流式细胞术及其应用.ppt
常用流式细胞技术,一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在高速流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分选技术。 FCM(Flow Cytomytry 流式细胞术) FCM(Flow Cytomyter 流式细胞仪),二、流式细胞仪的工作原理 待测细胞被制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在清洁气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，鞘液的作用有二：一是约束样品使之在喷嘴中心以提高测量精度；二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞喷孔。在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟随一个地在鞘液包括下由流动室下面的喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与入射的高度聚焦的激光束相交，此时，细胞上的荧光染料被激发而产生特异性荧光。在与入射激光和液柱都垂直的方向设置有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤片、检测器等，将细胞的荧光信号变成电信号输出到计算机，用专用软件进行分析。,美国B-D公司 型号：FACSCalibur, 单激光配制 操作系统：Mac OS8.5 1999年3月购置,三、 流式细胞仪可检测到的细胞参数,1 前向角散射（FSC）：前向角散射光的强度与细胞的大小有关，也就是说，同一个细胞群体，FSC强的，其细胞大一些，而FSC弱的，其细胞小一些。 2 侧向角散射（SSC）：侧向角散射又称90°散射或大角散射。侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。,3 荧光强度（FL）：是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分开来，也就是我们通常所说的阳性细胞，也可以将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞区分开来，也就是可以把强阳性细胞和弱阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测出13个FL。,四、 流式细胞术的应用,1 细胞DNA含量检测： 细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，并通过专用的DNA分析软件，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。,肿瘤诊断： DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志，细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此，临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。,肿瘤预后估计： 异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道，在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中，异倍体和较高的S期百分比都是不良预后的标志。同样的，在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分期等指标基础上，用流式细胞仪检测肿瘤DNA倍体能更客观地预测预后。,凋亡： 由于凋亡细胞核酸内切酶活化，DNA降解，细胞DNA减少，因而可在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是凋亡峰。检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。,细胞表型的分析得益于单克隆抗体的产生及发展，现在CD系统已有247种之多。细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一般用直标法，也可用间标法。荧光探针多为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、APC等。,2 细胞表型分析：,淋巴细胞分类： CD3(T细胞，CD4、CD8)、CD19（B细胞）、CD16、CD56（NK细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。,造血干/祖细胞计数 造血干/祖细胞存在于骨髓和外周血中，形态与淋巴细胞相似，用普通形态学方法难以识别。由于造血干/祖细胞表面可表达CD34和CD45抗原且具有很高的核酸含量，因而用CD34和CD45单克隆抗体和核酸染料进行三色荧光标记，FCM多参数分析血液、骨髓和浓缩白细胞悬液中造血干/祖细胞的数量，对临床血液病、恶性肿瘤、基因异常等疾病的造血干/祖细胞移植治疗有十分重要的意义。,白血病的免疫分型 流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型时，测量细胞数一般在1000050000细胞之间，而且快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。