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第5章 溶菌酶,溶菌酶(Lysozyme) EC 3.2.1.17，又称细胞壁溶解酶(nuramidase)，可作用于微生物细胞壁的水解酶。 可以水解细菌细胞壁肽聚糖中的-1，4糖苷键 具有消化分解细菌 抑制外源微生物生长 目前已被用作研究蛋白功能、性质以及分子进化的模型 溶菌酶存在广泛,1907 年 对枯草芽孢杆菌产生的溶解因子进行了研究 1922年，弗莱明发现并命名了溶菌酶 1936年，麦耶(Meyer)等人发表了关于精制溶菌酶的报告。 1945年，奥尔德顿(Alderton)采用膨土岩吸附，从鸡卵蛋白中得到了收率高、结晶好的溶菌酶，次年又开发了直接结晶法，获得溶菌酶的结晶。 集中在基础科学的研究,对新型抗生素替代品的开发研究 溶菌酶是生物体内重要的非特异性免疫因子，具有与抗生素不同的抗菌机制，在抑杀病原体的同时不易产生抗药性 溶菌酶以其无毒、无害、无残留、抗菌谱广、活性稳定、安全性高等优良的抗菌特性，逐渐受到科研人员青睐并应用于现实生产。,分类,按来源分为 动物溶菌酶 蛋清溶菌酶 植物溶菌酶 微生物产生的溶菌酶 噬菌体产生的溶菌酶,按作用细胞壁不同分为 细菌细胞壁溶菌酶 真菌细胞壁溶菌酶,作用机制,溶菌酶具有分解细菌细胞壁中肽聚糖的作用。 细菌的细胞壁胞壁质是由N-乙酰氨基葡萄糖及-乙酰胞壁酸交替组成的多聚物,胞壁酸残基上可以连接多肽,称为肽聚糖。,N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺交替组成的聚合物,CO NH,CO NH,CO NH,CO NH,多肽,肽聚糖,N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的b1,4糖苷键,溶菌酶作用位点：,酶的活性中心： 肽键中第35位的谷氨酸和第52位的天门冬氨酸构成的活性部位,酶的基本性质,溶菌酶在酸性pH下是稳定的，此时100的加热对溶菌酶仅有很小的活性损失。 碱性条件不稳定 碱很容易破坏酶活性，当处于碱性 pH 值范围时，溶菌酶的热稳定性就很差,抑菌性质,不同来源的溶菌酶有不同的溶菌特性 不同的细菌具有不同的细胞壁结构 鸡蛋清溶菌酶 其它禽类蛋清溶菌酶 人溶菌酶和哺乳类动物溶菌酶 植物溶菌酶 微生物产生的溶菌酶 细菌噬菌体产生的溶菌酶,溶菌酶生物学功能,杀菌免疫功能 消化功能 防腐保鲜功能 Sung 等研究了溶菌酶在蛋清、碎牛肉、牛肉中的作用，发现溶菌酶作为食品添加剂能有效抑制蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和炭疽杆菌在上述食物中的繁殖,商品化的酶制剂鸡蛋清溶菌酶,鸡蛋清中约含有0.3的溶菌酶，分子量为14，000，等电点为11.1，最适溶菌温度为50，最适pH值为7。化学性质非常稳定，当pH值在1.211.3范围内剧烈变化时，其结构仍稳定不变，遇热时该酶也很稳定，在pH47的范围内，100处理lmin，仍保持原酶活性。但在碱性环境中，该酶对热稳定性较差。 一级结构由129个氨基酸残基组成的一条多肽链，其稳定性主要是4对二硫键、氢键及疏水键相互作用。 人溶菌酶的溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍,溶菌酶活力测定 称溶壁微球菌15mg ，加入pH 值6.2 0.1mol/L磷酸缓冲液2mL，研磨成匀浆，用同一缓冲液定容至 100mL，配成A450nm 为0.60.7的悬浮液，于30保温。