马铃薯茎段愈伤组织诱导及再生 毕业论文.doc

学士学位毕业设计（论文） 马铃薯茎段愈伤组织诱导及马铃薯茎段愈伤组织诱导及 再生再生 学生姓名：学生姓名： 指导教师：指导教师： 所在学院：所在学院：农学院 专专 业：业：农 学 学学 号：号：20094011302 中国·大庆 2013 年 5 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） II 马铃薯茎段愈伤组织诱导及再生马铃薯茎段愈伤组织诱导及再生 摘要摘要：马铃薯茎段愈伤组织的诱导和再生试验于 2012 在农学院马铃薯实验室进行。 以克新 13 号、早大白两个品种的马铃薯茎段为材料，研究愈伤组织的诱导及植株再 生。试验试剂：MS 培养基为基本培养基，可调节的植物激素有 6-BA 和 2,4-D。选 择苗龄合适的马铃薯无菌试管苗，切成 0.5 厘米长，不带腋芽茎段，接种于含不同浓 度细胞分裂素 6-BA 和生长素 2,4-D 的愈伤组织诱导培养基，进行诱导培养。愈伤组 织每 2 周继代 1 次。选择生长良好的愈伤组织，接种苗在含有不同浓度 6-BA，NAA 和 GA 的培养基中进行茎段愈伤组织分化培养。结果表明：克新 13 号的最佳愈伤组 织诱导培养基为 MS+2mg/L 6-BA +2 mg/L 2,4-D；早大白的最佳愈伤组织诱导培养基 为 MS+1 mg/L 6-BA+2mg/L 2,4-D。在上述最佳诱导培养基中培养，俩种愈伤组织诱 导率分别为 62.22%和 60.37%，在上述最佳分化培养基中培养，所得的分化率分别为 53.81%和 57.42%，早大白的分化率高于克新 13 号的分化率。 关键词关键词：马铃薯；愈伤诱导；再生 33 Potato Stem Section Callus Induction and Regeneration Student :Guo Yongfeng Supervising: Jiang lili 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） III Abstract: Potato stem section callus induction and regeneration of this test in 2012 in agronomy courtyard potato laboratory. To g new 13, the early two potato stem section as materials, all kinds of callus induction and regeneration. Test using reagents: MS medium as the basic medium, the movement of the adjustable plant hormones have 6 - BA, 2, 4-d. Select age of seedling and d potato sterile tube seedlings, cut into 0.5 cm long, don't take lateral bud stem section, vaccination to contain different concentration cytokinins 6 - BA and auxin 2, 4-d of callus induction medium, induction training. Callus every 2 weeks successive transfer 1 time. Select growth good callus, vaccination to contain different degrees of cytokinins 6 - BA and NAA and callus induction of GA3 in medium culture. The results showed that: g new number 13 optimum callus induction medium for MS + 1 mg/L 6 - BA + 2 mg/L 2, 4-d; The early for MS + 2 mg/L 6 - BA + 2 mg/L 