电泳.ppt
电泳,电泳:带电粒子在电场中的定向移动,原理 :有效长度 :实际电压,原理,V:泳动速度cm/秒or分(秒-1,分-1) d:泳动距离cm/电泳时间t(秒,分) E:电场强度 伏特/cm u:泳动率or泳动度(cm/伏· 秒or分) U:电压/支持场的长度 (有效长度) U:常压(100500v) 高压(50010000v) 仅需几分钟,影响u的因素,某一带电粒子的u只取决于带电质点的性质(内因) 1 净电荷 2 质点大小 3 质点形状 影响u的外因 1 V ( U/L) 2 缓冲液的PH (PH恒定) 3 I离子强度 I = 最适:0.020.2 4 电渗:液体对固体支持物的相对移动,聚丙烯酰胺凝胶电泳,支持物:单体丙稀酰胺(Acr) 交联剂:甲叉(or亚甲)双丙稀酰胺Bis 聚合 1光聚合:核黄素为催化剂(阳光,日光) 制大孔胶 2化学聚合: 过硫酸铵(NH4)2S2O3 APS (引发剂) N,N,N,N,-四甲基乙二胺 TEMED (加速剂) 制小孔胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶网孔大小: 聚合链长度:由Acr浓度 交联程度:由Acr与Bis相对比例 Bis的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与Bis的浓度比 如: Acr Bis T(%) 小孔 28.0g 0.735g 7% 大孔 10.0g 2.5g 2.5%,聚丙烯酰胺凝胶电泳(圆盘式)PAG 分离血清Pr,(一)不连续性 1 凝胶孔径大小不同 单体浓度 交联度 大孔胶:T=3% C=20% 小孔胶:T=7% C=2.5%,2 缓冲液离子成份的不连续性 大孔胶 PH=6.7 先行离子 存在于凝胶层中任何PH值下 随后离子 存在于电极缓冲液中 PI=6.0 pK1=2.34 pK2=9.70 在 PH=6.7时,只有小部分解离为,配对离子Tris Pr分子在PH6.7时以Pr-形式存在 m:迁移率 :解离度,3 PH的不连续性 PH 大孔(浓缩)胶 6.7 小孔(分离)胶 8.9 缓冲液 8.3,(二)不连续性可控制Gly的解离度,从而控制有效迁移率 1.在大孔胶中,要求Gly的有效迁移率低于所有Pr,经计算PH=6.7 2.在小孔胶中,要求Gly超过所有Pr.Pr留在后面进行普通的电泳与分子筛分离分成多个区带.(此PH实测为9.5) 在 前,(三)三种物理效率使样品分离效果好,分辨率高。 1一般电泳分离的电荷效应. 带电多,MW小, 迁移快 2不连续系统对样品的浓缩效应 迁移率: 被压成薄层 3. 凝胶对样品分子的筛选效应,等电聚焦(Isoelectro focusing IEF or EF),原理: Pr为两性电解质,不同Pr其aa的数量,种类及占比例不同,因此PI不同,PI范围窄且净电荷为零,因此依PI分离Pr. EF是在凝胶中加两性载体电解质,通直流电后,可形成从阳极到阴极逐步增加的PH梯度(连续的,稳定的,线性的PH),原理,当Pr在电场中迁移到它的PI时,由于净电荷为零,不再移动. 如扩散,附近的凝胶会使其荷电,阳,阴极会重新吸引它回到PI位置.因此Pr只能在PI位置被浓缩成窄,稳定的带.称这种浓缩效应为聚焦. 只要凝胶中的PH梯度范围足够窄,便可将PI相近的Pr分开,EF是电泳技术中分辨率最高的技术.,等电聚焦方法(是EF的关键),1载体两性电解质CA 分辨率0.01PH 2 固相PH梯度(1975年)IPG 以具弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物 CH2CHCONHR R=COOH R=4级氨基 R为弱酸or弱碱,形成缓冲体系,等电聚焦方法(是EF的关键),分辨率达0.001PH PH梯度范围最窄可为0.01PH/cm CAIEF是两性分子,在凝胶聚合时形成两性分子在电场中,CA迁移到自己的PI而形成PH梯度.,双向凝胶电泳,1.直径1mm毛细管,进行等电聚焦电泳 2.取出胶条 3.胶条放于 垂直板凝胶顶部 水平板凝胶一端 4.进行SDS-PAGE电泳 以Pr的PI与MW两种特征分离,分离效率高,可将数千个Pr分开. 图示,毛细管电泳原理,1.毛细管壁以玻璃.硅酸为主要成份 所以管壁带一定负电荷 2.管壁吸附溶液的阳离子(含H2O的正极端) 形成双电层 3.形成电渗:电场高压下,双电层水合阳离子引起流体(加毛细张力)整体向负极移动.,4.样品中不同组份受到的作用力有差别: 阳离子与电场力与电渗流同向,最快; 阴离子受方向相反的两种力作用,电渗流力大于电场力,移向负极最慢, 不带电样品受电渗流作用,移向正极(无电场力作用) 阴离子中性分子阳离子,毛细管电泳(ACE) Analytical Capillary Electrophoresis,高效毛细管电泳(HPCE) 特点: 1.可分离各种成份(带电与不带电) 2.电渗成为有效驱动力(普通电泳中为破坏力) 3.高速度分力能力:各种制品均可在330内高速分离(45内,分离15种糖),ACE特点,4.高分辨力:分辩力大于106理论段/m.最小监测量:10-6M . 如脱酰胺作用 5.质量感度:应用激光诱发荧光的检测器,可检测aM水平(10-18,PM:10-12 fM:10-15) 6.用样量: L 实际上是 n L 7.自动化程度:自动加样,自动交换缓冲液,自动分离,自动数据处理.,ACE特点,8.适用范围广: aa衍生物 肽,Pr 核酸,药物.病毒 水溶维生素 糖类衍生物 9.检测: 紫外/可见光 荧光 电化学 激光 同位素,SDSPAGE原理,Pr溶液中 加巯基乙醇 加SDS,打开氢键与疏水键 复合物 1.4g ： 1g 加入SDS为SO4-2改变了Pr的荷电性质.,SDSPAGE,各种SDS-Pr均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原Pr，消除了不同Pr荷电差异。 加入SDS,改变了Pr的构象，SDS-Pr为长椭圆棒，各种短轴约为1.8nm. 长轴:Mr,均呈正比例,所以 常数 斜率 迁移率,SDSPAGE,相对迁移率 mR=样品迁移距离cm/染料迁移距离cm 标准曲线:,