,利用FCM可快速检测白血病细胞所表达的分化抗原，并可做多色标记分析，从而可对白血病细胞作多参数多抗原分析，使一些形态学检测上难以解决的问题迎刃而解。 例如造血干细胞表达CD34，髓系表达CD13、CD14，B细胞系表达CD10、CD19、CD20等，T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7，可以测定出血球细胞表达各种抗原的情形，协助临床鉴别诊断。,细胞系的鉴定,新建细胞系 新建立的细胞系，进行系列的表型分析，以确定此细胞系的表型。 已有细胞系的表型分析 对于已知细胞系，由于多次传代和培养条件的改变，细胞遗传信息可能会发生突变，对其进行表型分析，以检测该细胞系是否有变异。,3 血小板功能分析与血小板病诊断,原理 血小板是由骨髓巨核细胞产生的无核细胞，正常静止状态呈两面微凸的圆盘状，平均直径23m。活化的血小板呈不规则形状，表面有大量星状突起，彼此间常发生粘附、聚集。血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥功能的分子基础。,静止与活化血小板膜糖蛋白分子的种类、含量、结构、功能等显著不同，一些血小板糖蛋白的分子缺陷常导致血小板止血功能的异常，某些糖蛋白分子在血小板膜上高表达又是血小板被活化的特异性分子标志。当血小板表面结合有自身抗体时常导致血小板减少。血小板的上述变化，通过用荧光素标记的单克隆抗体结合流式细胞术，可以敏感、特异、快速的诊断血小板病。,血小板检测指标： 质膜糖蛋白：CD41/CD61（gpb/a）、 CD42b(GPb/) 颗粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。 活化：gpb/a复合物活化早期标志物 CD62P活化后期的表面标志 血小板抗体（PAIgG）。 网织血小板计数：常用染料为TO。,应用 血小板无力症诊断： CD41/CD61缺失或异常 巨大血小板综合征诊断： CD42a/CD42b缺失 免疫性血小板减少性紫癜诊断： PAIgG 血栓前状态与血栓性疾病诊断： 血小板活化异常,4 红细胞疾病诊断,网织红细胞计数与应用 网织红细胞是未完全成熟的红细胞，胞浆中仍残留有不同含量的RNA。RNA含量越高，网织红细胞越幼稚，反之，则接近于成熟红细胞。网织红细胞是反映骨髓红系造血的指针。用荧光染料噻唑橙(Thiazole Orange，TO)可使活体网织红细胞中RNA染色，用488nm激光激发后发射绿色荧光，FCM分析其荧光强度的大小可测量网织红细胞的数量和RNA含量。主要用于贫血筛查。 睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的诊断 红细胞表面CD59缺失,5 细胞内蛋白的分析：,细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期分析结合起来，分别分析蛋白阳性和蛋白阴性细胞的细胞周期，这在研究功能蛋白对周期的调控作用是非常有用的工具。,6 可溶性蛋白的检测：,为最新发展起来的用于检测可溶性蛋白的流式细胞技术(CBA)，是将待检蛋白吸附到微球上，再与荧光探针结合，测定微球上这种蛋白的荧光强度，与已知微球的荧光强度相比较，求出待测蛋白的含量，分析软件可自动给出相关方程。,7 分选：,用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，可用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般分选速度为每少钟300个细胞，而大型机分选速度可达到每秒上万个细胞，并可做到点对点分选。但分选速度也与细胞中目的细胞的百分率及细胞悬液的密度有关。,FCM的应用，概括成一句话就是 凡是能被荧光素标记的且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。,纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进，流式细胞仪的研制、革新，到今天的众多应用领域的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和物理学等学科知识综合运用的结晶。,而现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学、药物学等众多研究领域的应用将会越来越广泛。,五、流式样品的制备中应注意的几个问题,荧光素和抗体的选择 荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的荧光素，常用的荧光素有： 测细胞DNA和RNA含量：PI、7-AAD。 测细胞蛋白、抗体或抗原：FITC、PE、Per-CP、 PE-CY5、PerCP-CY5.5。 测细胞膜电位：Rh-123。 测钙离子：Fluo-3。,抗体的选择： 一定要选择商业化的流式用单克隆抗体，此类抗体在制备过程中有严格的质控，非特异荧光弱。最好用直标抗体，如果是用间标抗体，二抗的选择更应严格。,样品的准备,评价一个样品制备的优劣，可有三个评价指标，即细胞的密度，不能低于1×106/ml ； 非特异荧光，不超过1；细胞碎片和聚集体，不能出现肉眼可见的团块。,流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可信，虽然与仪器操作者的水平有很大关系，但在很大程度上取决于样品制备的优劣。细胞密度太低，影响测试速度并造成测试参数调整的困难，尤其是在做DNA分析时，由于细胞太少，势必要提高样品的流速，人为地增大了G0/G1期的CV值，影响了结果的可靠性；非特异荧光强，则造成样品结果的假阳性；聚集体增多，尤其是肉眼可见的细胞聚集体，可造成流式细胞仪进样针的阻塞，影响仪器的性能，碎片可干扰测试结果，造成结果分析的困难。