2, 4-d. With the above optimum induction medium culture, all kinds of callus induction rate were 62.22% and 60.37% respectively g new, with the optimum induction medium culture, all kinds of differentiation rate were53.81% and 57.42% respectively. Key words: Potato; Callus induction; regeneration 目目 录录 摘要I ABSTRACT II 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） IV 前 言.IV 1 材料与方法1 1.1 材料1 1.2 试验设计1 1.2.1 基础苗培养1 1.2.2 培养基配制1 1.2.2.1 MS 培养基 .1 1.2.2.2 茎段愈伤组织诱导培养基1 1.2.2.3 茎段愈伤组织分化培养基2 1.2.3 茎段愈伤组织诱导 2 1.2.4 愈伤组织分化2 2 结果与分析3 2.1 不同激素配比对马铃薯愈伤组织诱导率的影响3 2.2 不同激素配比对愈伤组织分化率的影响4 2.3 不同基因型对茎段外植体再生的影响5 3 讨论6 4 结论6 参考文献7 致 谢.9 前 言 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） V 现代科学指出，植物的生长发育，器官的建成，形状的表现都受激素所调控并 且马铃薯品种繁多4，MS 培养基不能满足所有试管苗生长的需要，而要保证马铃薯 组培苗的外植体成活率，需要有尽可能多的须根和腋芽数以吸收养分和进行光合作 用5，因此选择合适的生长调节剂及其浓度以尽可能多的生成须根和腋芽，就成为保 证组培苗的外植体成活率和栽植产量的关键6。 近年来,随着组织培养技术在马铃薯育种中的广泛应用，组培技术也日趋成熟。 成功的组织培养首先依赖于良好的植物受体系统的建立，受体系统的建立则主要依 赖于植物组织培养再生环节7-8。因此，建立优化的马铃薯组织培养再生系统,是遗传 转化技术在马铃薯育种中应用的关键。而马铃薯不同基因型之间诱导再生的条件存 在较大的差异9,因此需要对特定品种,特定材料进行再生系统的筛选，以确定有针对 性的最佳培养基。 本试验以黑龙江省 2 个马铃薯主栽品种克新 13 号、早大白为试材，在组培实验 室里模拟了外界自然生态环境，选择苗龄合适的马铃薯无菌试管苗，切成 0.5 厘米长， 不带腋芽茎段，依次接种于含不同浓度的诱导培养基和分化培养基中进行诱导培养 以及再生的试验，对马铃薯的最佳再生系统进行了筛选,同时对该环节中起主导作用 的植物激素配比进行了研究，优化出了最佳激素配方, 以及优化了马铃薯主栽品种 的离体培养再生技术体系，为马铃薯主栽品种的分子改良奠定基础。 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） 1 1 1 材料材料与方法与方法 1.1 材料 供试材料为克新 13 号、早大白脱毒试管苗苗，以单芽茎段方式继代培养，由黑 龙江八一农垦大学马铃薯研究室提供。 1.21.2 试验设计试验设计 1.2.1 基础苗培养基础苗培养 选取所需品种带有 4-5 个茎节的脱毒试管苗，在无菌条件下切成单节茎段，转 接到盛有 50ml 经过高压灭菌的固体 MS 培养基的玻璃方瓶中进行培养。培养温度为 2025，每天光照 16h，光照强度 2000Lx。待试管苗长至单株约 45 个茎节时， 在同样条件下进行扩繁，为试验提供足够的、来源一致的基础苗。 1.2.2 培养基配制培养基配制 1.2.2.1 MS 培养基 在 MS 母液中添加 0.7%的琼脂和 30g/L 的蔗糖,pH 值 5.8。配制好的培养基装入 250ml 培养瓶内,瓶底直径 80mm，每瓶 50ml 封口,放入高压灭菌锅内常规灭菌,冷却 后在培养室中预培养 3-4d，无染菌现象的培养基留下备用。 1.2.2.2 茎段愈伤组织诱导培养基 在 MS 培养基基础上添加不同浓度的 6-BA 和 2,4-D，6-BA 和 2,4-D 浓度配比见 表 1-1。 