电泳技术.ppt

电泳技术,第一节 前言,首次应用于生物学,首次称为电泳,一、电 泳 历 史,1809年，俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验。 显示了电渗透现象，为电泳理论和技术的发展奠定了基础。,电泳前,电泳后：阳极粘土颗粒上移，浑浊 阴极清澈，水面上升,Tiselius 电泳槽（C）和电极（V1和V2）,Tiselius和移动界面电泳,获诺贝尔奖，证明了血清是由白蛋白、 、球蛋白组成的。,移动界面电泳使解决生理学和 医学问题达到了一个新水平！,电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。,例如蛋白质具有两性电离性质，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷， 在电场中向正极移动，反之则带正电荷，向负极移动。 当蛋白质溶液pH值与蛋白质的等电点相等，静电荷为零时则不移动。,二、电泳的分类 （一）按分离的原理区分： 电泳按分离的原理可分为4种，即 区带电泳(zone EP，ZEP)、 移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、 等速电泳(isotachophoresis，ITP) 等电聚焦(isoelectric cusing，IEF)。,1、区带电泳 不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出个个互相分离的峰 2、移界电泳 它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形。 3、等速电泳 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。 4、等电聚焦 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。,（二）按有无固体支持物区分,根据电泳是在溶液中进行还是在固体支持物上进行，又可以分为自由电泳和支持物电泳两大类。 自由电泳又可分为： 显微镜电泳(也称细胞电泳) ； 移界电泳； 柱电泳； 自由流动幕电泳； 等速电泳；,按有无固体支持物区分又可以分为: 自由电泳和支持物电泳两大类,凝胶电泳,五十年代后，才开始固体介质电泳,使电泳技术得到了更快的发展,总之，各种电泳技术具有以下特点： 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析； 样品用量极少； 设备简单； 可在常温进行； 操作简便省时； 分辨率高。,一、Tiselius移界电泳法 Tiselius的移界电泳法具有重要的历史意义，它的成功在于巧妙地解决了几个问题： 能够形成清晰的起始界面； 靠密度梯度能够稳定界面； 能良好的散热； 在泳动过程中可用光学方法显示其组分。,第二节 常用的电泳技术,二、区带电泳,1、滤纸及醋酸纤维素薄膜电泳 它具有简单快速等优点： 电泳区带界限清晰； 通电时间较短(20min至1 h)； 对各种蛋白质基本无吸附，因此无拖尾现象； 不吸附染料，显示电泳区带背景干净。,2、高压电泳 高压电泳适用于分离低分子物质，如氨基酸、肽、抗生素及其他有机和无机物。 因为低分子物质易扩散，高电压可使其移动快，在短时间内达到分离，减少扩散的影响。,3、连续电泳 用一张垂直悬挂的滤纸作支持物，由上方连续加样， 缓冲液连续由上方流下来，电极加在左右两方，电场方向与液流方向垂直。 分离的成分由下方分别以试管收集,4、凝胶电泳,（1）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D半乳糖和3、6脱水L半乳糖结合的链状多糖,相关知识： 影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素 迁移速率由DNA的分子大小 琼脂糖浓度 DNA的构象 所加电压 电场方向 碱基组成与温度 嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成等许多参数确定。,琼脂糖凝胶电泳装置,实验步骤,制 胶,90以上熔化，凝胶温度35-43 ,EB,1、孔深 2、预留尺寸 3、梳子宽度 1+2= 胶的厚度,3,加缓冲液,拔梳子,最好在电泳槽中,点 样,-,+,电 泳,紫外,电泳结果分析,DNA空间结构 电压 EB,脉冲电场（PFGE） 解决大分子DNA电泳问题,（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳： 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 WeintraubL建立。 1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。 由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。,几个原理及名词：,凝胶原理,SDS作用与变性、非变性,连续与不连续,缓冲液,样品缓冲液,凝胶缓冲液,电泳缓冲液,1xSDS : 50 mmol/L Tris-Hcl(PH6.8) 100 mmol/L DTT 2% SDS 0.1% 溴酚蓝 10% 甘油,Tris 碱 用盐酸一次调PH成功 0.1% SDS,1xTris 甘氨酸 : 25 mmol/L Tris 250 mmol/L 甘氨酸 (PH8.3) 0.1 % SDS,主要试剂及相关问题：,1、Acr 和 Bis 比例 29：1 ，此时分辨率最佳 ，凝胶成透明；Bis多硬无弹性。 避光室温保存，隔几个月重配。神经毒！,2、SDS 电泳级 10%母液，室温储备。 刺激呼吸系统！,3、分离胶、浓缩胶的Tris 缓冲液 PH 6.8 PH 8.8,主要试剂及相关问题：,4、TEMED (四甲基乙二胺) 通过催化过硫酸铵形成自由基，加速Acr Bis 聚合。低PH聚合反应受到抑制。 吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有明火！,5、过硫酸铵 提供引发聚合反应的自由基。10% 4保存， 每周新配！,6、Tris-Gly Buffer 安全！,凝胶浓度及其分离范围,SDS-PAGE 电泳装置,实验步骤,安装玻璃板,灌注分离胶,加水膜,约30min 后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体,灌注浓缩胶,灌满！,根据需要插入不同的梳子,30min左右加电泳缓冲液，再拔梳子！,拔梳子后形成点样孔,孔周围有膜，用针拨开,点样，电泳,-,+,蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法。,染 色,染色液配制： 0.1% 考马斯亮蓝R250 (先用甲醇充分溶解) 50% 甲醇 10% 冰乙酸 40% 蒸馏水 滤纸过滤,脱色液配制： 10% 甲醇 10% 冰乙酸 80% 蒸馏水,5倍体积染色4小时以上， 脱色摇床，中间更换几次脱色液,硝酸银染色,银染的机制:来源于摄影银染技术,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。 优点:检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高50-100倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而且所需的上样量较少(每点仅需0.1)。 缺点:可重复性差 耗费人力 质谱测定有一定的干扰,染色方法,化学显色,光显色,双胺染色,非双胺 染色,是利用氨水同硝酸银进行反应产生银-双胺络合物,将固定后的凝胶浸泡其中,再通过酸化使其显色,是将固定好的凝胶浸泡于酸性的硝酸银中,在硝酸银和蛋白质发生作用后在碱性条件下,用甲醛还原使其显色。,是使用光能还原银离子成金属银。因为光能够在酸性PH还原银,所以一旦凝胶被固定,光显色能使用单一染色溶液,而不像化学染色程序那样通常需要两种溶液。,硝酸银染色,聚丙烯酰胺凝胶的主要优点： 分辨率高。具有三种效应：浓缩效应，分子筛效应，电荷效应；长度仅仅相差0.2(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开 所能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶； 从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。 可根据被分离物质的分子大小控制凝胶浓度制成不同孔径的凝胶。 丙烯酰胺较稳定，无色透明，机械强度好，易观察，可用检测仪直接测定。,凝胶干燥技术 凝胶扫描技术借助薄层扫描仪对电泳图谱扫描，以迁移率为横坐标，以吸光度为纵坐标，将电泳条带转换成峰图。 凝胶成像技术通过图像采集和图像分析，利用计算机程序自动识别图中所有可能条带。 凝胶印渍转移技术Southern Blot，Northern Blot，Western Blot,5.电泳相关技术,A:GIS暗箱 B:高分辨率数码相机 C:安全门锁 D:GIS暗箱控制面板 E:PC机控制 F:紫外或白光投射仪 G:GIS 1D分析软件 H:数码热升华图片打印机,