,样品对照 细胞的荧光有自发荧光、非特异荧光和特异荧光，并且流式细胞术提供的阳性细胞百分比和荧光强度都是相对阴性细胞而言的，所以在样品制备中样品对照的设置至关重要。在测DNA时，要设正常细胞对照，即不做任何干预的细胞对照。在检测细胞膜CD分子和细胞内蛋白或细胞因子时，要设同型抗体对照，如果是双标记或三标记检测，还要设单标记的阳性对照。,六、流式样品的制备：,细胞DNA分析： 用本法可测定细胞周期、细胞倍体和凋亡，在样品制备中存在的问题主要是细胞的聚集和碎片，建议在固定细胞时加入1.5%-3%小牛血清。 培养的细胞系、体液中分离的有核细胞或分离的组织细胞约1×106，离心沉淀后用0.3ml 含5%-10%小牛血清的PBS悬浮，移入预先加有0.7ml无水乙醇的EP管中，置-20固定细胞24小时以上（用本法制备的细胞可在-20保存一周甚至更长的时间）。在分析肿瘤细胞的倍体时，要同时加入PBMC作为内参，PBMC与肿瘤细胞的比例为1:2）。,3000rpm离心细胞1分钟，吸弃上清，用1ml PBS重悬细胞，再离心洗涤细胞一次，吸弃上清，沉淀细胞用100l 1mg/ml RNase A悬浮，3730min以消化RNA，再加入400l 50g/ml PI，置暗处10min后上机检测。 结果分析：流式报告中可给出G0/G1、S、G2/M各期细胞的百分比、凋亡百分比和细胞倍体。,GFP/DNA双参数分析,在分析转染了绿色荧光蛋白（GFP）的细胞的细胞周期时，用GFP/DNA双标记法分析GFP表达阳性细胞的细胞周期，以观察基因表达蛋白对细胞周期的影响，是目前最好的技术方法。 方法为先用0.5%多聚甲醛预固定细胞30-60分钟，以保护GFP，防止其荧光的卒灭，再用70%乙醇固定。流式报告中可给出GFP阳性细胞和阴性细胞的细胞周期、GFP的转染效率和表达量。,胞内蛋白/DNA双参数分析,在分析胞内（胞浆或胞核）蛋白与细胞周期的关系时，也可用间接免疫萤光法先标记胞内蛋白，再用PI标记DNA。这种样品需要先用乙醇固定细胞，用破膜剂打孔，以便抗体能进入细胞内与靶蛋白结合，再用萤光二抗标记细胞。最后加入PI，上流式测试，分析方法与前述方法一样。,细胞表面CD分子检测（以小鼠脾细胞CD3、CD4、CD8为例）： 小鼠脾脏用注射器芯轻轻研磨，过200目滤网，将细胞滤于含5%小牛血清的PBS中，吸取0.1ml（约1×106）置离心管中，加入CD3-PE-CY5、CD4-FITC及CD8-PE抗体（加入量参照供应商的推荐量，一般抗体的加入量为1g /1×106/0.1ml ），室温30min。,加入细胞裂解液2ml 室温裂解RBC 15min，用PBS洗涤细胞两次，吸弃上清，沉淀用0.5ml PBS悬浮，上机检测；也可用2%多聚甲醛固定，4避光可保存至少24小时。用CD3设门法分析，流式报告中可给出CD3阳性细胞中CD4和CD8阳性细胞的百分比和荧光强度。通过流式报告计算出CD4与CD8的比值。 注意两点：建议使用流式专用的RBC裂解液。离心后上清一定要吸，不能倒，离心速度控制在3000rpm左右，1分钟即可。,细胞内细胞因子测定： 用流式细胞仪测定细胞内细胞因子是当前流式细胞术中一种较新的技术。在免疫反应中，细胞因子担当了重要的角色。几乎所有的细胞因子均可由各种不同类型的细胞在体外产生。但利用生物测定技术、酶标法或PCR技术不能回答某一特定的细胞因子在体内究竟是由哪种细胞产生的，即使将细胞分离制备出来，由于存在污染其它细胞的可能性，结果仍然缺乏可靠性。,理想的测定技术应使细胞因子的检测能在可区分其表型的单细胞中进行，胞内细胞因子染色和流式细胞术则可满足这些要求。即流式细胞术可同时回答某种细胞因子是来源于哪种细胞表型阳性的细胞。 样品制备：体外刺激诱导细胞使其产生细胞因子；刺激同时加入Monensin（莫能菌素）以中断胞内细胞因子的运输，使新合成的细胞因子聚积在高尔基体。固定细胞；加入打孔剂使在细胞膜上造成许多小孔（打孔），从而使大分子的细胞因子抗体能透过膜；荧光标记。 常用打孔剂有Saponin、Triton-X 100。,4. 胞内蛋白的测定 收集细胞（如果是含有红细胞的有核细胞，则用裂解液去除红细胞），用含510%的牛血清PBS悬浮，终浓度为70的乙醇固定，固定后洗去酒精，沉淀细胞用0.2 Triton-x 100破膜15min，加入一抗（一定要加饱和量）室温30分钟，离心洗涤两次，洗去未结合的一抗，再加入二抗，室温30min，洗涤二次，重悬于0.5m l PBS中上机测试。要设不加一抗但要加同型抗体的阴性对照。也可以不必固定。用这种方法可测周期蛋白、凋亡蛋白、基因表达产物等。,5. 线粒体跨膜电位测定： Rh-123是线粒体的特异性染料，细胞被染料染色后，可测出细胞的荧光强度，其荧光强度的强弱与线粒体跨膜电位的高低有关，可间接反映出细胞的功能。其方法如下：,取1×106细胞用PBS洗一次，再用1ml PBS悬浮，加入2.5mM Rh-123 2l，使其终浓度为5M，室温作用30min，作用毕，用PBS洗细胞二次，0.5ml PBS重悬细胞，上机测试。由于凋亡和死亡细胞线粒体受损，荧光较弱，而功能正常的细胞荧光较强。在流式报告中的直方图中可出现两个峰或一个峰。 Rh-123的另一个用途是用于研究肿瘤细胞的耐药。,6.细胞内钙离子测定 以RPMI1640培养基配成浓度大约为1×106/ml的细胞悬液，每ml细胞悬液中加入终浓度为15mol/ml Fluo-3/AM，充分混匀，室温避光作用60分钟。以HEPES缓冲的Hanks平衡盐溶液（含10 mmol/L HEPES，pH7.4)洗三次，重悬于0.5ml同样的溶液，上流式细胞仪检测。报告中可给出样品的荧光强度。再根据荧光强度计算出细胞内钙离子的浓度。