表 1-1 茎段愈伤组织诱导培养基添加激素浓度配比 培养基编号6-BA浓度（mg/L）2,4-D浓度（mg/L） 10.51 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） 2 211 321 40.52 512 622 70.53 813 923 1.2.2.3 茎段愈伤组织分化培养基 在 MS 培养基基础上添加不同浓度的 6-BA 和 NAA。见表 1-2。 表 1-2 6-BA 和 NAA 浓度配比 培养基编号6-BA浓度（mg/L）NAA浓度（mg/L） 10.51 20.52 311 412 1.2.3 茎段愈伤组织诱导 在超净工作台上，取不带腋芽长 0.5 cm 左右的试管苗茎段接种于不同处理的 培养基上，每个处理 30 个茎段，每个处理 3 次重复，置于自然光照培养室培养。培 养 2 周后统计愈伤组织诱导率，筛选出最优激素组合。 1.2.4 愈伤组织分化 待愈伤组织形成后分别转接到不同处理的分化培养基上诱导芽分化，统计芽分 化率。 分化率（%）=分化芽数/总外植体数×100 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） 3 2 结果与分析 2.1 不同激素配比对马铃薯愈伤组织诱导率的影响 试验结果显示，接种愈伤组织后 4-5d，茎段两端切口处便明显膨大，7 d 后可见 到有愈伤组织出现，其后愈伤组织沿维管束向茎段中间生长，15 d 左右愈伤组织即 可长满茎段表面。由表 2-1 和表 2-2 可知，试验所使用的 9 个激素组合均能诱导克新 13 号和早大白茎段产生愈伤组织，但诱导率差别很大，克新 13 号最高可达 82.11%，最低仅 28.89%；早大白愈伤组织诱导率最高 77.17%，最低仅 26.88。克新 13 号在 MS+2mg/L 6-BA+2mg/L 2，4-D 处理中愈伤组织量最多，诱导率最高，且愈 伤组织颜色为绿色，结构致密，表面呈颗粒状，而在其他配比的培养基上所形成的 愈伤组织过于疏松，颜色较淡，长势较差，易生根或生长缓慢，数量较少，并有逐 渐白化现象。早大白在 MS+ 1mg/L6-BA+ 2 mg/L2，4-D 处理中愈伤组织量最多，诱 导率最高，外植体所形成的愈伤组织才呈哑铃形，愈伤组织颜色为绿色，质地致密， 中部和两端膨大均匀；而在其它培养基中形成愈伤时，多数出现整体或中部膨大变 粗，两端褐化，有的有生根现象。 表 2-1 6-BA 和 2,4-D 组合对克新 13 号茎段愈伤组织诱导的影响 编 号 6- BA（mg/L ） 2,4-D （mg/L） 接种 数 愈伤数诱导率 （%） 愈伤状态 10.51903134.44 鲜绿色，愈伤较大，结 构疏松 211893943.82 黄绿色愈伤，愈伤较大， 疏松 321932931.18 黄白色，愈伤较大，疏 松 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） 4 40.52905257.78 黄白色愈伤，结构致密 致密 512876473.56 绿色愈伤大，表面有些 颗粒状 622957882.11 绿色愈伤较小，表面有 颗粒状 70.53875057.47 绿色愈伤小，致密 813904550.00 黄绿色愈伤较大，较疏 松 923902628.89 绿色愈伤，有白化现象， 疏松 表 2-2 6-BA 和 2,4-D 组合对早大白茎段愈伤组织诱导的影响 编号6- BA（mg/ L） 2,4- D（mg/L ） 接种数愈伤数诱导率 （%） 颜色和形状 10.51952930.53黄白色愈伤，疏松 211913538.46黄绿色愈伤较大， 疏松 321883944.32黄绿色愈伤，愈伤 比较大 40.52865766.28绿色愈伤较小，表 面有颗粒状 512927177.17绿色愈伤小，致密 622906875.56绿色愈伤大，表面 有些颗粒状 70.53905358.89鲜绿色，愈伤较大， 疏松 813903741.11黄绿色愈伤较大， 疏松 923932526.88黄白色，愈伤较大， 疏松 2.2 不同激素配比对愈伤组织分化率的影响 选取长势良好的愈伤组织接入不同处理的分化培养基中培养。10d 左右愈伤组织 表面形成瘤状突起，约 30d 即可分化出丛生芽。