素存在，没有抑菌圈生成，说明对照实验成功。3.2 结果统计 以上结果可以总结为下表:表 3-4 结果统计表方法阳性份数/份阴性份数/份可疑/份合计/份阳性率/%TTC法184137.7试剂盒法8411361.5纸片法2921315.4合计112173928.21由上表可以看出，被检13份样品经国标TTC法检测出1份阳性样品。阳性率为7.7%；纸片法检测可检出2份，阳性率为15.4%；快速试剂盒法检测可检出8份，阳性率为61.5%。三种方法检测结果差异显著。3.3 方法比较 3.3.1从检测时间纸片法需培养4 h以上才可见清晰明显的抑菌圈，为了得到更为密集的菌落，可延长培养时间至5.5