,细胞内钙离子浓度计算公式： Ca2+=Kd(FFmin)/(FmaxF) Kd为所用染料与Ca2+的解离常数：Kd (Fluo-3): 400nmol/L, Fmax为细胞内Ca2+饱和时所测得的荧光强度， Fmin为Fluo-3未与Ca2+结合时所测得的荧光强度，F为样品的荧光强度。,7. 网织红细胞检测 取肝素化静脉血2.5l，加入0.5ml Retic-COUNT试剂中，同时设PBS的阴性对照，室温30分钟后上流式细胞仪测试，报告中会给出网织红细胞百分比和荧光强度。样品的网织红细胞百分比为阳性管与阴性管的百分比之差。,8. 活性氧物质(ROS) 的测定 2 ,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA) 是一种非荧光性小分子探针，可扩散到细胞中并去酯化，通过氧化作用转变成高荧光性的2 , 7-二氯荧光素（DCF)，因此可用于定量胞内ROS。将细胞孵育于5mol/ L 的DCFH-DA/ PBS溶液中，37 保温15 min ，FCM检测。DCF萤光的强弱则反映了细胞ROS 的高低。,七、常用荧光探针组合,1.细胞表型分析 双色分析：FITC与PE 三色分析：双色分析+PE-CY5或 PerCP-CY5.5。 四色分析：三色分析+APC或CY5。 2.胞内蛋白与周期的关系分析 蛋白标记：FITC或GFP，DNA标记：PI 3.凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC，坏死用PI，或细胞标志物用FITC，凋亡用Annexin-PE，坏死用7-AAD。,八、如何看流式报告,流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。 几个概念： %Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。 Mean：平均荧光强度，与被检测物质的含量有关，在正态分布时一般用该值。 Geo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。,Date acquired: 12-Apr-05 File: BM normal 1M.001 DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 77.99 % at 47.06 Dip G2-M: 3.81 % at 94.13 Dip S: 18.20 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 4.61,流式细胞术分析细胞周期,Date acquired: 08-Mar-05 File: NC DIPLOID: 25.29 % Dip G0-G1: 77.58 % at 38.10 Dip G2-M: 5.43 % at 76.20 Dip S: 16.99 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 3.99 ANEUPLOID 1: 74.71 % An1 G0-G1: 81.84 % at 45.11 An1 G2-M: 3.70 % at 89.44 An1 S: 14.45 % G2/G1: 1.98 An1 %CV: 4.83 An1 DI: 1.18 Total S-Phase: 15.09 %,Date acquired: 15-Mar-05 File: BEP2 D 4Gy 12h DIPLOID: 50.99 % Dip G0-G1: 45.50 % at 42.39 Dip G2-M: 1.71 % at 84.77 Dip S: 52.78 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 4.21 ANEUPLOID 1: 49.01 % An1 G0-G1: 79.67 % at 82.26 An1 G2-M: 8.67 % at 158.09 An1 S: 11.67 % G2/G1: 1.92 An1 %CV: 3.64 An1 DI: 1.94 Total S-Phase: 32.63 %,Date acquired: 19-Apr-05 File: 7402 0uM DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 65.70 % at 50.33 Dip G2-M: 8.37 % at 96.54 Dip S: 25.93 % G2/G1: 1.92 Dip %CV: 4.51 Apoptosis: 0.09 % Mean: 27.06,Date acquired: 19-Apr-05 File: 7402 40uM DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 42.73 % at 49.76 Dip G2-M: 33.15 % at 98.17 Dip S: 24.12 % G2/G1: 1.97 Dip %CV: 4.22 Apoptosis: 35.07 % Mean: 33.48,PI单染法测细胞凋亡（亚二倍体峰）,G0-G1: 25.42 % G2-M: 48.02 % S: 26.56 %,G0-G1: 48.78 % G2-M: 9.72 % S: 41.50 %,G0-G1: 47.86 % G2-M: 10.77 % S: 41.37 %,EGFP/DNA双参数分析基因表达蛋白对细胞周期的影响,图 p21/WAF1/CIP1-EGFP对293细胞细胞周期的影响,图 单标记分析骨髓中CD34细胞含量,胞内细胞因子检测,FCM检测胞内钙离子、线粒体功能,细胞活性氧 分析,