由表 2-3 可以看出克新 13 的最高分 化率为 57.14%，最低仅为 13.33%，在 MS +1mg/L6-BA +1mg/L NAA 处理中的分化 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） 5 率达到最高，同时愈伤组织在 27 天便可出苗，而处理 1 中要 34 天方能出苗。由表 2-4 可以看出，早大白的最高分化率为50.59%，最低仅为 12.12%，在 MS +0.5mg/L6- BA +2mg/LNAA 处理中的分化率达到最高，同时愈伤组织在 26 天便可出苗，而处理 3 中要 31 天方能出苗，且分化率不佳。 表 2-3 6-BA 和 NAA 组合对克新 13 号出苗率的影响 表 2-4 6-BA 和 NAA 组合对早大白出苗率的影响 2.3 不同基因型对茎段外植体再生的影响 不同基因型的外植体对用于诱导愈伤组织的激素,具有不同的反应和适宜的浓度, 由表 2-5 可以看出本试验选用的两种基因型外植体克新 13 号和早大白，它们的愈伤 组织诱导率分别为 62.22%和 60.37%，差别并不大，克新 13 号略高于早大白；而在 分化率方面克新 13 号和早大白分别为 53.81%和 57.42%，早大白的分化率高于克新 13 号的分化率，这说明早大白的愈伤组织更易于分化。图 2-1 与 2-2 为克新 13 号和 早大白愈伤组织诱导及分化情况。 表 2-5 不同基因型马铃薯愈伤诱导率及分化率对比 基因型接种数愈伤数出苗数愈伤诱导率（%）分化率 （%） K1372138810162.2253.81 早大白8154149160.3757.42 编号6-BANAA愈伤数出苗天数出苗数分化率 （%） 10.51 75341013.33 20.52 86311618.60 311 91275257.14 412 80282328.75 编号6-BANAA愈伤数出苗天数出苗数出苗率 （%） 10.51 6630812.12 20.52 85264350.59 311 76311519.74 412 72272534.72 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） 6 图 2-1 克新 13 号和早大白茎段接种 3d 后的生长情况 图 2-2 克新 13 号和早大白茎段愈伤组织分化出苗 4 结论 本试验研究不同浓度的植物生长激素 6-BA、2,4-D、NAA 对马铃薯克新 13 和早 大白茎段愈伤组织的诱导及再生的培养。研究结果显示，克新 13 号的最适愈伤组织 诱导的培养基为 MS+2mg/L 6-BA +2 mg/L 2，4-D；早大白为 MS+1 mg/L 6- BA+2mg/L 2，4-D。克新 13 号最适分化培养基为 MS+1mg/L 6-BA +1mg/LNAA，早 大白最适分化培养基为 MS+0.5mg/L 6-BA +2mg/LNAA。试验选用的两种基因型马铃 薯克新 13 号和早大白均能诱导出愈伤组织，但早大白的分化率较高。 3 讨论 马铃薯的再生包括愈伤组织诱导、芽原基分化、芽的伸长3个阶段,其中芽原基的 分化时间很短10。细胞的分化状态在诱愈时即已确定，愈伤诱导和芽原基分化可能 同时进行或间隔时间很短。随着愈伤组织的增殖生长,芽原基逐步形成，随后芽原基 伸长而形成不定芽。植物激素是植物细胞、组织、器官离体培养中必不可少的物质。 黑龙江八一农垦大学毕业设计（论文） 7 再生培养基中激素的组配和浓度是影响再生成功与否的关键。 植物生长调节剂是人们利用化学方法合成并筛选出的具有植物激素生理活性的 有机化合物11，已成为植物组织培养中培养基的重要组成物质，可有效地改变试管 苗生长状态。生长素通过调控蛋白质及核酸的合成,发挥延长细胞长度,促进嫩茎生长 的作用12。不同质量浓度的对嫩梢生长作用差异显著13，质量浓度较低时能显著促 进嫩梢生长；质量浓度达到一定程度后继续增加，生长则有下降的趋势14。生长素 NAA可显著增加试管苗的生根数，使根系粗壮，利于壮苗，也利于试管苗的定植成 活率15。细胞分裂素6-BA，可促进细胞分裂与扩大，使茎增粗，诱导芽的分化，促 进侧芽萌发生长16。 参考文献参考文献 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