吸取2.5mL至比色杯，加入0.1mL 酶液，测定2min内A450nm的变化（以0.1mol/L磷酸缓冲液调零点），每30S记录一次读数。 酶活力计算 1个酶活力单位（U）定义为：在本实验条件下，以每分钟光吸收值下降0.001所需的酶量。 酶活力（U/mL）=A450nm/（2min ×0.001×0.1mL）×稀释倍数 式中，A450nm为2min 内的光吸收值。,溶菌酶的应用,溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，具溶菌作用。在干燥条件下，溶菌酶可以长期在室温存放, 其纯品为白色或微黄色，呈黄色的结晶体或无定形粉末，无臭，味甜，易溶于水，易遭碱破坏，不溶于丙酮和乙醚。 溶菌酶已成为研究非常有力的工具酶；在医疗抗菌消炎；食品杀菌防腐作用，具有应用价值。,溶菌酶作为食品添加剂,在乳制品中的应用 溶菌酶在人乳中含量最高，是牛乳的3000倍，是山羊乳的1600倍，溶菌酶是婴儿生长发育必需的抗菌蛋白，可增加免疫力，特别是对早产婴儿有预防体重减轻，预防消化器官疾病，增加体重的功效。 在人工喂养或食用母乳不足的婴儿食品中添加溶菌酶是非常必要的。 牛奶人乳化,溶菌酶可以促进肠道双岐杆菌增殖，每吨牛奶加入0.050.1g溶菌酶，37保温3d，可使牛奶中双歧杆菌的含量与人奶无显著差别，从而保证婴儿肠道内双歧杆菌的良好增殖。 全世界的乳酪产业(除北美)都在使用溶菌酶，在半硬干酪中加入0.001%的溶菌酶，可防止香味物质丁酸的损失，在中期、长期熟化奶酪中，可以防止后期起泡，以及奶酪风味变化。 德国在半硬奶酪的生产中使用溶菌酶，阻止如酪梭杆菌的作用所引起的胀气。,在葡萄酒发酵过程中，主要的发酵菌是乳酸菌(LAB)和酵母菌（AF） 。如果LAB的含量过高，会产生过量的乙醇、生物胺(主要是组胺)、丙烯醛、多糖，从而对葡萄酒造成诸如高挥发酸度、苦味等感官缺陷。 采用SO2控制LAB的生长是从古至今一直沿用的传统方法。但SO2对人体产生一定的毒性。且具有非专一性抗菌活性，除抑制LAB外，还抑制酵母。,在葡萄酒发酵中应用,鸡蛋清溶菌酶只作用于LAB，对AF没有影响。在葡萄酒生产中，在葡萄原汁中加入100150µg/kg的溶菌酶对LAB的生长即刻被抑制，AF不会停滞或延缓，起预防调控作用。 在接种乳酸菌的黑比诺酒中，酒精发酵完成后的第15d，乳酸菌密度达到1×108菌落形成单位，但如果加入溶菌酶，则抑制了乳酸菌的生长。起到了保护葡萄酒作用和微生物稳定作用 萝卜溶菌酶,对葡萄酒泡沫等的影响,葡萄酒泡沫的持久性是品质的重要性质之一。加入溶菌酶后，加州葡萄酒发泡能力提高了21%，夏敦埃酒提高了3%。 溶菌酶可以提高葡萄酒泡沫的持久性。 溶菌酶还可作为料酒和葡萄酒的澄清剂，使用量为0.0050.05。 啤酒过滤除杂菌,溶菌酶作为防腐保鲜剂,在果汁、茶饮料生产上应用 常规杀菌方法处理后对其品质和风味影响很大，而溶菌酶的杀菌和其在酸性溶液中较稳定的特性，使其在解决这一问题上有很大的潜力。 在pH6.07.5的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶具有较好的防腐作用。,在糕点上的应用,特别是含奶油的糕点容易腐败，在其中加入溶菌酶可起到一定的防腐作用。,日本清酒用溶菌酶代替水杨酸防腐 清酒酒精含量为1517，大部分微生物不能存活，但火落菌的乳酸菌则能生长，并能引起产酸和产生不愉快嗅味。 过去加水杨酸作防腐剂，但水杨酸有一定的毒性，已逐渐被取消使用，目前日本已成功地使用鸡蛋蛋清溶菌酶代替水杨酸作为防腐剂，其加入量为15mgkg。,在低度酒方面的应用,在奶酪生产中，溶菌酶能抑制污染菌引起的丁酸发酵，这种特性为一般防腐剂不能达到的。 用于乳制品防腐，尤其适用于巴氏杀菌奶，能有效地延长其保存期，由于溶菌酶具有一定的耐高温性能，也适用于超高温瞬时杀菌奶。添加量为300600µg/mL，其方法为包装前加入。,在奶酪和乳制品生产中使用,用于低温肉制品的保鲜,将其添加到原料肉中可以延长低温肉制品保鲜期一倍以上。并可耐受低温加热(80左右)而不变性， 使用浓度为0.010.05。 溶菌酶、乳酸菌肽和山梨酸钾的配合性使用，经30d冷藏，各项指标均能基本保持鲜肉的商品状态，保鲜效果良好。,用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜,作为鱼丸等水产类熟制品和香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。 只要将一定浓度(通常为0.05)的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，就可起到防腐保鲜的作用。,用于新鲜海产品和水产品的保鲜,把一定浓度的溶菌酶溶液喷洒在水产品上，就可以起到防腐保鲜的效果。 虾、鱼、蛤蛎等在含甘氨酸（0.1M）、溶菌酶（0.05%）和食盐（3%）的溶液浸渍5min，沥干，5度保存9天后无异味、无色泽变化。,溶菌酶在包装工业中的应用,溶菌酶可以固定于一些包装纸上，如湿墙纸和玻璃纸上，应用于医院手术室及食品包装。 溶菌酶配制(23)的酶液，喷洒于包装纸上或将包装纸浸入酶液(23h)，取出在5060条件下烘干(酶活力基本不丧失)，用处理好的包装纸包装煮熟的大豆和新蒸的馒头，结果用溶菌酶处理过的纸包装可延长近1周的时间不变味，而用普通纸包装1d就会变味(常温下)发粘。,其他食品中的保鲜,在生面条、花生酱、色拉等食品中，加入溶菌酶均可以起到良好的防腐保鲜作用。 在应用溶菌酶作为食品防腐剂时，要注意到酶的专一性，对于酵母、霉菌和革兰氏阴性菌等引起的腐败变质，鸡蛋清溶菌酶不能起到防腐作用。萝卜溶菌酶 但溶菌酶有良好的配伍性，可与其他添加剂(如植酸、甘氨酸、聚合磷酸盐等)复配使用，可大大提高其防腐保鲜的效果。,用于制备细胞浸提物,酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分，目前大多是采用自溶法或酶解方法 用溶菌酶水解微生物细胞壁，以提取细胞内含物 用溶菌酶制备酵母膏，提高浸膏量的收率，缩短酵母膏的制备时间。 用溶菌酶从酵母细胞中制备呈味物质，有些溶菌酶中除了含有溶菌酶的活性外，还可能含有分解酵母细胞中的核酸为肌苷酸和鸟苷酸的单核酸类的呈味物质的成分。,工具酶,鸡蛋清溶菌酶处理细菌得到原生质体 因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。,问题与展望,工业上对溶菌酶制剂的需求量与日俱增 广泛发掘溶菌酶资源，同时开展溶菌酶基因的克隆与表达，获得适用于规模化生产的高产、高效、广谱的溶菌酶工程菌，开发和扩大溶菌酶的生产 成为理想的抗生素替代品 在食品、饲料、医药等领域发挥重要应用价值,